神經(jīng)膠質(zhì)瘤約占原發(fā)性腦腫瘤的50%，其中膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是最常見(jiàn)、最具侵略性的亞型，腫瘤組織廣泛浸潤(rùn)到周?chē)哪X實(shí)質(zhì)中，從而導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)。膠質(zhì)瘤微環(huán)境中浸潤(rùn)大量的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAMs），占腫瘤的30%～50%，包括小膠質(zhì)細(xì)胞和外周血來(lái)源的巨噬細(xì)胞，TAMs在腫瘤來(lái)源的細(xì)胞因子和趨化因子作用下聚集到膠質(zhì)瘤腫瘤微環(huán)境中，抗腫瘤的功能被抑制，反而支持膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)和侵襲，TAMs的浸潤(rùn)往往提示膠質(zhì)瘤患者預(yù)后不良。

三磷酸腺苷（ATP）介導(dǎo)的嘌呤能信號(hào)已被證明可介導(dǎo)多種癌癥相關(guān)過(guò)程，包括細(xì)胞遷移、對(duì)細(xì)胞毒性治療的抵抗和免疫調(diào)節(jié)，近年來(lái)細(xì)胞外ATP及ATP門(mén)控P2X受體在腫瘤學(xué)領(lǐng)域受到越來(lái)越多的關(guān)注。有研究顯示，沉默P2X4受體可通過(guò)BDNF/TrkB/ATF4信號(hào)通路抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，目前關(guān)于P2X4受體是否參與膠質(zhì)瘤腫瘤微環(huán)境調(diào)控的研究較少，僅見(jiàn)報(bào)道P2X4受體在大鼠C6膠質(zhì)瘤中的巨噬細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞高表達(dá)，但其所涉及的功能及機(jī)制尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)研究旨在了解P2X4 受體在膠質(zhì)瘤TAMs中的表達(dá)對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲和遷移的影響，并探討其分子機(jī)制，以期為膠質(zhì)瘤治療新藥物靶點(diǎn)的開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 16只6～8周齡C57BL/6小鼠（昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心），雄性，體質(zhì)量18～22 g，動(dòng)物及實(shí)驗(yàn)符合國(guó)家科學(xué)技術(shù)委員會(huì)發(fā)布的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》。

1.1.2 細(xì)胞系 鼠源巨噬細(xì)胞RAW264.7 細(xì)胞系（ATCC），小鼠膠質(zhì)瘤GL261細(xì)胞系（上海子實(shí)生物科技有限公司）。

1.1.3 主要試劑 DMEM高糖培養(yǎng)基（BI），胎牛血清（浙江天杭生物科技股份有限公司），RAPI裂解液、BCA試劑盒、SDS電泳緩沖液、轉(zhuǎn)膜緩沖液、蛋白marker、5×loading buffer、QuickBlock?免疫染色封閉液、含DAPI抗熒光淬滅封片液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），檸檬酸組織抗原修復(fù)液（福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司），兔抗鼠P2X4 受體抗體（Alomone Labs），羊抗鼠Iba-1抗體（NOⅤUS），兔抗鼠IL-1β抗體（Protein Tech），兔抗鼠IL-18 抗體（萬(wàn)類(lèi)生物科技公司），鼠抗鼠GAPDH抗體（成都正能生物技術(shù)有限責(zé)任公司），驢抗兔熒光二抗、驢抗羊熒光二抗（Invitrogen），羊抗兔二抗（Protein Tech），羊抗鼠二抗（Biosharp），RNAprep Pure培養(yǎng)細(xì)胞/細(xì)菌總RNA提取試劑盒、FastKing cDNA第一鏈合成試劑盒、SuperReal 熒光定量預(yù)混試劑（天根生化科技有限公司），小干擾RNA，riboFECTTM轉(zhuǎn)染試劑（廣州銳博生物科技有限公司），Transwell小室（耐思生物科技有限公司），Matrigel（Corning）。

