全球癌癥報告顯示，結直腸癌的發(fā)病率和死亡率均位列前3，發(fā)病人群還有年輕化的趨勢。結直腸癌患者主要的死亡原因是繼發(fā)的轉移，研究報道轉移性結直腸癌患者5年生存率不足20%。因此，找到對結腸癌具有預后預測價值的生物標志物是研究的重點。

RNA甲基化在癌癥的發(fā)展過程中起著十分重要的地位。隨著RNA測序技術的發(fā)展，許多RNA修飾不斷被發(fā)現(xiàn)，包括5-甲基胞嘧啶、N1-甲基腺苷、N6甲基腺苷、N7-甲基腺苷等。甲基化在結腸癌的適應性免疫中起重要調節(jié)作用，甲基化狀態(tài)的改變能影響結腸癌患者對免疫檢查點抑制劑治療的反應性。此外，結腸癌的甲基化狀態(tài)受腫瘤內(nèi)部缺氧的環(huán)境影響發(fā)生改變，這種變化促進了轉移的發(fā)生。以上研究表明甲基化影響結腸癌的發(fā)生以及結腸癌的腫瘤微環(huán)境。

“編規(guī)”對哪些材料進行限價計費是必須進行研究的，因為它不僅是概（估）算編制的依據(jù)，也是招標投標計價的參考。限價材料種類與工程類別、性質密切相關，不同類別、性質的工程，用到的主要材料及權重是不同的。

lncRNA的甲基化修飾對腫瘤的發(fā)展具有十分重要的影響，研究表明ALKBH5，一種去甲基化酶，通過去甲基化lncRNA NEAT1來促進胃癌的侵襲和轉移。異常的甲基化導致HNF1A-AS1的減少可以通過促進上皮間質轉化行為，導致喉鱗狀細胞癌的惡性進展。體內(nèi)和體外實驗表明METTL14 的敲減能大幅抑制lncRNAXIST的甲基化，從而增強了結腸癌轉移能力。以上研究反映甲基化對lncRNAs的調控對腫瘤的進程起到重要調節(jié)作用。

mG是一種最常發(fā)生在tRNA上的甲基化修飾，有助于維持tRNA的穩(wěn)定性。近來，研究表明mG也影響其他類型的RNA 的穩(wěn)定性。然而mG 對lncRNAs 的影響以及其在結腸癌中發(fā)揮的功能尚無研究報道。本研究根據(jù)TCGA 數(shù)據(jù)庫構建了mGlncRNAs風險模型。隨后評估風險模型對患者臨床病理特征和預后的關系。最后探究風險模型對結腸癌患者微衛(wèi)星不穩(wěn)定性、免疫微環(huán)境及免疫檢查點表達情況的影響，旨在為轉移性結腸癌患者的治療和管理提供一定的指導意義。

1 材料和方法

1.1 結腸組織及實驗試劑

精養(yǎng)是超出一般粗放式和常規(guī)的、依據(jù)科學道理的、與時俱進的行為。從現(xiàn)代汽車養(yǎng)護而言，科學養(yǎng)護就是遵循先檢測(如對發(fā)動機在用油的檢測)，根據(jù)檢測結果實行有針對性的養(yǎng)護方案的養(yǎng)護理念和技術。針對傳統(tǒng)汽車維修而言，精養(yǎng)就是先診斷后維修，從科學檢測、經(jīng)制定科學維修方案、到實施科學工藝，從設計角度、工作原理分析、材料選擇、加工、以數(shù)據(jù)圖形集成和分析、結合經(jīng)驗統(tǒng)籌到精裝配的維修全過程。精養(yǎng)是建立在“人、環(huán)境、設備工具、工藝、流程”等精細化、精致化基礎之上實現(xiàn)的結果。這也就是說我們執(zhí)行的所有工藝標準必須是可量化的，而不只是經(jīng)驗值，所有的標準必須可追溯，既必須是符合國際標準、國家標準或企業(yè)標準。

1.2 數(shù)據(jù)來源及篩選m7G-lncRNAs

單因素及多因素Cox 篩選獨立預后的m7GlncRNAs。根據(jù)多因素Cox結果構建風險模型，風險得分=（風險指數(shù)1*lncRNA1 的表達量）+（風險指數(shù)2*lncRNA2的表達量）+（風險指數(shù)3*lncRNA3的表達量）+……+（風險指數(shù)n*lncRNAn的表達量）。

