腎細胞癌的發(fā)病率在泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤中排第3，但致死率卻高居第1位。腎透明細胞癌（ccRCC）是腎細胞癌最常見的病理類型，約占70%。許多ccRCC患者在首次確診時就已經(jīng)出現(xiàn)了轉移。由于ccRCC對放療和化療不敏感，導致患者預后較差。因此，明確其發(fā)生的分子生物學機制，并尋找新的治療靶點，是目前亟待解決的問題。MicroRNA(miRNA)是一種非編碼RNA，具有高度保守性，長度一般在19～25個核苷酸。miRNA通過與mRNA的3'-UTR結合來調(diào)控基因的表達，從而調(diào)控對蛋白質(zhì)的翻譯或降解。miRNA的異常表達在多種腫瘤的發(fā)生和進展中起著關鍵性的作用。據(jù)文獻報道，miR-744-5p參與調(diào)控了多種腫瘤的進展，如肝細胞癌、惡性膠質(zhì)瘤、垂體腺瘤等。然而，miR-744-5p在ccRCC中的作用尚未有研究報道，本研究旨在探討miR-744-5p在ccRCC中的作用及其機制，從而為ccRCC的臨床診斷和靶向治療提供新思路。

1 材料和方法

1.1 組織標本、細胞系及主要材料

組織標本：65對ccRCC組織及配對的癌旁組織來源于在南昌大學第一附屬醫(yī)院泌尿外科接受腎癌根治術的患者，所有標本均經(jīng)病理診斷為ccRCC，患者術前均未接受放療或化療，標本采集后立即放入液氮，并轉移至-80 ℃冰箱內(nèi)保存以供后續(xù)實驗用。本次研究獲得了我院倫理委員會的批準，所有患者均簽署知情同意書。

本系統(tǒng)由個人健康檔案、疾病風險預警、健康干預、健康宣教、用藥管理、系統(tǒng)管理五個部分組成。個人健康檔案模塊主要功能包括患者基本信息、歷史體檢信息、日常監(jiān)測信息、隨訪記錄。預警管理模塊主要功能包括自定義預警值、預警信息推送、歷史監(jiān)測結果與預警值對比圖、預警記錄查詢。健康評估模塊主要功能包括疾病風險評估報告、健康促進報告。用藥管理模塊主要功能包括用藥計劃設置和管理、用藥提醒、用藥后簽到、用藥歷史查詢。健康宣教模塊主要功能包括多媒體健康信息推送、健康互動小游戲、帶學習功能的調(diào)查問卷。系統(tǒng)管理模塊主要功能包括醫(yī)生賬戶管理、患者賬戶管理、疾病類別管理、疾病級別管理。

細胞系：人類正常腎小管上皮細胞（HK2）以及5種人類ccRCC細胞系（786-O，A498，ACHN，OSRC2，769-P）均購自武漢普諾賽生物科技有限公司。主要試劑：Trizol試劑盒、逆轉錄試劑盒及實時定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）試劑盒（武漢賽維爾生物科技有限公司）；培養(yǎng)基、胎牛血清（Gibco）；miR-744-5p模擬物（miR-744-5p mimic）、陰性對照（NC mimic）、過表達CCND1（CCND1）及陰性對照（CCND1-NC）均購自廣州銳博生物科技有限公司；Lipofectamine 3000（Invitrogen）；雙熒光素酶活性檢測試劑盒（Promega）；基質(zhì)膠和Transwell小室（Corning）；RIPA 裂解液和BCA試劑盒（武漢賽維爾生物科技有限公司）；所使用的抗體均購自Abcam。

1.2 qRT-PCR

用Trizol試劑盒提取組織及細胞中的RNA，紫外分光光度計檢測所提取RNA的濃度，根據(jù)逆轉錄試劑盒的說明合成cDNA，并用PCR儀進行擴增。以β-actin及U6作為內(nèi)參，采用2法計算相對表達量。本研究中所使用引物的序列如表1所示。