1.2.3 小鼠腦組織石蠟切片及HE染色 于種植后第21天，經(jīng)4%水合氯醛（0.1 mL/10 g）腹腔麻醉，生理鹽水、4%的多聚甲醛心臟灌注固定，取出腦組織，置于4%多聚甲醛中室溫過(guò)夜。常規(guī)脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋，行5 μm連續(xù)切片并常規(guī)HE染色，步驟包括烤片、脫蠟、水化、HE染色、二甲苯透明、中性樹(shù)膠封片。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) RAW264.7細(xì)胞系、GL261細(xì)胞系均采用DMEM高糖培養(yǎng)基，輔以10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素，置于37 ℃、5%CO培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.2.2 小鼠顱內(nèi)膠質(zhì)瘤模型的建立 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的小鼠膠質(zhì)瘤GL261細(xì)胞，經(jīng)胰蛋白酶消化制成單細(xì)胞懸液，PBS清洗2次，重懸于無(wú)血清培養(yǎng)基中，調(diào)整細(xì)胞密度為2×10/μL。4%水合氯醛麻醉小鼠（0.1 mL/10 g），按文獻(xiàn)［13］方法，選取右側(cè)小鼠腦尾狀核區(qū)為接種點(diǎn)（前囟前1 mm，矢狀縫向右2 mm，硬腦膜下3 mm），頭頂備毛，分離暴露顱骨，使用微量注射泵，將5 μL GL261細(xì)胞混懸液，緩慢注射至尾狀核，留針3 min，緩慢拔針，縫合小鼠頭部皮膚，常規(guī)飼養(yǎng)。

收集小鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞GL261的上清，作為腫瘤細(xì)胞條件培養(yǎng)基，刺激RAW264.7細(xì)胞轉(zhuǎn)化為T(mén)AMs，結(jié)果顯示，處理后RAW264.7中M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志基因Arg-1、IL-10表達(dá)增高（＜0.001），M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志基因TNF-α、iNOS的表達(dá)也增高（=0.006、0.001，圖4），但以M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志基因Arg-1、IL-10的表達(dá)增高更為明顯。

1.2.5 膠質(zhì)瘤TAMs的誘導(dǎo) 小鼠膠質(zhì)瘤GL261細(xì)胞生長(zhǎng)融合至70%，將培養(yǎng)基棄掉，用PBS沖洗2次，更換為新鮮的DMEM 完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h 后收集上清，1000離心10 min，去除細(xì)胞碎片，與DMEM完全培養(yǎng)基按照1∶1配成GL261條件培養(yǎng)基。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7細(xì)胞接種于6孔板中，細(xì)胞數(shù)目為2×10/孔，次日將培養(yǎng)基棄掉，用PBS沖洗2次，更換GL261條件培養(yǎng)基刺激24 h，將RAW264.7細(xì)胞誘導(dǎo)為T(mén)AMs。

1.1.4 主要儀器與設(shè)備 小鼠腦立體定位儀、小鼠顱骨骨鉆（深圳瑞沃德生命科技有限公司），微量注射器（寧波鎮(zhèn)海玻璃儀器廠），倒置顯微鏡（Zeiss），激光共聚焦顯微鏡（Nikon），凝膠成像儀（Bio-Rad），核酸蛋白檢測(cè)儀（Quawell）。

一個(gè)禮拜之后，王祥拿著這10萬(wàn)元真做起了小本買(mǎi)賣(mài)，不過(guò)處境也沒(méi)有比自己擺地?cái)偟臅r(shí)候好多少，同樣是人生地不熟，少了老道這樣的主心骨，王祥這幾招還是稚嫩了些。而且王祥也不了解做生意都是先虧后賺，才一個(gè)禮拜，就懷念起和老道一起騙人騙財(cái)?shù)纳睢?/p>

1.2.4 石蠟切片免疫熒光檢測(cè)Iba-1和P2X4受體表達(dá)石蠟切片常規(guī)脫蠟水化，用檸檬酸組織抗原修復(fù)液進(jìn)行抗原修復(fù)，免疫染色封閉液封閉10 min，在濕盒中滴加抗Iba-1（1∶200）、P2X4受體（1∶200）的抗體共同孵育，4 ℃冰箱過(guò)夜，PBS洗3次，10 min/次；與熒光標(biāo)記的二抗（1∶200）室溫避光孵育2 h，PBS洗3次，10 min/次；含DAPI抗熒光淬滅封片液封片，觀察并拍照，用Image J分析軟件分析。

對(duì)照組采用常規(guī)護(hù)理，術(shù)前觀察患者腹痛部位，注意是否存在反跳痛等腹膜刺激征；術(shù)后嚴(yán)格要求患者臥床休息，密切觀察生命體征變化及手術(shù)切口愈合情況，及時(shí)更換敷料。

