崔麗偉， 賈馨雅， 劉俊桃， 胡 平， 徐 軍， 陳威風*

(河南牧業(yè)經(jīng)濟學院，河南鄭州 450046)

敵草隆是兼具內(nèi)吸和觸殺作用的一種苯脲類除草劑，該除草劑主要用于防治禾本科和闊葉雜草。研究表明，敵草隆的濫用會對生態(tài)環(huán)境、人體健康造成威脅，因此在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，對其最大殘留限量有嚴格規(guī)定[1,2]。目前，用于敵草隆檢測的方法主要是色譜法[3 - 6]，該方法雖然可以實現(xiàn)有效測定，但是需要昂貴的儀器，操作繁瑣。此外還發(fā)展了免疫法[7,8]和電化學法[9,10]。其中，電化學法因其具有測定成本低、靈敏度高、響應(yīng)速度快、操作簡便等優(yōu)點，在農(nóng)藥殘留檢測方面具有較大優(yōu)勢，特別是基于分子印跡技術(shù)的電化學傳感器[11,12]。

為了提高分子印跡傳感器的靈敏度，各種納米材料被用于修飾電極表面，以增大電極表面積，提高電子傳遞速率和表面附著能力[13,14]。與傳統(tǒng)的石墨烯基納米材料相比，三維氮摻雜石墨烯(3DNGH)呈現(xiàn)出三維網(wǎng)狀空間結(jié)構(gòu)，具有較大的比表面積，良好的耐腐蝕性和高導電性，是一種理想的電極修飾材料，近年來基于3DNGH修飾的傳感器已被用于食品安全分析檢測[15,16]。本文以石墨粉、Zn(NO3)2和甘氨酸為原料，制備了氧化鋅三維氮摻雜石墨烯(ZnO/3DNGH)，并以其作為電極增敏材料。以鄰氨基苯酚為功能單體，敵草隆為模板分子，通過電聚合法在ZnO/3DNGH修飾的玻碳電極(GCE)表面制備了敵草隆分子印跡電化學傳感器(Diuron-MIP/ZnO/3DNGH/GCE)，并將該傳感器用于實際樣品測定。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

場發(fā)射掃描電鏡(FEI Quanta FEG 250，美國Thermo fisher)；X射線衍射儀(D8 Advance，德國Bruker)；傅立葉變換紅外光譜儀(Nicolet Is10，美國Thermofisher)；電化學工作站(CHI660E，上海辰華儀器有限公司)；冷凍干燥機(IEC1010-1，美國Labconco)。

325目石墨粉(青島華泰潤滑密封科技有限責任公司)；敵草隆、異丙隆、伏草隆、噻蟲胺、聯(lián)苯菊酯(北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司)；甘氨酸、Zn(NO3)2·6H2O、鄰氨基苯酚、N,N-二甲基甲酰胺等試劑均為分析純。實驗用水為超純水。

1.2 實驗方法

1.2.1 ZnO/3DNGH的制備首先采用改良后的Hummers法[17]，分低溫、中溫、高溫三部分合成制備氧化石墨烯(GO)，再以GO、Zn(NO3)2和甘氨酸為原料，采用水熱還原法一步制備ZnO/3DNGH[18]。將100 mg甘氨酸加入至10 mL含有20 mg GO的分散液中，分散均勻后，加入80 mg Zn(NO3)2，再超聲30 min，隨后置于180 ℃反應(yīng)釜中反應(yīng)12 h，反應(yīng)產(chǎn)物洗滌數(shù)次后，采取梯度升溫的方式冷凍干燥48 h，得到固態(tài)ZnO/3DNGH，密封保存。

1.2.2 敵草隆分子印跡傳感器的制備依次用0.3和0.05 μm的Al2O3粉末在麂皮上對玻碳電極(GCE)進行拋光打磨至鏡面后，用超純水超聲沖洗干凈，氮氣吹干，再在其表面滴涂5 μL 2 mg/mL的ZnO/3DNGH分散液，37 ℃自然晾干，即得到ZnO/3DNGH/GCE。將ZnO/3DNGH/GCE置于10 mL含有25 mmol/L的敵草隆，75 mmol/L的鄰氨基苯酚甲醇溶液中，在-0.2～1.0 V間以50 mV/s掃速循環(huán)掃描聚合35圈，用超純水沖洗數(shù)遍，再置于8∶1的甲醇-HAc溶液中，采用電流-時間曲線法，設(shè)置采樣間隔0.1 s，-0.2 V的恒電位洗脫360 s，即得到敵草隆分子印跡傳感器(Diuron-MIP/ZnO/3DNGH/GCE)，如圖1所示。除了不添加敵草隆，非印跡傳感器(NMIP/ZnO/3DNGH/GCE)的制備與印跡傳感器制備方法相同。

