急性髓系白血病(AML)是一種以髓系干/祖細(xì)胞克隆性增殖和分化受阻為特征的血液系統(tǒng)惡性疾病。AML1-ETO（AE）來源于t（8；21）（q22；q22）染色體易位，見于約4%～8%的AML。除了通過其RUNT結(jié)構(gòu)域直接與靶基因結(jié)合外，AML1-ETO還可以被招募而形成穩(wěn)定的AETFC復(fù)合物與DNA結(jié)合，使其在轉(zhuǎn)錄水平上通過與靶基因結(jié)合而調(diào)控轉(zhuǎn)錄。AE的缺失會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的廣泛改變，進(jìn)而改變基因表達(dá)，并損害AML的生長。盡管可以確定因AE敲除改變的基因，但鑒于基因表達(dá)的調(diào)控可以發(fā)生在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平上，因此無法確定這些改變是直接還是間接發(fā)生的。而AE是否以及如何在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)尚不清楚。

課后交流，同事總結(jié)說：“楊老師，你的這堂課，有朗讀、靜思、討論、爭鳴、共識(shí)、多元評(píng)價(jià)，充滿學(xué)科特點(diǎn)、人文元素且智慧啟迪。你說的話少，卻又畫龍點(diǎn)睛。滿堂課沒有花樣，卻有氛圍。讓人感覺意猶未盡，聽了還想聽?！?/p>

N6-甲基腺嘌呤（m6A）是高等生物mRNA 和IncRNA上甲基化修飾最普遍的存在方式。m6A通過調(diào)節(jié)RNA穩(wěn)定性和蛋白質(zhì)翻譯速率而在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)節(jié)基因表達(dá)并顯著影響癌癥的發(fā)展。m6A甲基化過程表現(xiàn)出動(dòng)態(tài)和可逆的特征，它可以由甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物（如WTAP、METTL3、METTL14）安裝，同時(shí)也可以被去甲基化酶（如FTO、ALKBH5）清除，并被m6A 結(jié)合蛋白（如YTHDF1/2/3、YTHDC1/2 和IGF2BP1/2/3）識(shí)別。研究發(fā)現(xiàn)甲基轉(zhuǎn)移酶METTL14在伴有t（8;21）、t（11q23）或t（15;17）的AML中高表達(dá)，通過改變m6A修飾模式促進(jìn)白血病的發(fā)展。

因此本研究將AE依賴的轉(zhuǎn)錄調(diào)控與m6A相結(jié)合，通過對(duì)AE敲除前后的AML細(xì)胞進(jìn)行m6A測(cè)序，分析細(xì)胞內(nèi)的m6A修飾特征，觀察AE在轉(zhuǎn)錄后水平上通過改變m6A修飾模式對(duì)基因表達(dá)的影響。

從研究方法可以看出，我國研究者更關(guān)注于注重研究實(shí)際效果的實(shí)證研究，理論研究較少，這對(duì)我們實(shí)際進(jìn)行英語詞匯學(xué)習(xí)有直接效果。但是通過分析眾多進(jìn)行實(shí)證研究的論文，我們發(fā)現(xiàn)研究方法最多是采用問卷和訪談形式，其他方法的使用很少。如馬蓉、秦曉晴（2017）通過分發(fā)詞匯學(xué)習(xí)問卷和詞匯測(cè)試卷給294名受試者以研究動(dòng)機(jī)調(diào)控的詞匯學(xué)習(xí)模型。

