原發(fā)性高血壓（EH）是一種以血壓升高為主要臨床表現(xiàn)而病因尚不明確的疾病。調(diào)查發(fā)現(xiàn)全球有超過11.3億高血壓患者，預(yù)計(jì)到2025年底，全球?qū)⒂?5.6億人患有高血壓。2020年我國發(fā)布的《中國居民營養(yǎng)與慢性病狀況報(bào)告（2020年）》數(shù)據(jù)顯示，成年人高血壓患病率為27.5%，總?cè)藬?shù)高達(dá)3億。因此，高血壓仍然是全球主要的公共衛(wèi)生問題。

腎臟作為調(diào)節(jié)血壓的重要器官，是EH靶器官損害的主要器官。EH引起的腎損傷主要包括腎纖維化、腎小管肥厚和腎小球的改變。研究表明，上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）在高血壓誘導(dǎo)的腎纖維化發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。EMT在胚胎組織和器官分化過程中首次被發(fā)現(xiàn)，是傷口愈合、癌癥和纖維化的關(guān)鍵過程，但在高血壓腎病中EMT的作用機(jī)制仍不清楚。近年來，越來越多的證據(jù)表明免疫系統(tǒng)參與高血壓的病理生理過程以及終末器官的損傷，細(xì)胞因子對高血壓炎癥反應(yīng)的影響也一直是研究的熱點(diǎn)。IL-17A作為一種促炎因子，主要由Th17細(xì)胞極化產(chǎn)生。研究發(fā)現(xiàn)，在高血壓患者血漿中IL-17A的水平升高，并且在高血壓動(dòng)物模型誘導(dǎo)的腎損傷中IL-17A的表達(dá)亦顯著升高。但對IL-17A是否參與高血壓腎EMT及相關(guān)機(jī)制暫未發(fā)現(xiàn)相關(guān)報(bào)道。因此，本研究采用國際公認(rèn)的最接近人類EH的動(dòng)物模型自發(fā)性高血壓大鼠（SHR），初步探究IL-17A在SHR大鼠腎EMT中的作用，為免疫干預(yù)治療高血壓腎損傷提供初步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

(2)產(chǎn)品組合，提高性價(jià)比。采用“民宿+”的模式，將住宿與其他旅游產(chǎn)品組合銷售，提升民宿綜合性能和性價(jià)比。對于以休閑娛樂出行的散客，對廬山當(dāng)?shù)靥厣朗场⒈就撂禺a(chǎn)商品等會(huì)更感興趣，民宿經(jīng)營者可以推出“民宿+購物”，經(jīng)營者根據(jù)入住游客不同的口味偏好，進(jìn)行個(gè)性化推薦，或是根據(jù)游客對特產(chǎn)的不同需求，引導(dǎo)游客進(jìn)行相關(guān)產(chǎn)品的購買。針對團(tuán)隊(duì)出行或是商務(wù)休閑的游客，可能會(huì)有對于小型聚會(huì)場所或是活動(dòng)項(xiàng)目的需求，可以推出“民宿+游樂”，提供廬山云霧茶采摘項(xiàng)目或是農(nóng)家野炊、燒烤項(xiàng)目，不僅能帶給游客特色體驗(yàn)，在游客進(jìn)行綜合消費(fèi)的過程中，還能讓他們感受到廬山民宿的高性價(jià)比。

3.1在總調(diào)查人數(shù)中調(diào)查數(shù)據(jù)表明:有獻(xiàn)血經(jīng)歷的人數(shù)僅占總調(diào)查人數(shù)的4.7%;其中從年齡段顯示,≥18歲~30歲的2.2%、31~40歲占1.8%、41~50歲占0.7%、50以上的為0。從文化程度顯示,小學(xué)及以下文化程度的占1.9%、初中及以上的占2.8%;對無償獻(xiàn)血知識(shí)知曉率為25.3%;知道定期獻(xiàn)血可以促進(jìn)新陳代謝、降低血脂、對健康有利的等好處的占8.5%;認(rèn)為獻(xiàn)血對身體無影響為14.1%;了解血液知識(shí)的為8.8%;對無償獻(xiàn)血相關(guān)政策有初步了解的為7.7%。

