范俊楠， 田文娟， 張 鈺， 賀小敏*， 嚴(yán)文佩， 張 蒙， 梁龍飛

(1.湖北省生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心站，湖北武漢 430072；2.湖北省計量測試技術(shù)研究院，湖北武漢 430223；3.湖北省地質(zhì)局地球物理勘探大隊，湖北武漢 430056)

砷是一種廣泛存在于自然界中的類金屬元素，而且不同價態(tài)的砷具有不同的生物毒性。砷會在人體組織中蓄積，引發(fā)慢性砷中毒，繼而引起消化系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、皮膚等病變甚至癌變[1]。砷在地殼中的豐度約為5 mg/kg，我國土壤中砷元素的背景值范圍為2.5～33.5 mg/kg，中位值約9.6 mg/kg[2]。自然界中已發(fā)現(xiàn)的含砷化合物有50多種，它們的生物毒性大小不僅取決于濃度水平，還與其存在的形態(tài)密切相關(guān)。一般來說無機態(tài)砷的毒性較強，但近年來研究發(fā)現(xiàn)，有機態(tài)砷代謝過程中產(chǎn)生的中間體一甲基砷(MMA)、二甲基砷(DMA)也具有一定程度的生物毒性[3]。研究表明，土壤中重金屬總量并不能直接地反映土壤重金屬的生物有效性和環(huán)境效應(yīng)，賦存形態(tài)決定其在土壤中的遷移性、生物可利用性以及毒性[4]。

土壤環(huán)境中有效砷主要是氧化條件下的砷酸根(As(Ⅴ))和還原條件下的亞砷酸根(As(Ⅲ))，以及在土壤微生物的作用下代謝產(chǎn)生的MMA、DMA、砷甜菜堿(AsB)、砷膽堿(AsC)等[5]。各形態(tài)富集砷在土壤中的移動轉(zhuǎn)化、生物毒性及生物有效性在很大程度上取決于其在土壤環(huán)境中的存在形態(tài)，所以對土壤中砷的形態(tài)及其轉(zhuǎn)化、土壤中砷形態(tài)分析方法的研究也尤為重要和迫切。采用分離富集技術(shù)和特征元素檢測技術(shù)聯(lián)用，以達(dá)到不同形態(tài)砷的檢測目的是有效砷形態(tài)檢測方法的發(fā)展趨勢。高效液相色譜法與電感耦合等離子質(zhì)譜(HPLC-ICP-MS)聯(lián)用技術(shù)，具有靈敏度高、檢出限低、線性范圍寬等優(yōu)點，近年來成為元素形態(tài)檢測主要手段之一，但在實際的應(yīng)用中，因儀器設(shè)備價格昂貴、操作復(fù)雜、對檢測樣品要求較高等原因，使其在應(yīng)用和推廣上受到了一定的限制。高效液相色譜法與原子熒光光譜(HPLC-AFS)聯(lián)用技術(shù)檢測有效砷形態(tài)的靈敏度、檢出限具有與HPLC-ICP-MS基本相當(dāng)甚至更優(yōu)，同時還具有儀器價格低廉，操作簡便、樣品基體干擾小等優(yōu)點，在有效砷形態(tài)檢測領(lǐng)域更容易被應(yīng)用和推廣。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

HPLC-AFS聯(lián)用儀(聚光科技(杭州)股份有限公司)，配SAP-50-LC型形態(tài)分析液相色譜裝置、AFS-9330型原子熒光光度計、Autosampler5500型自動進(jìn)樣器；UPR-11-20L型超純水器(四川優(yōu)普超純科技有限公司)；THZ-C型臺式恒溫振蕩器(太倉市華美生化儀器廠)；JA1103N型電子天平(上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司)。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：As(Ⅲ)標(biāo)準(zhǔn)溶液(1.011 μmol/g，以As計)；As(Ⅴ)標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.233 μmol/g，以As計)；MMA標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.335 μmol/g，以As計)；DMA標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.706 μmol/g，以As計)，均購自于中國科學(xué)計量研究院。HCl、KOH、KBH4、KH2PO4、(NH4)2HPO4、NH3·H2O、甲酸等試劑均為分析純，購自于國藥集團藥業(yè)股份有限公司。實驗用水滿足國家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 6682-2008)中一級水要求。