1.3 細胞培養(yǎng)及轉染

將消化、離心并重懸后的細胞按照2×10/孔的密度接種到96孔板中，在培養(yǎng)24、48、72 h后，在每孔內(nèi)分別加入10 μL CCK-8試劑，37 ℃條件下培養(yǎng)2～4 h，檢測其吸光度。

1.4 CCK8實驗

用含有10%胎牛血清和1%青-鏈霉素混合液的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為5%的CO濃度，溫度為37 ℃，每3 d更換1次培養(yǎng)基。待細胞生長至30%～50%的密度時，用Lipofectamine 3000進行轉染。

1.5 劃痕實驗

QRT-PCR 結果顯示，與NC mimic 組相比，miR-744-5p mimic組miR-744-5p的表達水平明顯升高（均＜0.05，圖2）。CCK8結果顯示，過表達miR-744-5p可以抑制ccRCC細胞的增殖作用（均＜0.05，圖3A）。劃痕愈合實驗結果顯示，與NC mimic組相比，miR-744-5p mimic組細胞的遷移作用明顯減弱（均＜0.05，圖3B）。Transwell侵襲實驗結果顯示，miR-744-5p mimic組細胞的穿膜細胞數(shù)明顯少于NC mimic 組（均＜0.05，圖3C）。

1.6 Transwell侵襲實驗

用RIPA裂解液將細胞裂解并提取蛋白質(zhì)，BCA法檢測蛋白濃度。用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，并轉移到聚偏氟乙烯（PⅤDF）膜上。將PⅤDF膜與一抗孵育過夜后再與二抗孵育1 h，最后用顯影液對PⅤDF膜進行成像并分析各條帶的灰度值。

1.7 雙熒光素酶報告基因實驗

利用Starbase 等網(wǎng)站預測miR-744-5p 與CCND1的結合位點，設計并合成CCND1的野生型（WT）和突變型（MUT）結合位點，構建目的質(zhì)粒。將CCND1-WT或CCND1-MUT 分別與與miR-744-5p mimic 和NC mimic共轉染細胞，轉染48 h后使用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)檢測熒光素酶的活性。熒光素酶活性計算方法如下：熒光素酶活性=螢火蟲熒光素酶活性/海腎熒光素酶活性。

1.8 Western blot實驗

在Transwell小室的上室中加入基質(zhì)膠，待其凝固后備用。在下室中加入600 μL含20%胎牛血清的培養(yǎng)基，放入Transwell小室。將細胞常規(guī)消化、離心后，用無血清培養(yǎng)基重懸，在上室中加入200 μL含2×10細胞的細胞懸液。培養(yǎng)24 h后用甲醇固定，0.1%結晶紫染色。用棉簽將上室擦洗干凈，風干后在顯微鏡下拍照、計數(shù)。

1.9 統(tǒng)計學方法

使用GraphPad Prism7.0 進行作圖，使用IBMSPSS26.0進行統(tǒng)計學分析。正態(tài)分布的連續(xù)性變量用均數(shù)±標準差表示，組間比較采用檢驗或卡方檢驗。＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 miR-744-5p在ccRCC組織及細胞系中低表達

回復實驗結果顯示，共轉染CCND1可以使miR-744-5p mimic對786-O細胞的增殖、遷移和侵襲的抑制作用得到部分逆轉（＜0.05，圖5A～C），Western blot實驗也呈現(xiàn)出相似的結果（＜0.05，圖5D）。

