乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一。臨床上通過腫瘤細胞的雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）、人類表皮生長因子受體－2（HER2）和Ki67增殖指數(shù)將乳腺癌患者分為4 種類型：Luminal A 型（ER+、PR+、HER2-），Luminal B型（ER+、PR+、HER2+），HER2過表達型（ER-、PR-、HER2+）和三陰性乳腺癌（ER-、PR-、HER2-）。在乳腺癌患者中，HER2陽性的患者約占到20%～30%。相較于其他類型的乳腺癌，HER2陽性乳腺癌進展速度更快、惡性程度更高，同時也更容易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，預(yù)后情況相對較差。針對HER2的靶向治療，無論是針對胞外結(jié)構(gòu)域的單克隆抗體類；如曲妥珠單抗、帕妥珠單抗及抗體－藥物結(jié)合體T-DM1，還是針對胞內(nèi)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的酪氨酸激酶抑制劑；如拉帕替尼、諾拉替尼及阿法替尼等，都能有效地降低死亡風(fēng)險或復(fù)發(fā)風(fēng)險。但在靶向治療中還是4位患者中就有一位會復(fù)發(fā)，研究表明聯(lián)用結(jié)合HER2不同部位的帕妥珠單抗及選用抗體－藥物結(jié)合體T-DM1可進一步提高療效，但部分患者原發(fā)性的耐藥以及大部分患者治療1年左右出現(xiàn)繼發(fā)性耐藥，仍然成為治療的瓶頸。

糖尿病與乳腺癌的發(fā)生有著復(fù)雜的關(guān)系?；继悄虿〉呐耘c沒有糖尿病的女性相比，前者患乳腺癌的風(fēng)險增加15%～20%，二甲雙胍作為臨床治療2型糖尿病的常用降糖藥，在多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)具有一定的抗腫瘤作用，例如胃癌、食道癌和肺癌。尤其在乳腺癌中，大量數(shù)據(jù)分析表明，二甲雙胍能顯著降低乳腺癌的發(fā)病風(fēng)險，延長乳腺癌患者的生存時間。其機制可能與二甲雙胍可降低乳腺癌合并糖尿病患者的血糖水平，改善患者胰島素抵抗，發(fā)揮抑癌作用有關(guān)，另外，也有研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍還可以直接作用于乳腺癌細胞株MCF7，下調(diào)mTOR 信號通路，影響其增殖和遷移。盡管如此，二甲雙胍對不同類型乳腺癌細胞株的作用和機制并不完全清楚，本研究檢測二甲雙胍對HER2陽性乳腺癌細胞株SKBR3增殖和凋亡的影響，并探討其機制。

1 材料和方法

1.1 細胞培養(yǎng)

人HER2 陽性乳腺癌細胞株SKBR3 購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心（美國馬里蘭州洛克維爾ATCC）。用含有10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)，置于37 ℃、5%CO的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。0.25%胰蛋白酶消化傳代，每3 d傳代1次，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。

1.2 細胞活力測定

SKBR3細胞以5000/孔的細胞密度接種在96孔板上，每孔150 μL培養(yǎng)基。分為3組，空白組：未接種細胞，僅加入DMEM高糖完全培養(yǎng)基；對照組：接種細胞且常規(guī)培養(yǎng)；二甲雙胍（Solarbio，中國）組：分別用0、20、40、60、80、100、120 μmol/L二甲雙胍處理并孵育24、48、72 h。使用CCK8試劑（Solarbio，中國）在檢測吸光度，與空白相比，根據(jù)值計算細胞活力。每個處理條件重復(fù)4次，每次至少3個重復(fù)孔。IC使用GraphPad Prism軟件計算。

綜上所述，當(dāng)前我國的環(huán)境污染以及土地資源的利用問題比較嚴(yán)重，人們應(yīng)該引起足夠的重視。在經(jīng)濟快去發(fā)展的今天，人們生活水平不斷提高，但這種現(xiàn)象應(yīng)該是可持續(xù)發(fā)展的，所以相關(guān)部門應(yīng)該注意在經(jīng)濟建設(shè)的發(fā)現(xiàn)過程中注意環(huán)境的保護，重視土地資源可持續(xù)發(fā)展，實現(xiàn)經(jīng)濟的持續(xù)、健康的發(fā)展。