1.2 樣品制備與測試

按照(HJ/T 166-2004)《土壤環(huán)境監(jiān)測技術(shù)規(guī)范》，分別在湖北省荊門市和恩施州采集篩選出5個不同pH和砷含量的土壤樣品，樣品代號為SMP01～SMP05。采樣點位信息如下：SMP01(E112.66455,N31.16211)、SMP02(E112.65673,N31.20746)、SMP03(E109.77970,N30.17884)、SMP04(E112.29111,N31.42062)、SMP05(E109.57111,N30.28861)。采集的土壤樣品經(jīng)自然風(fēng)干后，研磨過60目篩，儲存于棕色磨口玻璃瓶中，備用。

按照(HJ 962-2018)《土壤pH值的測定 電位法》測定土壤樣品pH值。稱取土壤樣品1 g(精確到0.001 g)于15 mL離心管中，根據(jù)測定的土壤樣品pH值，加入預(yù)先用50%HCl或280 g/L KOH溶液進(jìn)行調(diào)節(jié)好pH的KH2PO4溶液10 mL，于恒溫振蕩器上以25±5 ℃、210±10 r/min振蕩提取120 min，再以3 000 r/min離心15 min，取上清液過0.45 μm濾膜后進(jìn)行測定。以目標(biāo)化合物的色譜保留時間定性，外標(biāo)法定量。

1.3 儀器條件

液相色譜條件：Hamoltion PRP-X100陰離子交換柱(250 mm×4.1 mm i.d.,10 μm)；流動相為(NH4)2HPO4溶液(1.725 g/L,pH=6.0±0.2)；等度洗脫；流速為1.0 mL/min；進(jìn)樣體積為100 μL。

原子熒光光譜條件：空心陰極燈負(fù)高壓為280～320 V，總電流為80～100 mA，輔陰極電流為40～50 mA；載氣流量為400 mL/min；屏蔽氣流量為600 mL/min；原子化器高度為8 mm；原子化器溫度為200 ℃；載流為7%HCl；還原劑為20 g/L KBH4溶液，KOH溶液濃度為5 g/L。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取條件選擇

土壤中有效砷的提取以提取水溶態(tài)和可交換態(tài)的含砷化合物為主。研究表明，水溶態(tài)的有效砷提取采用水∶甲醇(9∶1,V/V)或中性鹽溶液(如KCl溶液)等；可交換態(tài)的有效砷，不同樣品類型中有效砷的提取液有HCl、H3PO4、NaHCO3、Na2HPO4-KH2PO4、KH2PO4、KOH等溶液[6 - 10]。參考地方標(biāo)準(zhǔn)(DB35/T 1459-2014)《酸性土壤中有效砷、有效汞的測定 原子熒光法》，酸性土壤有效砷的提取液采用KH2PO4溶液，pH值在6.5～7.0的土壤也可參考使用[11]。對于pH>7.0的堿性土壤，實驗考察了68.0 g/L的上述提取液，對預(yù)先加入了有效砷混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的土壤樣品SMP04(pH=7.19)和SMP05(pH=8.20)，加標(biāo)濃度為0.5、5.0、10.0 mg/kg。按“1.2”、“1.3”進(jìn)行試樣制備與測試，各提取液對有效硒形態(tài)提取回收率平均值見圖1。結(jié)果表明：提取液KH2PO4溶液對土壤樣品有效砷形態(tài)提取效果優(yōu)于其它提取液，回收率范圍為62.7%～107%。其中，As(Ⅲ)的提取回收率范圍為62.7%～86.7%、DMA為70.0%～89.7%、MMA為72.0～87.6%、As(Ⅴ)為86.3%～107%。

圖1 不同提取液條件下有效砷形態(tài)平均回收率Fig.1 The average recovery of four arsenic species under different extraction conditions