共產(chǎn)主義是對異化勞動的揚棄，在共產(chǎn)主義社會中，勞動時間（活勞動）不再決定商品的價值，人類積累的巨大的物化勞動使得活勞動在生產(chǎn)過程中所占的比例越來越小。財富的增加將更多的取決于科學技術的進步，而不是人力的投入。人從生產(chǎn)中解放出來，他將回歸自然的本質(zhì)，此時的勞動是按照任何一種尺度在自由的時間和自由的意愿下進行的，人可以自由地面對自己的產(chǎn)品，所以“這種共產(chǎn)主義，作為完成了的自然主義，等于人道主義，作為完成了的人道主義，等于自然主義，它是人和自然之間，人和人之間的矛盾的真正解決，它是歷史之謎的解答，而且知道自己就是這種解答?！保?］81共產(chǎn)主義下的世界歷史才真正成為自覺的合理的歷史。

2.2 過表達miR-744-5p抑制ccRCC細胞的增殖、遷移和侵襲

將細胞均勻的接種至6孔板中，待細胞密度達80%時，用槍頭在每孔中做一“十”字劃痕，PBS清洗后用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，在0、24 h在顯微鏡下拍照，并計算細胞遷移的距離。

2.3 CCND1是miR-744-5p的下游靶基因

以物質(zhì)為研究對象的化學領域,可以說無時無處不與哲學有關，哲學理應滲透于化學教學與科研之中[14]。無機化學同樣蘊含著豐富深刻的哲學原理，包括唯物主義物質(zhì)觀與質(zhì)量互變、矛盾論和否定之否定規(guī)律等辯證法思想，需要教師不斷挖掘，并將其滲透于課堂教學中。

生物信息學預測結果顯示CCND1 可能是miR-744-5p下游靶基因。QRT-PCR結果顯示過表達miR-744-5p 可使CCND1 的表達降低（＜0.05，圖4A）。Western blot實驗也呈現(xiàn)出相似的結果（＜0.05，圖4B）。雙熒光素酶報告基因實驗結果顯示miR-744-5p mimic可以導致CCND1-MUT 的熒光素酶活性降低，而CCND1-WT 的熒光素酶活性沒有出現(xiàn)明顯下降（＜0.05，圖4C、D）。

2.4 過表達CCND1可以部分逆轉過表達miR-744-5p對ccRCC細胞惡性表型的抑制作用

QRT-PCR結果顯示，與癌旁正常組織相比，miR-744-5p在ccRCC組織中明顯低表達（＜0.05，圖1A）。MiR-744-5p 在786-O，A498，ACHN 以及OSRC2 等5種ccRCC細胞系中的表達低于HK2細胞，差異有統(tǒng)計學意義（＜0.05，圖1B）。由于與其他ccRCC細胞系相比，miR-744-5p在786-O及OSRC2中的表達最低，因此我們選擇這兩個細胞系用于后續(xù)實驗。

3 討論

近年來，MiRNA由于其對mRNA的多種調(diào)控作用而在癌癥領域得到了廣泛的研究。深入研究miRNA的作用將有助于更好地了解癌癥的潛在分子生物學機制。miRNA的表達水平與ccRCC有著緊密的聯(lián)系，例如，miR-101-3p可以通過靶向EZH2而抑制ccRCC的侵襲和轉移；miR-125b通過靶向維生素D受體在ccRCC 中發(fā)揮癌基因的作用。除此之外，miRNA還可通過多種機制調(diào)節(jié)ccRCC的進展。然而，目前對miRNA調(diào)控ccRCC進展的機制尚不十分清楚，有必要對其分子生物學機制進行深入研究，以期找到新的分子標志物和治療靶點，從而為ccRCC的診斷和治療提供依據(jù)。

首先，制定“師傅型”師資的選拔條件，注重技能和工作經(jīng)驗，嚴格把關準入條件。其次，規(guī)范“師傅型”師資的工作職責和評價考核標準，明確責任與義務。再次，出臺激勵政策，加強“師傅型”教師參與學徒日常管理的積極性，提升職業(yè)成就感，提高教師的綜合職業(yè)素質(zhì)，以全面提升“師傅型”師資隊伍整體水平。