1 材料和方法

1.1 主要材料與試劑

PE標(biāo)記的抗大鼠IL-17A單克隆抗體、FITC標(biāo)記的抗大鼠CD4單克隆抗體及相應(yīng)同型對照抗體、抗大鼠IL-17A單克隆抗體（eBioscience）、E-cadherin多克隆抗體（BOSTER）、α-SMA單克隆抗體（CST）、iNOS多克隆抗體（BOSTER）、Arg-1單克隆抗體（ABclonal）；抗兔/鼠通用型免疫組化試劑盒（上?；蚩萍迹荒孓D(zhuǎn)錄試劑盒（Thermo Scientific）；Trizol試劑（上海生工）；大鼠IL-17AELISA試劑盒（eBioscience）。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 4 周齡SPF 級(jí)雄性WKY 大鼠（對照組）、SHR大鼠（實(shí)驗(yàn)組）各20只，購自北京維通利華公司，動(dòng)物許可證號(hào)為SCXK（京）2016-0006；按簡單隨機(jī)法將兩種大鼠各分為4組，每組5只，分別在4、6、10、30周齡（相當(dāng)于EH的0期、初始期、形成期、靶器官損害期）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)觀察。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用和管理均經(jīng)安徽理工大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（編號(hào)：2021019）。

前一觀點(diǎn)把電機(jī)視為電路元件，對于定、轉(zhuǎn)子上各有一套繞組的隱極電機(jī)，兩繞組軸線之間的交角θm是隨時(shí)間變化的。對磁鏈通過電流和電感表示，定、轉(zhuǎn)子繞組之間的互感為Lsrcosθme，(θme=pθm是電角度)，由磁共能對θm求偏導(dǎo)數(shù)，可得電磁轉(zhuǎn)矩

1.2.3 大鼠脾淋巴細(xì)胞IL-17A表達(dá)檢測 無菌環(huán)境下取各期大鼠脾臟，將脾臟置于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中。用眼科剪將脾臟包膜剪破后用研磨棒在300目不銹鋼濾網(wǎng)上將脾臟研磨成細(xì)胞勻漿，然后通過靜置、離心、破紅、洗滌、再次離心、重懸等步驟制備脾淋巴細(xì)胞懸液。每個(gè)流式管內(nèi)加入大鼠脾淋巴細(xì)胞1×10（經(jīng)PMA預(yù)先刺激4 h），流式管中加入FITC標(biāo)記的抗大鼠CD4單克隆抗體（0.5 μL/管）及PE標(biāo)記的抗大鼠IL-17A單克隆抗體（1.0 μL/管），并設(shè)置同型對照。加入固定/破膜工作液1 mL，旋渦震蕩，重懸細(xì)胞，4 ℃避光孵育30 min。1200 r/min×5 min，洗2次，重懸細(xì)胞，經(jīng)流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞各種熒光強(qiáng)度，用CellQuest軟件進(jìn)行分析。

1.2.4 大鼠腎臟IL-17A、iNOS、Arg-1、E-cadherin、α-SMA mRNA的表達(dá) 取各期大鼠左腎組織，每次取約50 mg 用Trizol法提取腎臟總RNA，其余放-80 ℃冰箱備用。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將提取的總RNA于20μL反應(yīng)體系中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA。PCR體系為Taq PCR Master Mix 12.5μL、上游引物1μL、下游引物1 μL、cDNA 模板2 μL、加水至25 μL，以GAPDH mRNA作為內(nèi)參。引物設(shè)計(jì)與合成：在基因數(shù)據(jù)庫中檢索目的基因序列，采用Primer 6.0軟件設(shè)計(jì)引物（表1）。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，54.2 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)34次，72 ℃終末延伸10 min。PCR 產(chǎn)物應(yīng)用Gel-Pro Analyzer分析系統(tǒng)測量相對表達(dá)量。