圖1 分子印跡傳感器檢測敵草隆原理圖Fig.1 Schematic diagram of detection diuron with molecularly imprinted sensor

1.2.3 電化學測試將傳感器置于含有敵草隆溶液中孵育一定時間后取出，用超純水沖洗表面，然后進行電化學測量。每次測試后都應(yīng)將電極置于洗脫液中進行洗脫，再用超純水沖洗干凈，待繼續(xù)使用。采用三電極體系：GCE(φ=3 mm)或其修飾電極為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，鉑絲為對電極。在含有5.0 mmol/L K3[Fe(CN)6]和0.2 mol/L KCl的探針溶液中進行電化學行為測試。

差分脈沖伏安法(DPV)設(shè)置掃描電位為-0.2～0.6 V，電位增量為0.004 V，振幅為0.05 V，脈沖周期為0.2 s，采樣寬度為0.0167 s。循環(huán)伏安法(CV)設(shè)置掃描范圍為-0.2～0.6 V，掃描速率為0.05 V/s。電化學阻抗法(EIS)設(shè)置頻率范圍為0.1 Hz～100 kHz，振幅為5 mV。

1.2.4 傳感器動力學性能測試將制備好的傳感器放置于含有5.0×10-4mol/L目標物的溶液中進行孵化，每間隔2 min后，在K3[Fe(CN)6] 溶液中進行DPV法檢測，記錄每次檢測的峰電流，依照Langmuir吸附模型，對孵化時間和分子印跡傳感器電流變化值(ΔI)進行動力學曲線擬合[19]。

2 結(jié)果與討論

2.1 ZnO/3DNGH掃描電鏡表征

如圖2A，GO呈現(xiàn)出比較緊密的片層結(jié)構(gòu)，且片層較厚，橫向面積大，有部分褶皺。從圖2B中可看出，ZnO/3DNGH呈現(xiàn)出明顯的成交聯(lián)孔狀的三維結(jié)構(gòu)。從圖2C中可以看到表面附著有ZnO顆粒。從能譜圖中可看出，C元素(圖2D)、N元素(圖2E)及Zn元素(圖2F)在ZnO/3DNGH表面分布均勻，證明了C元素和N元素成功摻入，與上述表征結(jié)果一致。

圖2 GO(A)、ZnO/3DNGH復合材料(B、C)的掃描電鏡(SEM)圖像；ZnO/3DNGH復合材料中C元素(D)、N元素(E)和Zn元素(F)Fig.2 SEM images of GO(A) and ZnO/3DNGH composites(B,C);C element(D),N element(E) and Zn element(F) of ZnO/3DNGH composites

2.2 分子印跡傳感器的電化學行為分析

2.2.1 循環(huán)伏安法分析鄰氨基苯酚與敵草隆的循環(huán)伏安電聚合過程如圖3所示，鄰氨基苯酚與敵草隆可借助氨基和羥基形成弱氫鍵結(jié)合，在0.63 V處有一個十分明顯且不可逆的鄰氨基苯酚的氧化峰。隨著電聚合不斷進行，此氧化峰不斷減小。這是因為在ZnO/3DNGH修飾的GCE表面形成了一層致密并且導電性差的聚合膜，阻礙了底液內(nèi)電子的傳遞。

圖3 敵草隆分子印跡鄰氨基苯酚的電聚合循環(huán)伏安圖Fig.3 Cyclic voltammograms of electropolymerization process of diuron molecularly imprinted o -aminophenol

采用循環(huán)伏安法對傳感器制備過程中，不同修飾電極在背景溶液中的電化學行為進行研究，結(jié)果如圖4所示。由于在GCE表面修飾了比表面積大、導電能力強的ZnO/3DNGH，致使峰電流得到了明顯增加(曲線b到曲線a)；而當致密且不導電的分子印跡膜在電極表面形成并覆蓋于其表面后，極大地阻礙了電子的傳遞，探針離子到達電極表面變得十分困難，因此峰電流急劇變小(曲線a到曲線c)；當模板分子被洗脫后，印跡膜上便留下了具有特異性識別的孔穴作為電子傳遞的通道，響應(yīng)峰電流變大(曲線d)。對非分子印跡膜而言，由于洗脫前后，并未產(chǎn)生印跡位點，故前后電流幾乎不發(fā)生變化(曲線e到曲線f)。以上結(jié)果說明了MIPs已成功制備并覆蓋在電極表面，并且可以對敵草隆產(chǎn)生響應(yīng)。