1.3 構建m7G-lncRNAs風險模型

結合文獻［10］和GSEA 數(shù)據(jù)庫（http://www.gseamsigdb.org/gsea/index.jsp）的GOMF_M7G_5_PPPN_DIPHOSPHATASE_ACTIⅤITY、GOMF_RNA_7MET HYLGUANOSINE_CAP_BINDING、GOMF_RNA_CAP_BINDING基因集，獲取m7G基因。下載TCGA數(shù)據(jù)庫（https://portal.gdc.cancer.gov/）中結腸癌患者的轉錄組數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)，使用Perl 腳本區(qū)分lncRNA 和mRNA。以|Pearson R|＞0.4，＜0.001 篩選mG-lncRNAs，使用“ggalluvial”包繪制共表達?；鶊D。

1.4 驗證m7G-lncRNAs風險模型

根據(jù)風險評分的中位值，將患者分為高危和低危兩組。K-M生存曲線確定兩組間總生存的差異。使用“pheatmap”包繪制風險基因在風險模型中的表達量。使用“SurvivalROC”、“Survival”包繪制ROC 曲線、Cindex及諾莫圖對風險模型進行驗證。同時，分析風險得分與結腸癌患者臨床病理特征的關系，并使用“Survival”包分析風險模型對不同臨床亞組患者預后的預測意義。

1.5 風險模型與結腸癌微衛(wèi)星不穩(wěn)定性和免疫浸潤的聯(lián)系

比較風險得分與結腸癌患者的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性及細胞干性指數(shù)的關系。使用“l(fā)imma”，“org.Hs.eg.db”，“clusterProfiler”和“enrichplot”包分析高低風險組患者在分子水平上的功能差異。使用ESTIMATE分別計算結腸癌患者的基質細胞打分，免疫細胞打分以及總打分。使用CIBERSORT分析結腸癌患者組織中免疫細胞含量。最后使用Pearson相關性分析探究風險得分與免疫細胞含量的相關性。

配對的結腸癌及癌旁正常組織來源于在蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院接受治療的患者（表1）。ATXN2、G3BP1及GAPDH一抗（武漢三鷹生物技術），二抗（武漢愛博泰科生物技術）。蛋白上樣緩沖液、蛋白分子量標準、RIPA裂解液（強）及蛋白酶抑制劑混合物（碧云天生物技術），PAGE凝膠快速制備試劑盒（10%）（上海雅酶生物醫(yī)藥）。所有實驗均通過倫理審查（倫科批字【2020】第238號）。

使用組織剪剪碎病人的組織，PBS清洗2遍。使用RIPA裂解液充分裂解患者組織，離心獲取上清即為蛋白樣品。使用酶標儀計算每個患者的蛋白樣品濃度，并使用RIPA按照濃度最低的樣品統(tǒng)一所有樣品的濃度。按說明書要求加入適量蛋白上樣緩沖液，在沸水中使蛋白變性，然后放入-20 ℃冰箱保存，之后每次使用時重新沸水浴10 min。按說明書配置分離膠和濃縮膠，加入蛋白Marker和蛋白樣品，120 Ⅴ電泳，隨后200 mA轉膜2 h，TBST清洗3次后使用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，TBST洗膜3次，一抗封閉過夜。TBST清洗3次后二抗室溫孵育1.5 h，TBST 再次洗膜后上機顯影。使用ImageJ軟件計算ATXN2、G3BP1和GAPDH的灰度值，使用GAPDH對ATXN2、G3BP1的表達量進行校正，使用配對檢驗比較癌旁組織與癌組織中ATXN2、G3BP1相對灰度值的差異。

所有的統(tǒng)計分析使用R版本4.1.0進行。使用配對檢驗對蛋白印跡結果進行分析；使用Kaplan-Meier曲線比較高低風險組患者的生存；使用多因素Cox分析進行模型的構建及獨立預后分析；相關性分析采用Pearson相關性檢驗。檢驗水準為α=0.05。

1.6 模型lncRNAs調控的分子靶點

以|Pearson R| ＞0.6，＜0.001 篩選出與模型lncRNAs具有共表達關系的分子作為模型lncRNAs參與調節(jié)的靶分子。使用Metascape 在線網(wǎng)站（https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1）繪制靶分子的蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡。使用Cytoscape的cytoHubba插件以Degree值排名前十位的分子作為模型lncRNAs調節(jié)的核心分子。使用TCGA數(shù)據(jù)庫、臨床組織樣本及HPA數(shù)據(jù)庫（https://www.proteinatlas.org/）分析這些核心分子在結腸癌組織及癌旁正常組織的表達情況。

1.7 蛋白印跡實驗

以上兩個實例說明兩個問題，前一事例說明為了診斷的標準化而制定的診斷標準否定了人類疾病的復雜性問題，不考慮臨床醫(yī)生的體格檢查和患者的主訴，而以單一的檢驗結果是否陽性作為考量的標準；后一事例說明，醫(yī)生更傾向于采用客觀的檢查依據(jù)而不采信即使是患者親自訴說的自我感受。兩者的共同點是，隨著科技的進步及現(xiàn)代化檢查設備的廣泛使用，技術至上已成為全社會更加堅信的觀念，人們更加相信客觀的或由儀器表述的結果，而不愿相信主觀的感受，尤其是對經(jīng)驗的分享。