1.2.2 血壓測量 使用BP-6A型全自動(dòng)無創(chuàng)血壓測量儀于清晨8點(diǎn)在大鼠安靜狀態(tài)時(shí)測量尾動(dòng)脈收縮壓，每只大鼠測量3次，每次間隔5 min，取3次平均值作為該大鼠的收縮壓值。

ELISA結(jié)果顯示，SHR組IL-17A血漿表達(dá)水平在6、10、30周齡時(shí)顯著高于WKY組，兩者差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05或＜0.01，圖5）。

流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示SHR大鼠脾淋巴細(xì)胞中Th17細(xì)胞的頻數(shù)逐漸增加，在6、10、30周齡均顯著高于WKY組，兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05或＜0.01，圖2）。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本檢驗(yàn)，若方差不齊采用檢驗(yàn)；兩變量間的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)性分析。若＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠血壓的變化

③Antonio Capobianco and Hans Christiansen，Competitive Neutrality and State－Owned Enterprises:Challenges and Policy Option，p．11，OECD Publishing，2011．

IL-17A在10、30周齡時(shí)SHR組顯著高于WKY組（＜0.05或＜0.01）；iNOS在6、10周齡時(shí)SHR組顯著高于WKY組（＜0.05或＜0.01）；而Arg-1在30周齡時(shí)SHR組顯著高于WKY組（＜0.01）。E-cadherin在4、6、10周齡時(shí)WKY組與SHR組均升高，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而在30周齡時(shí)SHR組顯著低于WKY組，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.01）；α-SMA在10、30周齡時(shí)SHR組顯著高于WKY組（＜0.05或＜0.01，圖4）。

2.2 大鼠脾淋巴細(xì)胞中Th17細(xì)胞的頻數(shù)變化

1.2.6 大鼠血漿中IL-17A的水平 收集各期大鼠血漿，按ELISA試劑盒說明書測定收集好的血漿中IL-17A的水平。按照每塊酶標(biāo)板上的標(biāo)準(zhǔn)品的A450值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算血漿中IL-17A的含量。

2.3 大鼠腎臟中IL-17A、iNOS、Arg-1、E-cadherin、α-SMAmRNA的表達(dá)

IL-17A在6、10、30周齡時(shí)SHR組顯著高于WKY組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05或＜0.01）。M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物iNOS 在6、10 周齡時(shí)SHR 組顯著高于WKY組（＜0.05或＜0.01）；而M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物Arg-1在30周齡時(shí)SHR組顯著高于WKY組（＜0.01）。上皮標(biāo)志物E-cadherin在4、6、10周齡時(shí)WKY組、SHR組的表達(dá)均上調(diào)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而在30周齡時(shí)SHR組的表達(dá)水平顯著低于同期WKY組（＜0.01）；間充質(zhì)標(biāo)志物α-SMA 在10、30 周齡時(shí)SHR 組顯著高于WKY組（＜0.05或＜0.01，圖3）。

2.4 大鼠腎臟中IL-17A、iNOS、Arg-1、E-cadherin、α-SMA蛋白的表達(dá)

段主任幾乎將聽診器往我前胸一搭，便一口斷定說，是我的氣管堵了。接過C T片一看，便更加確定了。遲疑地問：在當(dāng)?shù)蒯t(yī)院看過病嗎？我說：看過。段主任問：拍過C T嗎？我說：拍過。老婆見問，連忙把在家拍的C T片遞過去。段主任看過，指著片上一小片陰影兒說：看見沒，你氣管里這東西長了。

血壓測量結(jié)果顯示，在大鼠6、10、30周齡時(shí)，SHR組的收縮壓顯著高于對照組（＜0.05或＜0.01，圖1）。

2.5 血漿中IL-17A的水平

1.2.5 大鼠腎臟IL-17A、iNOS、Arg-1、E-cadherin、α-SMA蛋白的表達(dá) 取各期大鼠右腎組織用10%甲醛液固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋3μm厚連續(xù)切片，應(yīng)用二步法免疫組織化學(xué)法對上述切片進(jìn)行染色。陽性判定標(biāo)準(zhǔn)為境界清晰，突出于背景的棕黃色或棕褐色顆粒。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)不同的視野，采用Image Pro Plus6.0圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析。