圖4 不同電極的循環(huán)伏安圖Fig.4 Cyclic voltammograms of different electrodesa.ZnO/3DNGH/GCE;b.bare GCE;c.MIP/ZnO/3DNGH/GCE;d.Diuron-MIP/ZnO/3DNGH/GCE;befor(e) and after(f) elution of NMIP/RGO/GCE.

2.2.2 交流阻抗分析電化學阻抗是表征電極表面電子轉(zhuǎn)移動力學的一種有效方法。高頻區(qū)的半圓直徑代表電荷轉(zhuǎn)移電阻大小，低頻區(qū)的線性范圍描述了擴散過程。如圖5所示，當電極表面修飾ZnO/3DNGH后，與裸GCE(149.13 Ω，曲線b)相比，電阻值明顯變小(70.6 Ω，曲線a)。這時由于ZnO/3DNGH具有較大的比表面積，提高電子傳遞速率。當致密且不導電的分子印跡膜在電極表面形成并覆蓋于其表面后，電極表面的電阻急劇增大(982.7 Ω，曲線c)；洗脫除去模板分子敵草隆后，印跡孔穴出現(xiàn)，電子又有了傳遞的通道，使得電極表面的電阻再次變小(335.42 Ω，曲線d)，阻抗結(jié)果與上述循環(huán)伏安法表征結(jié)果一致。

圖5 不同電極的交流阻抗(EIS)圖Fig.5 EIS diagrams of different electrodesa.ZnO/3DNGH/GCE;b bare GCE;c.MIP/ZnO/3DNGH/GCE;d.Diuron-MIP/ZnO/3DNGH/GCE.

2.3 實驗條件的優(yōu)化

2.3.1 模板分子與功能單體摩爾比的影響模板分子與功能單體比例影響著聚合膜特異性結(jié)合位點的形成。固定敵草隆濃度為25 mmol/L，改變聚合液中敵草隆與鄰氨基苯酚的摩爾比分別為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5，考察其峰電流變化情況。結(jié)果表明，隨著比例的不斷減小，ΔI呈現(xiàn)先增后降的變化趨勢，這可能是由于單體的數(shù)量太少，不能結(jié)合足夠的模板分子。而過量的單體可能占據(jù)了電極表面，使得有效的識別位點減少，不利于背景溶液中探針離子與電極表面的電子傳遞,因而響應(yīng)電流減小。所以選定模板分子與功能單體的最佳摩爾比為1∶3。

2.3.2 電聚合掃描圈數(shù)的影響考察了不同電聚合掃描圈數(shù)對傳感器的性能影響。結(jié)果表明，隨著聚合圈數(shù)的增加，ΔI呈現(xiàn)先增后降的趨勢，35圈時峰電流變化量達到最大值，這可能是由于聚合圈數(shù)過少，使得膜的厚度較薄，產(chǎn)生的印跡位點少；若聚合圈數(shù)過多，膜就會較厚，印跡上去的模板分子易被包埋，難以洗脫，進而影響到傳感器的電流響應(yīng)信號，故35圈為最佳掃描圈數(shù)。

2.3.3 洗脫液體積比與洗脫時間的影響為了考察不同體積比的甲醇-乙酸洗脫液對模板分子洗脫效果的影響，分別選擇甲醇-HAc體積比為6∶4、7∶3、8∶2、8∶1、9∶1進行洗脫。當甲醇-HAc體積比為8∶1時，洗脫前后ΔI最大，表明洗脫效果最好。此外在優(yōu)化后的洗脫液中考察了洗脫時間對傳感器性能的影響，結(jié)果表明，隨著洗脫時間的增加，ΔI變大，說明印跡孔穴逐漸在增多，當洗脫時間超過360 s，ΔI不再有明顯的變化，這表明印跡膜中的敵草隆已全部被洗脫。因此，選擇360 s為最佳洗脫時間。