1.3 單細胞集落形成試驗

張員外的一家老小都上了天。眾位神仙早在南天門外等候，請張員外當(dāng)老天爺，他推辭不了，從此就當(dāng)上了老天爺，這就是張玉皇。他的七個閨女就成了七仙女了。張玉皇也遇到了麻煩事：種田的要雨，賣菜的要曬蔥，撐船的要風(fēng)，種果樹的要露水。張玉皇一聽，就下了一道圣旨：“黑夜下雨白天晴，夜?jié)睬f稼日曬蔥。果樹園里降甘露，河里刮風(fēng)催帆行?！?/p>

1.4 流式細胞術(shù)分析細胞凋亡和周期分布

實驗分組如下：對照組，常規(guī)培養(yǎng)；實驗組，給予不同濃度（0～100 μmol/L）二甲雙胍的DMEM 高糖完全培養(yǎng)基。收集各組細胞，通過使用補充有蛋白酶抑制劑（Thermo Fisher Scientific）的RIPA 緩沖液從細胞中提取總蛋白。等量的蛋白通過10%SDS-PAGE分離并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜（PⅤDF）（Millipore）。所用一抗為YAP（1∶1000;Abways）TAZ（1∶1000 稀釋度；Proteintech），二抗為HRP偶聯(lián)的抗鼠抗兔IgG（PⅤ-9000；北京中山金橋）。使用ECL檢測試劑（PerkinElmer）觀察蛋白質(zhì)條帶。

1.5 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）反應(yīng)

使用SPSS22.0軟件（SPSS，Inc，芝加哥，伊利諾伊州，美國）進行統(tǒng)計分析。定量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組均數(shù)間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD方法，＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.6 蛋白質(zhì)印跡

取對數(shù)生長期的SKBR3細胞，以5×10/孔細胞接種于6孔板各孔中，每孔3 mL培養(yǎng)基。分成2組：對照組：常規(guī)培養(yǎng)；實驗組，給予含終濃度96.25 μmol/L二甲雙胍的DMEM高糖完全培養(yǎng)基。48 h后，使用0.25%胰酶將其消化成單細胞懸液，PBS緩沖液800 r/min離心5 min，棄上清，重復(fù)2次。重懸細胞于500 μL PBS（pH7.2）緩沖液中，緩慢加入500 μL預(yù)冷75%乙醇，4 ℃固定并保存。若檢測細胞凋亡，離心棄去固定液，3 mL PBS重懸5 min，1000 r/min離心5 min，棄去PBS，加入Annexin Ⅴ-熒光素（FTIC）/碘化丙啶（PI）染液雙染后上機；若檢測周期，1500 r/min離心5 min，棄上清，3 mL的PBS洗滌1次，加入400 μL PI和100 μL RNase A，4 ℃避光孵育過夜，流式細胞儀進行細胞周期檢測。

不斷更新發(fā)展的技術(shù)對現(xiàn)代人類社會的沖擊和影響，是前所未有的。日新月異的生活源于科學(xué)技術(shù)的不斷創(chuàng)新。金融科技行業(yè)是近幾年最具發(fā)展前景的行業(yè)之一。正如經(jīng)濟學(xué)家楊濤先生所說：“金融科技能夠使我們看到新金融的活力與魅力，我們應(yīng)該重新審視金融科技?！眳^(qū)塊鏈技術(shù)作為金融科技的一員，廣受全球各國各行業(yè)的追捧，由于其去中心化、匿名性、自治性、數(shù)據(jù)不可篡改、透明性的特點，突破了以往的信任體系，該技術(shù)的應(yīng)用場景也不斷被挖掘拓寬，涉及到金融領(lǐng)域、實體經(jīng)濟領(lǐng)域的方方面面。該技術(shù)更是可以與包括大數(shù)據(jù)、人工智能、物聯(lián)網(wǎng)等技術(shù)相融合應(yīng)用。各個國家的政府、投資機構(gòu)都大量投入資金用于區(qū)塊鏈在各領(lǐng)域的應(yīng)用研究。

1.7 免疫熒光實驗

纖連蛋白的相對表達量從1.053降低到0.893，N－鈣粘蛋白的相對表達量從1.017降低到0.603，波形蛋白的相對表達量從1.083降低到0.447，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.05，圖3）。E－鈣粘蛋白（E-cadherin）的相對表達量從0.823升高到1.43，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（＞0.05）。

1.8 統(tǒng)計分析

實驗分組如下：對照組，常規(guī)培養(yǎng)；實驗組，給予含終濃度96.25 μmol/L二甲雙胍的DMEM高糖完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)48 h后，使用RNA Isolation Kit（南京華贊生物科技有限公司）從培養(yǎng)細胞中提取總RNA。使用SYBR Green PreMix HS qPCR Kit（ACCURATE BIOTECHNOLOGY HUNAN CO，LTD）進行實時定量RTPCR。所有實驗3次重復(fù)，并以GAPDH為內(nèi)參。本研究中使用的引物對如下：