1 材料和方法

1.1 試劑與儀器

MeRIP-Seq和RNA-Seq聯(lián)合分析結(jié)果顯示，在AE敲除和未敲除中，與非m6A修飾的基因相比，m6A所修飾的基因表達(dá)水平更高（SKNO-1:0.6116±1.2632.010±1.655，＜0.0001；SKNO-1 siAE:0.5528±1.2572.067±1.686，＜0.0001，圖4A）。GO分析顯示，轉(zhuǎn)錄組參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控、信號(hào)誘導(dǎo)等生物過程，其基因產(chǎn)物在細(xì)胞質(zhì)、胞漿與細(xì)胞核等部位發(fā)揮作用，影響著蛋白質(zhì)、離子、DNA結(jié)合等功能（圖4B）。當(dāng)m6A修飾落在不同區(qū)域時(shí)，對(duì)于僅有一個(gè)m6A修飾位點(diǎn)的基因，若其在外顯子區(qū)被m6A修飾，則表達(dá)量低于3'UTR或5'UTR m6A修飾的基因（SKNO-1：1.973±1.7371.018±1.3802.267±1.872，＜0.0001；SKNO-1 siAE：2.181±1.8260.9823±1.424，＜0.0001，0.9823±1.4242.065±1.860，＜0.0001，2.181±1.8262.065±1.860，NS，圖4C）。統(tǒng)計(jì)所有被m6A 修飾的基因，也表現(xiàn)出相同的趨勢(shì)（SKNO-1:2.177±1.6331.333±1.4702.449±1.651，＜0.0001；SKNO-1 siAE:2.304±1.6711.336±1.5222.394±1.649，＜0.05，圖4D）。對(duì)于m6A修飾的數(shù)量與基因表達(dá)量關(guān)系的分析顯示，與僅有一個(gè)m6A修飾位點(diǎn)的基因相比，擁有更多m6A修飾位點(diǎn)的基因其表達(dá)量也相對(duì)更高（圖4E）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

SKNO-1與SKNO-1 SIAE細(xì)胞株由301醫(yī)院血液科實(shí)驗(yàn)室提供，自液氮復(fù)蘇后將細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中，放置培養(yǎng)箱培養(yǎng)（37 ℃、5%CO、飽和濕度），每2～3 d換液傳代1次。

1.3 MeRIP-seq和RNA-seq

戰(zhàn)士們默默地望著眼前這位一年輕的連長，此時(shí)，無需語言，無需口號(hào)，他們已在心里下定了必死的決心。只要一息尚存，決不會(huì)讓小鬼子越過高家?guī)X陣地。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

對(duì)兩個(gè)細(xì)胞系的基因表達(dá)水平進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，敲除AE融合基因后出現(xiàn)6000多個(gè)差異表達(dá)的基因（圖3A，log2 fc＞1.5，＜0.05），其中2483個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，3913個(gè)基因表達(dá)下降（圖3B）。差異表達(dá)的基因分布于癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)、腫瘤壞死因子、調(diào)節(jié)干細(xì)胞多能性、癌癥通路等多條通路中（圖3C）。GO分析表明，這些差異表達(dá)的基因參與了包括質(zhì)膜形成、多細(xì)胞生物發(fā)育等多種生理過程（圖3D）。

1.5 數(shù)據(jù)分析

1.5.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用IBM SPSS Statistics 24.0 及GraphPad Prism 9軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。定量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，獨(dú)立樣本檢驗(yàn)用于符合正態(tài)分布定量資料的組間比較；Mann-Whitney用于不符合正態(tài)分布定量資料的組間比較，＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

利用MeRIP-Seq在AE(+)和敲除AE的AML細(xì)胞系中進(jìn)行RNA m6A測(cè)序，分析整個(gè)轉(zhuǎn)錄組m6A修飾的變化。利用高通量測(cè)序技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-seq）。基因測(cè)序由杭州聯(lián)川生物技術(shù)股份有限公司進(jìn)行。使用Trizol 試劑提取總RNA 后，使用Oligo-dT 磁珠對(duì)total RNA帶有polyA的mRNA進(jìn)行富集。對(duì)磁珠進(jìn)行富集，得到帶有polyA的mRNA。之后加入片段化試劑，將完整的mRNA進(jìn)行片段化，片段化長度約為100 nt。將片段化后的RNA分成2份。一份加入帶有預(yù)混好的m6A抗體免疫磁珠，對(duì)含有m6A甲基化的mRNA片段進(jìn)行富集。另一份作為對(duì)照，直接構(gòu)建常規(guī)的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序文庫。對(duì)m6A抗體免疫磁珠進(jìn)行富集，帶有m6A的mRNA片段進(jìn)行回收后，按照轉(zhuǎn)錄組的建庫流程構(gòu)建常規(guī)的測(cè)序文庫。分別將構(gòu)建好的2 個(gè)測(cè)序文庫，即m6A-seq library（IP）和RNA-seq library（input）分別進(jìn)行高通量測(cè)序，測(cè)序平臺(tái)為Illumina Novaseq?6000，測(cè)序模式為150 PE。