2.4 傳感器對農(nóng)藥的檢測性能分析

2.4.1 傳感器對敵草隆的識別動力學研究考察了印跡傳感器和非印跡傳感器對敵草隆的識別動力學。如圖6所示：隨著吸附時間增加，印跡傳感器電流變化較為明顯，10 min后趨于穩(wěn)定，而非印跡傳感器峰電流幾乎未發(fā)生變化。這是由于印跡傳感器表面具有特異性空穴所致。依據(jù)平衡時響應(yīng)電流變化值，計算Diuron-MIP/ZnO/3DNGH/GCE對NMIP/ZnO/3DNGH/GCE的印跡因子α為8.188，說明傳感器對目標分子的印跡能力較好。

圖6 Diuron -MIP/ZnO/3DNGH/GCE與NMIP/ZnO/3DNGH/GCE對敵草隆的識別動力學曲線Fig.6 Recognition kinetic curves of diuron at Diuron-MIP/ZnO/3DNGH/GCE and NMIP/ZnO/3DNGH/GCEa.Diuron-MIP/ZnO/3DNGH/GCE；b.NMIP/ZnO/3DNGH/GCE.

2.4.2 傳感器的選擇性實驗選取與敵草隆結(jié)構(gòu)類似的異丙隆(Isoproturon)和伏草隆(Fluometuron)，以及與敵草隆結(jié)構(gòu)差異大的聯(lián)苯菊酯(Bifenthrin)和噻蟲胺(Clothianidin)作為干擾物質(zhì)，將多個傳感器分別浸入相同濃度(0.01 mmol/L)的敵草隆以及干擾物質(zhì)溶液中，采用DPV法觀察其對電流響應(yīng)的變化，計算傳感器吸附前后ΔI，以考察傳感器的選擇性。結(jié)果顯示，敵草隆引起的電流信號變化最大，其次是異丙隆和伏草隆，而聯(lián)苯菊酯和噻蟲胺幾乎沒有影響。這是由于異丙隆與伏草隆是敵草隆的結(jié)構(gòu)類似物，能部分吸附到傳感器上的識別孔穴內(nèi)，而聯(lián)苯菊酯與噻蟲胺與敵草隆結(jié)構(gòu)差異大，不能識別吸附到傳感器孔穴內(nèi)，故引起電流變化小。以上表明本實驗制備的敵草隆分子印跡傳感器的選擇性良好。

2.4.3 敵草隆電流響應(yīng)范圍及工作曲線在優(yōu)化實驗條件下，記錄傳感器吸附不同濃度敵草隆后的DPV信號值，重復測定三次，結(jié)果如圖7所示，吸附前后ΔI與敵草隆在5.0×10-10～5.0×10-5mol/L濃度范圍內(nèi)的對數(shù)呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，線性方程為:ΔI=11.459logc+106，相關(guān)系數(shù)r=0.9959，該方法的檢出限(S/N=3)為4.12×10-10mol/L。

圖7 Diuron-MIP/ZnO/3DNGH在不同濃度的敵草隆溶液中的差分脈沖伏安(DPV)圖Fig.7 DPV of Diuron -MIP/ZnO/3DNGH/GCE in different concentrations of diuron solutionsa→g：0.0×10-10，5.0×10-10，5.0×10-9，5.0×10-8，5.0×10-7，5.0×10-6，5.0×10-5 mol/L.

2.4.4 樣品檢測將上海青搗碎處理后，準確稱取10.0 g，用10.0 mL甲醇振搖提取10 min，離心后取上清液至25 mL容量瓶中，殘渣再加入10 mL甲醇振搖提取10 min，合并上清液，甲醇定容，制得樣品溶液備用。在最佳條件下，采用本方法對樣液進行檢測，未檢測出敵草隆。加標回收實驗結(jié)果見表1，不同加標濃度下的回收率為96.25%～98.28%，相對標準偏差(RSD)<3.8%，說明此方法具有較高的準確度和精密度，可用于實際樣品中敵草隆的檢測。

表1 樣品檢測和加標回收實驗結(jié)果(n=3)

3 結(jié)論

本文構(gòu)建了一種基于三維石墨烯的分子印跡傳感器，與大多數(shù)文獻報道的印跡電化學傳感器相比，該傳感器具有較寬的線性范圍，對模板分子敵草隆具有良好的特異性識別作用，而且重復性和穩(wěn)定性令人滿意，為敵草隆的痕量測定提供了一種基于電化學的快速、靈敏方法。所建方法用于實際樣品測定，加標回收率為96.25%～98.28%，相對標準偏差<3.8%，有望應(yīng)用于實際樣品中敵草隆殘留量的檢測。