2 結(jié)果

2.1 二甲雙胍抑制SKBR3細胞的增殖

流式細胞術(shù)凋亡檢測結(jié)果顯示：對照組的凋亡細胞比例僅為3.92%，而經(jīng)二甲雙胍處理的細胞凋亡比例明顯增多，達到24.5%(圖2A）。與對照組比較，SKBR3細胞經(jīng)二甲雙胍處理后，G1期的細胞比例明顯增多，而G2/M期的細胞比例減少（圖2B）。

表3還表明，在不同分位點上，β的估計值存有比較明顯的差異：第一，不同分位點上，對于不同期貨合約下，β存在明顯差異；第二，隨著分位數(shù)的增大，不同期貨合約下，β有變小的趨勢，由此說明，隨著原油期貨價格的上漲，期貨價格對現(xiàn)貨價格的引導(dǎo)作用不斷下降。

2.2 二甲雙胍促進SKBR3細胞凋亡并影響其細胞周期

與空白對照相比，二甲雙胍以劑量和時間依賴的方式抑制SKBR3細胞的生長，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.01），IC值為96.25 μmol/L（72 h）（圖1A）。克隆形成實驗同樣顯示，隨著二甲雙胍濃度的增加，克隆形成的數(shù)量減少（圖1B）。

2.3 二甲雙胍能夠降低SKBR3細胞中EMT的轉(zhuǎn)錄活性

取對數(shù)生長期的SKBR3細胞，以2×10/孔接種于提前鋪有滅菌爬片的24孔板內(nèi)，待細胞長至70%密度時，對照組常規(guī)培養(yǎng)，加藥組給予終濃度為96.25 μmol/L二甲雙胍，培養(yǎng)48 h后，使用PBS洗2次，4%多聚甲醛固定30 min后，PBS洗3次；0.1%Triton X-100作用30 min，PBS洗3次；山羊血清封閉1 h后，加入一抗抗體（YAP，1∶100），4 ℃孵育過夜；PBS洗3次，室溫加入熒光二抗（1∶100）孵育2 h，避光加入DAPI（每孔10 μL）染核5 min后，PBS洗3次，取出細胞爬片放于滴有抗熒光淬滅劑的載玻片上，熒光顯微鏡下拍照，實驗重復(fù)3次。

將SKBR3細胞接種在6孔板（100/孔）中并使其貼壁過夜。細胞用指定濃度的二甲雙胍處理72 h，并用不含藥物的新鮮培養(yǎng)基替換。在孵育10 d結(jié)束時，將平板用4%多聚甲醛固定并用0.2%結(jié)晶紫染色。

2.4 二甲雙胍下調(diào)了YAP/TAZ的表達

定量PCR檢測結(jié)果顯示二甲雙胍能夠抑制YAP/TAZ mRNA水平的表達，YAP的相對表達量從1.077降低到0.293，TAZ的相對表達量從1.027降低到0.22，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.05，圖4A）。同時，三個主要的YAP/TAZ下游基因EGFR相對表達量從1.013降低到0.47、CTGF 相對表達量從1.027 降低到0.28，CYR61相對表達量從1.04降低到0.13，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.05，圖4B）。Western blot結(jié)果顯示隨著二甲雙胍濃度的增高，SKBR3細胞中YAP和TAZ蛋白水平的表達逐漸降低。當(dāng)二甲雙胍濃度＞80 μmol/L時，YAP和TAZ表達的降低具有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.05，圖4C～E）。

2.5 二甲雙胍處理降低SKBR3細胞中YAP/TAZ的核定位

與對照組相比，二甲雙胍處理后的SKBR3細胞中無論是熒光標(biāo)記的YAP或者TAZ，其熒光的定位更多地聚集于胞漿，而細胞核中熒光的量明顯的減少（圖5）。相對于對照組，實驗組中YAP和TAZ的細胞內(nèi)分布發(fā)生改變，YAP和TAZ更多的分布于胞漿，而核內(nèi)轉(zhuǎn)移減少（圖5）。