MiR-744-5p最早由Sánchez等于2013年首先發(fā)現(xiàn)。2017年，Kleemann等首先描述了其在惡性腫瘤中的作用。大量研究表明，miR-744-5p與多種癌癥的發(fā)生和進展有著密切的聯(lián)系。Ren等的研究表明，miR-744-5p 可以靶向CDCA4，從而抑制肺腺癌的進展。另外，還有研究指出miR-744-5p在前列腺癌中低表達，過表達miR-744-5p可以抑制前列腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲，并可使EMT進程減弱。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)miR-744-5p 在ccRCC 中低表達，說明miR-744-5p在ccRCC中可能充當抑癌基因。有效抑制腫瘤細胞的惡性表型，促進細胞凋亡是抑制腫瘤生長和轉移的重要手段。為了研究miR-744-5p對ccRCC細胞功能的影響，我們進行了細胞增殖、遷移以及侵襲實驗，發(fā)現(xiàn)過表達miR-744-5p可以抑制ccRCC細胞的惡性表型。說明miR-744-5p可以對ccRCC細胞的功能進行調(diào)控。

CCND1是細胞周期蛋白家族中重要的一員，其主要功能是調(diào)節(jié)細胞周期進程，促進細胞由G1期轉變?yōu)镾期。研究表明，CCND1基因的突變在口腔癌、黑色素瘤等多種癌癥中起著重要的作用。在本研究中，為了研究miR-744-5p在ccRCC中的作用機制，我們預測了其下游靶基因，發(fā)現(xiàn)CCND1存在與miR-744-5p的結合位點。QRT-PCR和Western blot實驗發(fā)現(xiàn)過表達miR-744-5p可以使CCND1的表達降低。進一步的雙熒光素酶報告基因實驗結果證實了二者之間的結合關系。最后，為了證明CCND1在ccRCC細胞中的作用，我們進行了回復實驗，發(fā)現(xiàn)過表達CCND1可以使過表達miR-744-5p對ccRCC細胞惡性表型的抑制作用得到部分回復。上述研究結果證實了miR-744-5p通過靶向CCND1抑制ccRCC的進展。

通過對攝像頭采集的24 h的酶標板圖像利用上述酶標板培養(yǎng)孔顏色特征提取的方案二計算酶標板1～6列菌體培養(yǎng)孔培菌液每個時期的三通道顏色平均值，在MATLAB中對得到的不同時期的HSV三通道顏色平均值進行正弦類函數(shù)的曲線擬合，得到不同生長時期顏色變化的曲線.圖3分別為不同時期酶標板酶標板培養(yǎng)孔菌體的H、S、V顏色通道平均值曲線分布圖.

本研究的不足之處在于收集的臨床組織樣本量較少，這在不同程度上降低了研究結果的可信度。其次，由于條件限制，本研究沒有進行體內(nèi)實驗。此外，miR-744-5p的下游靶基因可能有多個，而我們只對其中一個進行了研究，這也是本研究的缺陷之一。我們期待在未來可以對miR-744-5p的作用機制作更深入的研究。

本文的研究對象是“老養(yǎng)殘”家庭中成年心智障礙人士的照料者，包括心智障礙人士的父母、兄弟姐妹及其他近親屬。結合現(xiàn)實，本研究對“老養(yǎng)殘”家庭這一概念進行了一定的擴展，即指由50歲及以上年齡的家庭成員照料成年心智障礙人士的家庭。本研究在前期對個別照料者進行了試訪談，進而確定問卷，在知情同意的基礎上收集照料者對未來安置規(guī)劃的理解和看法；而后，又根據(jù)自愿原則對部分照料者進行了個案訪談，以期從服務使用者的視角更具象地呈現(xiàn)這些特殊家庭的心路歷程。

綜上所述，本研究首次證實了miR-744-5p/CCND1軸在ccRCC細胞惡性表型中的調(diào)控作用，為ccRCC的診斷和靶向治療提供了新的思路。