1.8 數(shù)據(jù)分析

其中，pi表示第i個粒子；bj,i表示第i個粒子、第j個基函數(shù)中心；σj,i表示第i個粒子、第j個基函數(shù)的閾值；wj,i表示第i個粒子、第j個輸出權值。將RBF神經(jīng)網(wǎng)絡誤差評價指標，即式(3)所示的均方誤差函數(shù)作為粒子優(yōu)化適應度函數(shù)。

2 結果

2.1 風險模型的構建

TCGA 數(shù)據(jù)庫中提取28 個mG 基因和14 057 個lncRNA 的表達譜數(shù)據(jù)。共發(fā)現(xiàn)1722 個mG 相關的lncRNAs使用?；鶊D對其進行可視化（圖1A）。單因素Cox分析結果表明43個mG-lncRNAs與結腸癌患者的生存顯著相關。多因素Cox分析進一步篩選出12個lncRNAs 并將這些lncRNAs 用于風險模型的構建（表2）。其中AC003101.2、AC005014.2、AC008760.1、AC092944.1、AL1161729.4、AL301422.4、AP001619.1、AP003355.1 和ZEB1-AS1 為高風險lncRNAs，AC025171.4、AC073957.3及TNFRSF10A-AS1為低風險lncRNAs。根據(jù)風險得分的中位值將結腸癌患者分為高低風險兩組。K-M曲線顯示，高風險組患者的總生存期明顯低于低風險組（圖1B）。風險曲線和風險散點圖顯示，隨著風險得分的增高，患者的死亡率也不斷增高（圖1C、D）。風險熱圖顯示風險基因的表達與風險得分的關系（圖1E）。最后，使用Cytoscape構建mG基因與模型lncRNAs的共表達網(wǎng)絡，其中紅色節(jié)點為模型lncRNAs，藍色節(jié)點為mG 基因（圖1F）。使用?；鶊D對模型lncRNAs對結腸癌患者預后的影響及其與mG基因的共表達關系進行可視化（圖1G）。

2.2 風險模型的驗證

本研究進一步分析風險得分與結腸癌患者微衛(wèi)星不穩(wěn)定狀態(tài)的聯(lián)系，結果風險得分較高的患者具有高微衛(wèi)星不穩(wěn)定狀態(tài)（MSS vs MSI-H：=0.034，圖4A、B）。風險得分與結腸癌患者的干細胞指數(shù)呈現(xiàn)負相關關系（圖4C）。GSEA 富集分析顯示高低風險組患者間多數(shù)免疫相關通路存在明顯差異（圖4D、E）。結果表明風險得分與激活的肥大細胞（=-0.11，=0.045）和靜息CD4T細胞（=-0.14，=0.01，圖4F、G）。ESTIMATE結果顯示高風險組患者的基質細胞打分和總打分均較高（圖4H）。多數(shù)免疫檢查點基因在高低風險組患者的表達也存在顯著差異（＜0.05，圖4I）。

2.3 風險得分可以預測結腸癌患者的臨床病理分期和預后

風險得分的高低與結腸癌患者較高的T分期，N分期以及M分期相關（圖3A、B）。同時風險得分也能預測不同亞組如T3～T4期，所有的N分期以及M0期結腸癌患者的預后（圖3D～G）。

將普通顯微鏡的聚光器換成一個特制的、中央有一遮光黑板的暗視野聚光器，使光線不能直接進入視野而造成黑暗的背景；而從聚光器外周射入的光線可使玻片上的細菌因光線散射而發(fā)出亮光，表現(xiàn)為黑色背景中看到發(fā)亮的菌體。暗視野顯微鏡的分辨率是普通顯微鏡的50倍，可觀察到大于0.004 μm的微粒的存在和運動[2]。在病原生物學實驗課上主要用于觀察具有運動能力的、活的、未經(jīng)染色的細菌和螺旋體等。

2.4 風險得分影響患者的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性和免疫微環(huán)境

單因素Cox回歸分析中，風險評分和95%的危險比（HR）分別為1.336和1.246～1.433（＜0.001，圖2A），多因素Cox回歸分析的風險評分和95%的危險比（HR）分別為1.302和1.198～1.414（＜0.001，圖2B）。結腸癌患者1年、3年和5年的ROC值分別為0.727,0.747和0.794（圖2C）。C-index曲線表明，相較于常見的臨床指標，如TNM分期，風險模型對結腸癌患者預后的預測具有更高的敏感性和準確性（圖2D）。接著本研究構建了一個預測患者預后的列線圖（圖2E），列線圖ROC曲線的AUC值為0.794（圖2F），校準曲線顯示諾莫圖對患者1、3及5年生存時間的預測幾乎與實際生存時間一致（圖2G）。