1.2.6 小干擾RNA敲低TAMs中P2X4受體基因表達(dá)在TAMs模型基礎(chǔ)上，將P2X4 siRNA（siRNA P2X4）和對(duì)照siRNA（siRNA NC）與轉(zhuǎn)染試劑充分混合，轉(zhuǎn)染TAMs，不做任何處理的為空白對(duì)照組，通過(guò)Western blot檢測(cè)其干擾效率。P2X4 siRNA由廣州銳博生物科技有限公司設(shè)計(jì)并合成，靶基因序列如下：ACACTCG GGACTTAGAACA。取轉(zhuǎn)染后的siRNA P2X4 組及siRNA NC組細(xì)胞，通過(guò)RT-qPCR及Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后IL-1β、IL-18的mRNA及蛋白表達(dá)量。

1.2.7 Western blot檢測(cè)P2X4受體、IL-1β、IL-18蛋白表達(dá)水平 離心收集細(xì)胞，使用含有蛋白酶抑制劑混合物的RIPA裂解緩沖液提取細(xì)胞總蛋白，用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度，5×上樣緩沖液處理并熱變性蛋白質(zhì)，通過(guò)10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白樣品，隨后轉(zhuǎn)移到0.45 μm PⅤDF膜，5%脫脂牛奶封閉1 h，與P2X4 受體（1∶100）抗體、IL-1β（1∶1000）抗體、IL-18（1∶1000）抗體、GAPDH抗體（1∶5000）室溫孵育1 h，4 ℃冰箱過(guò)夜。隨后，將膜與辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗（1∶500），羊抗兔二抗（1∶3000）（一抗為兔抗鼠IL-1β和兔抗鼠IL-18），羊抗鼠二抗（1∶3000）（一抗為鼠抗鼠GAPDH）；室溫孵育2 h。使用ECL發(fā)光液進(jìn)行顯影，拍照后用Image J軟件分析蛋白條帶的灰度值。

1.2.8 RT-qPCR檢測(cè)TNF-α、iNOS、Arg-1、IL-10、P2X4受體、IL-1β、IL-18的mRNA表達(dá) 離心收集待測(cè)細(xì)胞，提取細(xì)胞的總RNA，核酸蛋白檢測(cè)儀檢測(cè)RNA純度，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA 為模板，進(jìn)行聚合酶鏈擴(kuò)增反應(yīng)，根據(jù)2方法對(duì)結(jié)果進(jìn)行定量分析。引物序列如下：TNF-α（上游：CCCTCACACTCAGATC ATCTTCT，下 游：GCTACGACGTGGGCTACAG）；iNOS（上游：GTTCTCAGCCCAACAATACAAGA，下游：GTGGACGGGTCGATGTCAC）；Arg-1（上游：CT CCAAGCCAAAGTCCTTAGAG，下游：AGGAGCTG TCATTAGGGACATC）；IL-10（上游：GCTCTTACTG ACTGGCATGAG，下游：CGCAGCTCTAGGAGCAT GTG）；P2X4受體（上游：CTGGTGTGCCAACGAGGA ATA，下游：AGACGGAATATGGGGCAGAAG）；IL-1β（上游：GCAACTGTTCCTGAACTCAACT，下游：AT CTTTTGGGGTCCGTCAACT）；IL-18（上游：GACTC TTGCGTCAACTTCAAGG，下游：CAGGCTGTCTTT TGTCAACGA）；GAPDH（上游：AGGTCGGTGTGA ACGGATTTG，下游：TGTAGACCATGTAGTTGAGG TCA）。

進(jìn)一步檢測(cè)IL-1β、IL-18的表達(dá)，結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組及siRNA NC組相比，干擾P2X4降低TAMs中IL-1β、IL-18的mRNA（＜0.01）及蛋白表達(dá)水平（＜0.01，＜0.05，圖7）。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析方法

采用GraphPad Prism 8進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本的檢驗(yàn)及單因素方差分析，兩兩比較行LSD-檢驗(yàn)。0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 荷瘤小鼠腦膠質(zhì)瘤形態(tài)學(xué)觀察

取接種后第21天腦組織觀察，見(jiàn)小鼠腦右側(cè)尾狀核區(qū)有腫瘤形成，色白，腫瘤呈實(shí)性，不規(guī)則，無(wú)包膜，侵入周?chē)X組織，腫瘤中心見(jiàn)出血和壞死，正中線因受腫瘤擠壓向?qū)?cè)移位（圖1A）。光鏡下，可見(jiàn)腫瘤病灶形態(tài)不規(guī)則，邊界不清，周?chē)ＤX組織中可見(jiàn)成團(tuán)腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)，腫瘤組織中血管豐富，可見(jiàn)壞死和出血區(qū)域。膠質(zhì)瘤細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞呈不規(guī)則形或短梭形，核大深染，異型性明顯（圖1B、C）。