1.5.1 MeRIP-seq&RNA-seq 數(shù)據(jù)分析 Cutadapt 以及本地perl腳本去除低質(zhì)量序列、污染序列以及測(cè)序儀接頭序列，得到CleanData。使用fastp軟件對(duì)CleanData進(jìn)行質(zhì)控。使用HISAT2的默認(rèn)參數(shù)將reads比對(duì)到參考基因組上。exomePeak 和ChIPseeker 進(jìn)行Peak calling分析和Peak注釋。MEME和HOMER對(duì)富集區(qū)域進(jìn)行motif分析。基因定量軟件為StringTie，歸一化方式為FPKM?；虿町惙治霾捎肦 包edgeR。ggplot2 包對(duì)GO 富集分析結(jié)果以散點(diǎn)圖展示，Rich factor表示位于該GO的差異基因個(gè)數(shù)/位于該GO的總基因數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 SKNO-1與SKNO-1 siAE細(xì)胞系的m6A修飾

通過MeRIP-Seq 技術(shù)對(duì)AE(+)的AML 細(xì)胞系SKNO-1與敲除AE的SKN0-1 siAE細(xì)胞系進(jìn)行RNA m6A甲基化測(cè)序，測(cè)序結(jié)果的主成分分析顯示，SKN0-1 siAE細(xì)胞系的2個(gè)樣本可以與SKNO-1細(xì)胞系的2個(gè)樣本區(qū)別開，具有可比性（圖1A）。為了分析m6A在兩個(gè)細(xì)胞系轉(zhuǎn)錄組中的分布，根據(jù)其在mRNA上的位置，將m6A peak劃分為5′非翻譯區(qū)（5'UTR）、蛋白質(zhì)編碼區(qū)（CDS）及3′非翻譯區(qū)（3'UTR），m6A peak主要在2個(gè)細(xì)胞系的外顯子區(qū)及3'UTR富集（圖1B、C）。峰密度分析也顯示m6A peak主要富集于CDS區(qū)與3'UTR（圖1D）。Motif 分析顯示，在2 個(gè)細(xì)胞系內(nèi)均有m6A 結(jié)合基序RRACH（圖1E）。在測(cè)序結(jié)果中，共檢測(cè)到26 441個(gè)基因，包含了72 036個(gè)m6A peak。其中有2164個(gè)基因僅在SKNO-1 細(xì)胞系中表達(dá)，3395個(gè)基因僅在SKNO-1 siAE細(xì)胞系中表達(dá)，12 451個(gè)基因在兩細(xì)胞系共表達(dá)（圖1F）。

馬約翰先生在1934年談到體育時(shí)就說清華的體育終極目標(biāo)是普及，要教導(dǎo)學(xué)生們不僅在學(xué)校里要進(jìn)行體育鍛煉，進(jìn)入社會(huì)也不能停止鍛煉，倡導(dǎo)終生體育。“動(dòng)是健康的源泉”，這是馬約翰先生在早年提出的理論，并在1954年出版《我的健康是怎么得來的》一書中反復(fù)強(qiáng)調(diào)。他

2.2 m6A動(dòng)態(tài)分析

AE敲除后細(xì)胞內(nèi)的m6A peak數(shù)量由37 042個(gè)變成34 994個(gè)（圖2A）。其中1278個(gè)peak顯著上調(diào)，1225個(gè)peak顯著下調(diào)，20 827個(gè)peak無顯著變化（＜0.05，log2fc＞1，圖2B）。分析顯示AE敲除后增多的peak主要集中在CDS區(qū)與3'UTR區(qū)，降低的peak則主要集中在CDS區(qū)（圖2C）。AE敲除后新出現(xiàn)了1316個(gè)m6A修飾的基因，1830 個(gè)基因失去了m6A 修飾（圖2D）。KEGG通路分析的結(jié)果顯示，差異的peak主要在癌癥、人類T淋巴細(xì)胞白血病病毒Ⅰ、嘌呤代謝、血小板活化等通路中富集（圖2E）。