2.6 IL-17A與大鼠腎臟中E-cadherin、α-SMA的相關(guān)性分析

隨著病程時(shí)間的延長，從10周齡至30周齡SHR組大鼠腎臟中IL-17A mRNA 及蛋白表達(dá)水平與Ecadherin mRNA及蛋白表達(dá)水平呈顯著負(fù)相關(guān)（相關(guān)系數(shù)=-0.731，＜0.05；=-0.827，＜0.01）；與α-SMA mRNA 及蛋白表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)（相關(guān)系數(shù)=0.658，＜0.05；=0.968，＜0.01，圖6）。WKY組IL-17A表達(dá)水平與大鼠腎臟中E-cadherin、α-SMA的表達(dá)水平則皆無相關(guān)性。

Kinect最早是應(yīng)用于Xbox360和XboxOne主機(jī)的游戲設(shè)備。它讓玩家不需要手持或踩踏控制器，而是使用語音指令或手勢來操作Xbox360和XboxOne的系統(tǒng)界面。它也能捕捉玩家全身上下的動(dòng)作，用身體來進(jìn)行游戲，帶給玩家“免控制器的游戲與娛樂體驗(yàn)”。

3 討論

最新研究發(fā)現(xiàn)，高血壓與免疫炎癥和慢性腎病之間的關(guān)系密切。持續(xù)性高血壓將導(dǎo)致腎纖維化及終末器官損害，是繼糖尿病腎病之后導(dǎo)致終末期腎病的第二大病因。IL-17A主要是由Th17細(xì)胞產(chǎn)生的一種多效性細(xì)胞因子，其主要功能是通過釋放促炎和中性粒細(xì)胞動(dòng)員的細(xì)胞因子介導(dǎo)組織炎癥反應(yīng)。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)IL-17A在高血壓腎病中扮演著重要角色。Orejudo等在血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）建立的高血壓模型小鼠中發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用IL-17A單克隆抗體阻斷的AngⅡ模型小鼠腎臟炎癥反應(yīng)明顯降低，結(jié)果表明IL-17A可能參與小鼠血壓升高以及高血壓引起的腎臟炎癥反應(yīng)。Amador等實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)也表明Th17細(xì)胞及其效應(yīng)細(xì)胞因子IL-17A在高血壓發(fā)病機(jī)制中的作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SHR大鼠脾淋巴細(xì)胞中Th17細(xì)胞的頻數(shù)明顯高于WKY組，SHR大鼠外周血與腎臟中IL-17A的濃度和蛋白的表達(dá)水平顯著高于對照組，且其血壓亦顯著高于對照組。結(jié)果提示IL-17A可能在SHR大鼠血壓升高和腎臟損傷的過程中發(fā)揮重要作用。此外，在小鼠腎臟缺血再灌注的模型中注射抗IL-17A單克隆抗體后，小鼠腎臟的損傷減輕，腎臟組織和血漿中的促炎介質(zhì)濃度也隨之降低。