2.2 P2X4受體在小鼠膠質(zhì)瘤TAMs中的表達(dá)增加

免疫熒光染色結(jié)果顯示，在小鼠腦膠質(zhì)瘤中，Iba-1（標(biāo)記小膠質(zhì)細(xì)胞及巨噬細(xì)胞）陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯增多，為活化的小膠質(zhì)細(xì)胞及巨噬細(xì)胞，細(xì)胞體積增大，突起增多，與正常腦組織相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.0001，圖2），且P2X4受體在膠質(zhì)瘤Iba-1陽(yáng)性細(xì)胞中的表達(dá)較正常腦組織中增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（=0.001，圖3）。

式中:ainitial和afinal分別是a的初始值和終值。μ是對(duì)數(shù)調(diào)整因子,0<μ> <1稱(chēng)為對(duì)數(shù)壓縮因子,算法的搜索范圍相對(duì)上移;μ>1稱(chēng)為對(duì)數(shù)膨脹因子,算法的搜索范圍相對(duì)下移。μ=1,最后a收斂于afinal,本文中μ=1。μ越小,a遞減越慢,在算法的后期可以進(jìn)行更精細(xì)的局部搜索。在實(shí)際應(yīng)用中,對(duì)不同的優(yōu)化問(wèn)題可以適當(dāng)?shù)恼{(diào)整μ的值。μ

2.3 GL261條件培養(yǎng)基可誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞向M2型TAMs方向轉(zhuǎn)化及P2X4受體表達(dá)增加

電商(商務(wù)秘書(shū))場(chǎng)景實(shí)驗(yàn)室。致力于學(xué)習(xí)中外商務(wù)秘書(shū)教育的先進(jìn)經(jīng)驗(yàn)，加強(qiáng)課程標(biāo)準(zhǔn)建設(shè)，整體優(yōu)化培養(yǎng)方案；在理論學(xué)習(xí)基礎(chǔ)上，強(qiáng)化實(shí)用性、實(shí)踐性場(chǎng)景教學(xué)。

我國(guó)已經(jīng)成為世界紡織服裝大國(guó)，我國(guó)廣大服裝企業(yè)的自主研發(fā)能力、技術(shù)裝備和制造水平已得到世界普遍認(rèn)可，中國(guó)服裝產(chǎn)業(yè)的軟件硬件實(shí)力已具備與發(fā)達(dá)國(guó)家 “賽跑”的基本條件。從紡織服裝大國(guó)到紡織服裝強(qiáng)國(guó)的建設(shè)進(jìn)程中，服裝產(chǎn)業(yè)的整體水平尚有欠缺，在某些前沿性研發(fā)制造領(lǐng)域仍有不足。新一輪的科技革命和產(chǎn)業(yè)變革為服裝行業(yè)的創(chuàng)新突破提供了技術(shù)驅(qū)動(dòng)，面對(duì)發(fā)達(dá)國(guó)家的 “再工業(yè)化”進(jìn)程的壓力，我國(guó)服裝行業(yè)現(xiàn)行的大規(guī)模流水制造系統(tǒng)，如何借助數(shù)字化、智能化、信息化制造技術(shù)，順利實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)效能提升，完成新一輪轉(zhuǎn)型升級(jí)，已經(jīng)成為整個(gè)行業(yè)亟待解決的問(wèn)題。

為進(jìn)一步探討P2X4受體在GL261條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)TAMs中的表達(dá)情況，我們提取細(xì)胞的mRNA和蛋白檢測(cè)P2X4受體表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，無(wú)論在蛋白水平還是mRNA水平，GL261細(xì)胞培養(yǎng)上清能夠誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞中P2X4 受體表達(dá)上調(diào)（0.005、0.014，圖5）。

油田物資供應(yīng)處標(biāo)準(zhǔn)化的第三步是推進(jìn)油田全物料標(biāo)準(zhǔn)化招標(biāo)采購(gòu)工作。本著“決戰(zhàn)步”更穩(wěn)健、效益更長(zhǎng)遠(yuǎn)的目標(biāo)，物資供應(yīng)處計(jì)劃用3年左右的時(shí)間完成油田1024個(gè)小類(lèi)或品種的標(biāo)準(zhǔn)化采購(gòu)工作，總金額達(dá)134億元，使油田真正實(shí)現(xiàn)了全物料、全覆蓋標(biāo)準(zhǔn)化采購(gòu)工作。