綜上，網(wǎng)絡(luò)課程具有便捷、內(nèi)容豐富、節(jié)約成本、受眾廣泛等特征，前兩個(gè)特征是對(duì)于學(xué)習(xí)者來說的，而后一個(gè)則是設(shè)計(jì)者需要考慮的。網(wǎng)絡(luò)課程相較于傳統(tǒng)課程來說，它雖有如此之多的好處，卻無法保證學(xué)習(xí)者的同一性。即目前絕大多數(shù)的網(wǎng)絡(luò)教育只解決了距離和空間上的問題, 卻忽視了參與者的廣泛性、多樣性和特殊性[3]。不論是從學(xué)習(xí)需要還是從設(shè)計(jì)者的經(jīng)濟(jì)效益來說，應(yīng)解決這些障礙，完善網(wǎng)絡(luò)課程學(xué)習(xí)模式。

2.3 AE敲除后基因表達(dá)水平變化

SKNO-1與SKNO-1 siAE培養(yǎng)1周后，通過trizol法提取總RNA。紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度。利用快速逆轉(zhuǎn)錄試劑盒制備cDNA。KAPA SYBRFAST qPCR 試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)定量熒光PCR。以GAPDH作為對(duì)照。20 μL反應(yīng)體系，95 ℃20 s；95 ℃3 s，60 ℃20 s，72 ℃20 s，40 個(gè)循環(huán)。所用引物如表1。

2.4 RNA-seq與m6A-seq的聯(lián)合分析

RPMI 1640培養(yǎng)液、胎牛血清、青霉素鏈霉素雙抗混合液（Gibco），mRNA 提取試劑盒Magnetic mRNA Isolation Kit S1550S[NEB（北京）有限公司]，Hybond-N+膜（GE Healthcare），Dot Blot（170-3938）（Bio-Rad），m6A抗體（Proteintech），二抗抗兔抗體（CST），ChemiDoc?成像系統(tǒng)（BIO-RAD）。

2.5 AE敲除后m6A相關(guān)酶水平的變化

AE 敲除后，測(cè)序結(jié)果顯示，AE 敲除后2 種甲基轉(zhuǎn)移酶WTAP、METTL14 與去甲基化酶ALKBH5 表達(dá)量均升高（WTAP:5.36±0.565713.19±0.3253，METTL14：2.850±0.15568.815±1.761，ALKBH5:13.70±0.459639.84±6.067，＜0.05，圖4F）。qPCR檢測(cè)敲除AE前后METTL14、WTAP、ALKBH5的表達(dá)水平，結(jié)果顯示W(wǎng)TAP表達(dá)量升高1.7倍、ALKBH5表達(dá)量升高2.4倍，而METTL14表達(dá)量降低至0.93倍（圖4G）。

3 討論

M6A修飾作為真核生物中最普遍的轉(zhuǎn)錄后修飾不改變堿基配對(duì)和編碼,但通過不同的甲基轉(zhuǎn)移酶、去甲基化酶、閱讀蛋白和相關(guān)復(fù)合物相互作用，在多個(gè)水平上廣泛影響基因表達(dá)。因此，動(dòng)態(tài)m6A修飾對(duì)許多正常生物過程以及癌癥的發(fā)生、進(jìn)展、轉(zhuǎn)移、耐藥性和癌癥復(fù)發(fā)至關(guān)重要。以往對(duì)于AML中AML1-ETO融合基因與m6A修飾的研究大多集中于這二者獨(dú)立的作用機(jī)制。如AE調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄對(duì)白血病發(fā)生發(fā)展的影響，或m6A及m6A相關(guān)酶在白血病中的作用。鮮少有對(duì)AE與m6A之間關(guān)系的研究。因此本研究希望觀察AE在轉(zhuǎn)錄后水平上通過改變m6A修飾模式對(duì)基因表達(dá)的影響，探索AE依賴的轉(zhuǎn)錄與m6A修飾之間的聯(lián)系。