2.5 模型lncRNAs調控多種致癌分子的表達

本研究首先使用Cytoscape的cytoHubba插件篩選模型lncRNAs調節(jié)的核心分子（圖5A）。TCGA數(shù)據(jù)庫表明這些核心分子多數(shù)在結腸癌癌旁和癌組織中存在差異表達（圖5B）。Western blot實驗結果顯示，與癌旁正常組織相比，ATXN2（=0.006）和G3BP1（=0.007）在結腸癌組織中的表達量增高（圖5C～E）。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)多數(shù)的lncRNAs與mG基因存在共表達的關系。隨后，使用與mG 具有共表達關系的lncRNAs 構建了用于預測結腸癌患者預后的風險模型。模 型lncRNAs 中AC003101.2、AP001619.1 和AC008760.1被報道與結腸癌的預后相關。此外，ZEB1-AS1也參與乳腺癌、肝癌、胰腺癌及結直腸癌等多種腫瘤的惡性進展和耐藥。我們使用多種方法進行進一步探究風險模型對結腸癌患者預后的預測作用。K-M曲線顯示高風險組患者的五年生存率明顯高于低風險患者，ROC曲線、C-index曲線、諾莫圖及諾莫圖的校準曲線和ROC曲線進一步驗證了模型的準確性。風險模型還與結腸癌患者的分期分級相關，且對不同臨床亞組結腸癌患者的預后也具有較好的預測作用。

免疫治療在結腸癌的治療中大放異彩，本研究探究了高低風險兩組患者免疫細胞浸潤以及腫瘤微環(huán)境打分的差異。我們發(fā)現(xiàn)高風險組患者的基質細胞打分和總打分均高于高風險患者，這說明高風險患者的腫瘤純度較低。低腫瘤純度與腫瘤的惡性進展，治療耐藥性和預后評估密切相關。這反映了高低風險組患者預后的差異的內(nèi)在原因可能是兩者腫瘤微環(huán)境的不同。微衛(wèi)星是分布人類基因組中包含1～4個堿基對的短串聯(lián)重復DNA序列，微衛(wèi)星不穩(wěn)定被認為是結直腸癌的主要致癌途徑之一，與MSS/MSI-L腫瘤的結腸癌患者相比，MSI-H的結腸癌患者顯著受益于免疫檢查點抑制劑治療。本研究發(fā)現(xiàn)低風險組患者的微衛(wèi)星不穩(wěn)定狀態(tài)更高，同時低風險組患者多種免疫檢查點的表達量更低，以上結果表明低危組患者可能比高風險組患者更得益于免疫檢查點抑制劑治療。

為探究模型lncRNAs參與調節(jié)的功能，我們使用共表達分析以及蛋白蛋白互作網(wǎng)絡篩選出模型lncRNAs 調節(jié)的核心基因。磷酸酶和張力素同源物（PTEN）是一種腫瘤抑制因子，研究報道其丟失可促進結腸癌的惡性進展。靶向結腸癌中的PTEN是一種重要的結腸癌治療策略。SOS1也是結腸癌治療中的重要靶點，研究表明SOS1和MEK的聯(lián)合抑制可能對KRAS 驅動的惡性腫瘤有一定的治療效果。由于ATXN2 和G3BP1 在結腸癌中尚無報道，因此我們對ATXN2和G3BP1進行了臨床樣本的驗證，結果表明此兩者在結腸癌中表達增高，可能與結腸癌的惡性發(fā)展有關。模型的lncRNAs參與多種與結腸癌密切相關的分子的調控，這進一步證實了本研究構建的風險模型在結直腸癌的應用中可能會發(fā)揮重要作用。

由圖6 b)可知，通過數(shù)值計算模擬、Peck公式計算與實地監(jiān)測得到的地表沉降曲線變化趨勢基本一致，均呈 W形分布。其中左線隧洞上方的地表沉降值略大于右線位置，因為左線開挖時，土體應力再次發(fā)生變化，地基進一步發(fā)生沉降，且由于右線通過壁后注漿等支護措施，已基本彌補地層損失，故右線位置二次沉降值略小。同時隨著盾構機向前推進，各測點的沉降值均逐漸增大。

雖然本研究獲得了一定喜人的結果，但本研究也存在一定的不足之處。首先，由于本研究的分析是基于公共數(shù)據(jù)庫的挖掘，因此使用的所有樣本都是回顧性數(shù)據(jù)，故存在一定數(shù)據(jù)選擇的主觀性。此外，需要有更進一步的體內(nèi)體外實驗來探究模型lncRNAs與PTEN及SOS1等分子之間的關系。