2.4 干擾P2X4后對(duì)TAMs中P2X4受體蛋白表達(dá)的影響

Western blot檢測(cè)P2X4受體的表達(dá)，結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組及siRNA NC組相比，干擾P2X4能夠降低TAMs中P2X4受體的蛋白表達(dá)水平（＜0.0001，圖6A、B）。

2.5 干擾P2X4引起TAMs中IL-1β、IL-18的表達(dá)水平降低

1.2.9 GL261細(xì)胞Transwell侵襲及遷移實(shí)驗(yàn) 分別收集siRNA P2X4組和siRNA NC組TAMs的細(xì)胞培養(yǎng)液上清，與DMEM完全培養(yǎng)基按照1∶1配成TAMs條件培養(yǎng)基（CM），分別為CM-siRNA P2X4組及CM-siRNA NC組。選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的GL261細(xì)胞，待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%融合時(shí)，將培養(yǎng)基棄掉，用PBS沖洗2次，更換上述條件培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。分別使用涂覆及未涂覆有Matrigel基質(zhì)膠的Transwell小室進(jìn)行侵襲及遷移實(shí)驗(yàn)，取CM-siRNA P2X4 組及CM-siRNA NC 組各200 μL（2×10）細(xì)胞懸液加入上室，下室加入含10%FBS 的DMEM培養(yǎng)基600 μL，培養(yǎng)24 h；固定染色，于倒置顯微鏡下觀察，高倍鏡（×200）下隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)量。

2.6 干擾TAMs中P2X4受體表達(dá)能抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲和遷移的能力

Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CM-siRNA P2X4組GL261 細(xì)胞的侵襲能力低于CM-siRNA NC 組（=0.004，圖8）。Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CM-siRNA P2X4組GL261細(xì)胞的的遷移能力低于CM-siRNA NC組（=0.017，圖9）。

從圖2可以看出，隨著迭代的進(jìn)行，數(shù)據(jù)集的分類(lèi)正確率均有所提升，并快速達(dá)到收斂.ICSA-ECOC編碼方法通過(guò)變異選擇操作對(duì)初始編碼矩陣進(jìn)行局部和全局的搜索，利用數(shù)據(jù)集先驗(yàn)知識(shí)不斷調(diào)整搜索方向，使編碼矩陣逐漸接近最優(yōu)值，促進(jìn)多類(lèi)分類(lèi)器的性能提升.

3 討論

高水平的細(xì)胞外ATP是腫瘤微環(huán)境的特征之一，膠質(zhì)瘤細(xì)胞或膠質(zhì)瘤腫瘤組織中浸潤(rùn)的炎癥細(xì)胞可在機(jī)械損傷、缺氧、壞死及缺血等刺激下，通過(guò)胞吐、細(xì)胞膜通道形成和細(xì)胞溶解等方式向細(xì)胞外釋放大量ATP，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)。高水平的細(xì)胞外ATP還可刺激巨噬細(xì)胞向腫瘤區(qū)域募集，并促進(jìn)炎癥介質(zhì)的分泌，從而啟動(dòng)和維持腫瘤的發(fā)展。ATP通過(guò)激活嘌呤受體P2X離子通道或P2Y蛋白偶聯(lián)受體介導(dǎo)其信號(hào)作用。以往對(duì)P2X受體在腫瘤中的作用研究多集中于P2X7受體，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)P2X4受體在肝癌、膠質(zhì)瘤、前列腺癌、胃癌腫瘤細(xì)胞上表達(dá)和發(fā)揮作用。但對(duì)P2X4受體在腫瘤相關(guān)免疫細(xì)胞中作用的研究報(bào)道較少，有研究發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)移性非小細(xì)胞肺癌患者支氣管肺泡灌洗液的炎癥細(xì)胞中P2X4水平升高，P2X4受體在前列腺癌大多數(shù)CD68巨噬細(xì)胞中表達(dá)，P2X4受體在大鼠C6膠質(zhì)瘤中的巨噬細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞高表達(dá)，但其在腫瘤相關(guān)免疫細(xì)胞中表達(dá)的具體作用及其機(jī)制尚有待于進(jìn)一步研究。