在腎臟疾病中，巨噬細(xì)胞是慢性炎癥反應(yīng)的重要介質(zhì)，其浸潤程度與腎臟損傷的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。根據(jù)組織微環(huán)境的不同，人原代單核細(xì)胞來源的巨噬細(xì)胞（M0）可被極化為M1和M2兩種不同的表型。其中M1巨噬細(xì)胞產(chǎn)生大量的促炎介質(zhì)，介導(dǎo)抗腫瘤免疫等；M2巨噬細(xì)胞具有抗炎功能，持續(xù)表達(dá)易導(dǎo)致組織纖維化。常見的M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物有iNOS、CD86等；M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物有Arg-1、CD163、CD206等。Liu等研究表明巨噬細(xì)胞分泌的補(bǔ)體C3導(dǎo)致IL-17A介導(dǎo)的炎癥細(xì)胞浸潤到腎臟，從而導(dǎo)致腎損傷。此外，在對動(dòng)物模型和高血壓患者的研究中發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞極化在高血壓腎損傷中扮演著重要角色。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，iNOS mRNA及蛋白的表達(dá)在SHR大鼠腎臟組織6、10周齡時(shí)顯著升高，而在30周齡時(shí)顯著降低；同時(shí)Arg-1mRNA及蛋白在30周齡時(shí)顯著表達(dá)。這些結(jié)果證實(shí)了巨噬細(xì)胞參與SHR大鼠腎損傷，這與前述結(jié)果一致。然而，本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)在巨噬細(xì)胞浸潤的過程中，SHR大鼠在6、10、30周齡時(shí)IL-17A血漿中的濃度和腎臟中mRNA的表達(dá)亦顯著高于WKY組；這些數(shù)據(jù)表明在SHR 大鼠腎臟組織中M1/M2 巨噬細(xì)胞浸潤與IL-17A的表達(dá)呈一致性變化趨勢。提示在SHR大鼠腎臟中IL-17A上調(diào)的同時(shí)伴隨著M1/M2巨噬細(xì)胞極化偏移。另有研究表明，在肺癌、子宮內(nèi)膜異位癥等疾病中IL-17A通過其受體IL-17AR誘導(dǎo)M2巨噬細(xì)胞極化，此結(jié)果亦驗(yàn)證了IL-17A在巨噬細(xì)胞極化的過程中發(fā)揮著重要作用。

最新研究表明，EMT與高血壓腎纖維化的發(fā)生密切相關(guān)。根據(jù)其發(fā)生的生物學(xué)背景，EMT可分為三種亞型，I型與器官發(fā)育相關(guān)；Ⅱ型繼發(fā)于炎癥，與組織再生和器官纖維化相關(guān)；Ⅲ型促進(jìn)惡性腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。在EMT發(fā)生的過程中，最關(guān)鍵的一步是下調(diào)Ecadherin的表達(dá)，隨后細(xì)胞分裂浸入基底膜向間質(zhì)移動(dòng)；而后獲得間質(zhì)表型標(biāo)志物，如α-SMA。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在SHR 大鼠30 周齡時(shí)腎組織E-cadherin mRNA和蛋白的表達(dá)顯著低于對照組；α-SMA mRNA和蛋白的表達(dá)在10、30周齡時(shí)顯著高于對照組。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，在注射AngⅡ的高血壓大鼠中未檢測到明顯蛋白尿以及腎纖維化之前，腎小管周圍就能檢測到EMT的發(fā)生；此外，在飲食鹽攝入誘導(dǎo)的高血壓大鼠模型中，腎小管上皮細(xì)胞周圍亦檢測到E-cadherin表達(dá)降低，α-SMA表達(dá)增強(qiáng)。在這些高血壓動(dòng)物模型中腎臟都發(fā)生了EMT，但其發(fā)生的機(jī)制需要進(jìn)一步闡明。最新研究發(fā)現(xiàn)，人近端小管上皮細(xì)胞（HK-2）與M2巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)48 h后，HK-2細(xì)胞α-SMA的表達(dá)明顯上升，E-cadherin的表達(dá)明顯下降。此外，Yu等研究發(fā)現(xiàn)M1/M2巨噬細(xì)胞極化可以調(diào)節(jié)順鉑處理的腎小管上皮細(xì)胞EMT的發(fā)生。我們的研究結(jié)果表明，在SHR大鼠6、10、30周齡M1/M2巨噬細(xì)胞極化的過程中SHR大鼠腎臟亦發(fā)生了EMT，與前述結(jié)果一致。本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，SHR大鼠從10周齡至30周齡時(shí)腎臟中IL-17A mRNA和蛋白的表達(dá)與E-cadherin mRNA和蛋白的表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)，與α-SMA mRNA和蛋白的表達(dá)呈顯著正相關(guān)。提示IL-17A在SHR大鼠腎臟EMT的過程中發(fā)揮著重要作用。

因此，IL-17A參與高血壓腎EMT的發(fā)生，其機(jī)制可能與其介導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化有關(guān)。