本研究發(fā)現(xiàn)m6A peak主要在敲除AE和表達(dá)AE的外顯子區(qū)及3'UTR富集，這與此前真核生物細(xì)胞內(nèi)有關(guān)m6A的研究結(jié)果一致。且Motif分析顯示在兩個(gè)細(xì)胞系內(nèi)均有m6A結(jié)合基序RRACH，符合先前研究中對(duì)m6A共識(shí)結(jié)合基序[G/A/U][G＞A]m6AC[U＞A＞C]的認(rèn)識(shí)。這證明本研究結(jié)果中對(duì)m6A的研究是準(zhǔn)確可靠的。

既往研究證實(shí)，在SKNO-1細(xì)胞中抑制AML-ETO可導(dǎo)致細(xì)胞分化和白血病細(xì)胞生長抑制，通過siRNA將AML1-ETO敲除可使SKNO-1細(xì)胞系對(duì)誘導(dǎo)細(xì)胞分化的TGFβ1敏感，克隆形成減少，抑制細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)衰老。本研究在敲除AE和表達(dá)AE的AML細(xì)胞系中進(jìn)行RNA m6A甲基化測(cè)序，結(jié)果顯示AE敲除后新出現(xiàn)了1316個(gè)m6A修飾的基因，1830個(gè)基因失去了m6A修飾。增多的peak主要集中在CDS區(qū)與3'UTR區(qū)，降低的peak則主要集中在CDS區(qū)。AE的敲除對(duì)細(xì)胞內(nèi)的m6A修飾數(shù)量和位點(diǎn)均造成了影響，顯示出AE對(duì)m6A修飾模式的調(diào)控作用。結(jié)合敲除AML1-ETO后細(xì)胞內(nèi)m6A修飾模式的改變，可以推測(cè)AML1-ETO這種對(duì)細(xì)胞功能的影響或許與其改變m6A修飾模式的能力有關(guān)。

RNA-seq結(jié)果的GO分析顯示差異表達(dá)的基因與m6A peak富集在干細(xì)胞多能性的調(diào)節(jié)、癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)等多條通路中，提示AE與m6A對(duì)癌癥發(fā)生發(fā)展的重要性。KEGG通路分析顯示差異的m6A peak與基因在轉(zhuǎn)化生長因子、腫瘤壞死因子等信號(hào)通路中富集，其與細(xì)胞生長、凋亡、分化與腫瘤發(fā)生發(fā)展有著密切聯(lián)系。MeRIP-Seq和RNA-Seq聯(lián)合分析提示，是否有m6A修飾、m6A修飾位點(diǎn)的數(shù)量與位置對(duì)調(diào)控基因表達(dá)水平起著重要的作用。當(dāng)t（8；21）AML 發(fā)生時(shí)，AML1-ETO或許是通過在這些通路上調(diào)控基因的m6A修飾狀態(tài)進(jìn)而調(diào)節(jié)其表達(dá)，促進(jìn)AML的發(fā)展。

此外，在RNA-seq與實(shí)時(shí)熒光定量PCR的結(jié)果中均檢測(cè)到AE敲除后甲基化酶WTAP、METTL14和去甲基化酶ALKBH5的表達(dá)變化，這提示AE或許通過調(diào)控一種或多種m6A相關(guān)酶的表達(dá)控制細(xì)胞內(nèi)的甲基化水平。其中甲基轉(zhuǎn)移酶WTAP不止作為甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物的重要組成部分，其自身也作為一種致癌因子在體內(nèi)起著重要的作用，并且與正常細(xì)胞相比，WTAP在急性髓系白血病細(xì)胞中的表達(dá)高于正常水平。AE的敲除所造成的m6A相關(guān)酶差異表達(dá)展示了AE對(duì)于細(xì)胞內(nèi)m6A相關(guān)酶的影響，推測(cè)AML1-ETO融合基因或許可以調(diào)控一種或多種m6A相關(guān)酶的表達(dá)控制細(xì)胞內(nèi)的甲基化水平，影響m6A修飾模式，從而起到調(diào)節(jié)白血病細(xì)胞侵襲性生長的作用。這或許能為m6A調(diào)節(jié)劑治療AE（+）的AML提供新的思路。