本研究通過(guò)顱內(nèi)原位注射小鼠膠質(zhì)瘤GL261細(xì)胞建立小鼠膠質(zhì)瘤模型，并經(jīng)Iba-1、P2X4受體免疫熒光檢測(cè)，結(jié)果顯示，正常組小鼠腦組織中Iba-1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量較少，而腫瘤組膠質(zhì)瘤組織中有較多數(shù)量的Iba-1陽(yáng)性細(xì)胞浸潤(rùn)，P2X4受體在小鼠膠質(zhì)瘤Iba-1陽(yáng)性細(xì)胞中的表達(dá)上調(diào)，提示P2X4受體可能在腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮一定的作用。

TAMs具有高度可塑性，根據(jù)環(huán)境不同可極化為M1型和M2型，M1型TAMs表達(dá)高水平的促炎性因子（如TNF-α）和誘生型一氧化氮合酶（iNOS）等，具有促進(jìn)Th1的應(yīng)答以及殺腫瘤能力；M2型TAMs具有促進(jìn)組織修復(fù)和重塑、促進(jìn)Th2的免疫應(yīng)答及腫瘤進(jìn)展的作用，并產(chǎn)生Arg-1、IL-10等。神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的巨噬細(xì)胞多表現(xiàn)出M2樣表型。本研究使用GL261條件培養(yǎng)基刺激RAW264.7細(xì)胞轉(zhuǎn)化為T(mén)AMs，檢測(cè)巨噬細(xì)胞極化相關(guān)標(biāo)志物基因表達(dá)，結(jié)果顯示，處理后RAW264.7中M2 型巨噬細(xì)胞標(biāo)志基因Arg-1、IL-10 表達(dá)明顯上調(diào)，M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志基因iNOS、TNF-α表達(dá)也上調(diào)，但以M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志基因Arg-1、IL-10表達(dá)上調(diào)更為顯著，同時(shí)P2X4受體表達(dá)上調(diào)，說(shuō)明在腫瘤中，巨噬細(xì)胞經(jīng)腫瘤馴化后，主要向M2型TAMs轉(zhuǎn)化，P2X4受體也隨之明顯增高。使用P2X4 siRNA轉(zhuǎn)染下調(diào)TAMs中P2X4受體的蛋白表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)TAMs促進(jìn)膠質(zhì)瘤侵襲和遷移的能力也隨之減弱，提示TAMs上P2X4受體的表達(dá)可能參與了膠質(zhì)瘤的侵襲和遷移行為的調(diào)控。

另外，有些行政機(jī)關(guān)出于部門(mén)利益或者個(gè)人利益的需要，往往將已受理的案件在構(gòu)成犯罪的情況下，并不移送相關(guān)部門(mén)，而只是將其作為一般的違法案件處理，此做法不僅浪費(fèi)了寶貴的案件線索，而且放縱了商業(yè)賄賂犯罪。因此在治理商業(yè)賄賂的過(guò)程中，提供線索的材料少、質(zhì)量差，是亟需解決的問(wèn)題。

膠質(zhì)瘤中腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞作用的發(fā)揮與其表面多種受體密切相關(guān)，其中嘌呤受體對(duì)于識(shí)別ATP信號(hào)起重要作用。細(xì)胞外ATP能夠通過(guò)激活P2X4受體導(dǎo)致NLRP3炎性小體的活化，引起炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)以及IL-1β、IL-18的成熟和分泌。有研究顯示，IL-1β可促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。TAM釋放IL-1β，通過(guò)上調(diào)甘油3-磷酸脫氫酶的表達(dá)來(lái)促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的代謝，從而促進(jìn)糖酵解，加速腫瘤的增殖和生長(zhǎng)。研究發(fā)現(xiàn)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞可以分泌纖維粘連蛋白和玻璃粘連蛋白，從而促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，激活的小膠質(zhì)細(xì)胞又能分泌大量的IL-18，后者作為IL-1家族的一員，又能進(jìn)一步促進(jìn)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移。本研究用P2X4 siRNA干擾導(dǎo)致TAMs中P2X4受體表達(dá)下調(diào)，同時(shí)IL-1β、IL-18的表達(dá)也下調(diào)。因此，我們推測(cè)，TAMs中的P2X4受體有可能通過(guò)IL-1β、IL-18調(diào)控膠質(zhì)瘤腫瘤微環(huán)境，進(jìn)一步影響膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展。

由于腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞從多方面參與腫瘤微環(huán)境的調(diào)控，對(duì)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞調(diào)控機(jī)制更精確的把控將有利于針對(duì)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的腫瘤免疫治療的開(kāi)展。P2X4受體對(duì)于調(diào)控膠質(zhì)瘤腫瘤微環(huán)境具有一定的作用，為膠質(zhì)瘤的靶向治療提供了新的可能。