為適應(yīng)隱藏層輸入的特點,構(gòu)建短時間輸入序列,通過固定步長來確定時間序列的長度。設(shè)步長取值為L,則模型輸入為

3 討論

本研究中，二甲雙胍以劑量和時間依賴的方式抑制SKBR3細胞的生長，同時克隆形成實驗也證實二甲雙胍處理可抑制乳腺癌細胞克隆的形成，且與劑量成正比。進一步流式細胞術(shù)檢測證實SKBR3細胞經(jīng)二甲雙胍處理后，細胞凋亡比例增加，G1期細胞比例增多，而G2/M期細胞比例減少，提示二甲雙胍能促進SKBR3細胞凋亡，且阻滯細胞在G1期，進而抑制其生長。上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）能將細胞間粘附緊密的不活動上皮細胞轉(zhuǎn)化為獨立的活動間充質(zhì)細胞，其激活在HER-2陽性乳腺癌的不良預(yù)后中起著不可或缺的作用。我們研究發(fā)現(xiàn)二甲雙胍處理能顯著改變上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化特征蛋白的表達。間充質(zhì)蛋白：纖連蛋白、N－鈣粘蛋白和波形蛋白轉(zhuǎn)錄活性的降低以及E－鈣粘蛋白轉(zhuǎn)錄活性的增加。說明二甲雙胍處理能減少HER2陽性乳腺癌細胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。這些結(jié)果和其他文獻中二甲雙胍處理的不同類型的乳腺癌細胞結(jié)果較為一致。

盡管如此，二甲雙胍對乳腺癌細胞作用的機制仍不清楚。YAP/TAZ為Hippo信號通路的兩個主要轉(zhuǎn)錄共激活因子。YAP-Hippo信號通路是由一系列蛋白激酶和轉(zhuǎn)錄因子組成的激酶鏈，從低等動物到高等動物都具有高度的保守性，是一條抑制細胞生長的信號通路。YAP/TAZ的激活，可以使細胞克服接觸抑制，進入一種不受控制的增殖狀態(tài)，導(dǎo)致細胞無限制增殖，同時抑制細胞凋亡，加快腫瘤的惡性發(fā)展。YAP的表達與各種癌癥的預(yù)后不良有關(guān)，YAP可以作為致癌基因在體內(nèi)外促進乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展。近期研究發(fā)現(xiàn)二甲雙胍可通過Hippo通路抑制腫瘤細胞活性。例如，二甲雙胍通過調(diào)節(jié)YAP活性抑制膠質(zhì)瘤細胞干細胞和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，還可以抑制黑色素瘤癌細胞的增殖。本研究，二甲雙胍能顯著降低YAP/TAZ基因的mRNA 和蛋白水平的表達，并且也能降低EGFR、CTGF和CYR61這3個主要的YAP/TAZ下游靶向基因的表達。說明二甲雙胍的處理，可以降低YAP/TAZ的表達，從而抑制下游通路的活性，減輕其促進增殖、抑制凋亡的作用。YAP/TAZ的作用不僅與其表達量相關(guān)，還和其細胞內(nèi)定位有關(guān)。在上游信號因子的作用下,YAP/TAZ磷酸化并停留在細胞質(zhì)中發(fā)生SCFβ-TRCP介導(dǎo)的YAP/TAZ泛素化降解。如果上游信號因子被阻斷或失活，YAP/TAZ 不能被磷酸化，未被磷酸化的YAP/TAZ遷移進入細胞核，并與TEAD等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，促進下游靶基因的表達,從而啟動YAP/TAZ的促增殖和抗凋亡活性，促進細胞增殖。免疫熒光實驗發(fā)現(xiàn)，經(jīng)二甲雙胍處理后，SKBR3細胞中YAP/TAZ的亞細胞定位更多地位于胞漿，而細胞核中的定位減少。表明，二甲雙胍能明顯抑制YAP/TAZ蛋白向細胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)移，從而抑制下游基因的轉(zhuǎn)錄。這些結(jié)果說明二甲雙胍可以有效地調(diào)節(jié)該通路，從而影響細胞的增殖凋亡。

在傳統(tǒng)的Hippo 信號通路中，LATS1/2 直接調(diào)節(jié)YAP/TAZ，促進其胞質(zhì)滯留和蛋白酶體降解。我們研究了二甲雙胍對Hippo信號通路核心成分YAP/TAZ的影響，結(jié)果表明二甲雙胍可降低細胞中YAP/TAZ的表達，抑制其向細胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)移，但并沒有研究YAP/TAZ上游分子與二甲雙胍的關(guān)系以及二甲雙胍是如何調(diào)節(jié)YAP/TAZ表達的改變。除了Hippo信號通路，一些其他通路也可以影響YAP/TAZ。例如，ⅤGLL4可以抑制YAP介導(dǎo)的惡性增殖和腫瘤發(fā)生，從而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制功能。因此，后期實驗中，我們將進一步研究二甲雙胍與Hippo通路的關(guān)系。