土壤有效砷形態(tài)之間會隨著pH值的變化而相互轉(zhuǎn)化，提取液pH值調(diào)節(jié)對有效砷形態(tài)分析至關(guān)重要。提取液的pH選擇應(yīng)該保證在提取過程中不改變有效砷形態(tài)間的價態(tài)轉(zhuǎn)化，以滿足提取液的pH對不同酸堿度的土壤適用性，提取液的pH應(yīng)與土壤的酸堿度盡可能的保持一致。實驗考察了調(diào)節(jié)提取液的pH值，對預(yù)先加入了1.0 μg有效砷混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的SMP01～SMP05號土壤樣品按“1.2”、“1.3”進(jìn)行試樣制備與測試。結(jié)果表明：未調(diào)節(jié)pH值的提取液相較于調(diào)節(jié)了pH的提取液對樣品提取回收率變化在-9.6%～2.7%，提取液pH值的調(diào)節(jié)對As(Ⅴ)的提取效果的影響較其它組分明顯。對于不同酸堿度的土壤，當(dāng)土壤pH<4.0時，調(diào)節(jié)提取液pH至4.0；土壤pH為4.0～5.0時，調(diào)節(jié)提取液pH至5.0；土壤pH為5.0～6.0時，調(diào)節(jié)提取液pH至6.0；土壤pH為6.0～7.0時，調(diào)節(jié)提取液pH至7.0；土壤pH為7.0～8.0時，調(diào)節(jié)提取液pH至8.0；土壤pH>8.0時調(diào)節(jié)提取液pH至9.0。

2.2 儀器條件選擇

2.2.1 色譜柱和流動相有效砷形態(tài)檢測采用的液相色譜柱主要有C18和離子交換兩種色譜柱，都能實現(xiàn)As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、MMA、DMA 4種有效砷形態(tài)完全分離。但相比而言，離子交換柱對有效砷形態(tài)的分離效果優(yōu)C18色譜柱，有效砷形態(tài)在陰離子交換柱的保留時間穩(wěn)定，基線響應(yīng)低[12,13]。本文參考國家標(biāo)準(zhǔn)(GB5009.11-2014)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中總砷及無機砷的測定》[14]，采用陰離子交換柱Hamoltion PRP-X100(250 mm×4.1 mm i.d.,10 μm)，以1.725 g/L的(NH4)H2PO4為流動相。

2.2.2 流動相pH值在不同pH值流動相條件下，有效砷形態(tài)的分離情況差異明顯。實驗考察了以1.725 g/L的(NH4)2HPO4為流動相，用甲酸或NH3·H2O調(diào)節(jié)pH分別為5.0、6.0、7.0、8.0，對50 μg/L有效砷形態(tài)的分離和檢測信號響應(yīng)情況。結(jié)果表明：當(dāng)pH<5.0時，As(Ⅲ)和DMA不能完全分離，隨著pH的增高，As(Ⅲ)和As(Ⅴ) 的保留時間基本不變，DMA的保留時間緩慢增加，MMA的保留時間緩慢縮短，當(dāng)pH值為6.0時，4種有效砷形態(tài)基線分離達(dá)到最佳，且檢測信號基本達(dá)到峰值(圖2)，這與韋麗麗等[15]、孟春英等[16]在類似的研究中流動相pH值分別選擇5.8和6.0的研究結(jié)果基本一致。

圖2 不同pH值流動相條件下有效砷檢測信號Fig.2 Four arsenic species detection signal in mobile phase with different pH

2.2.3 KBH4溶液濃度KBH4溶液濃度會影響氣態(tài)氫化物產(chǎn)率、基線噪音和漂移，進(jìn)一步影響有效砷形態(tài)檢測靈敏度。本文考察了KBH4溶液分別為10、15、20、25 g/L條件下對50 μg/L的有效砷形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)溶液檢測情況(圖3)。結(jié)果表明：隨著KBH4濃度增大，氣態(tài)氫化物產(chǎn)率增大，檢測信號響應(yīng)和信噪比也增大，當(dāng)KBH4溶液大于20 g/L時，基線噪音和漂移增大，還原反應(yīng)生成大量的氫氣稀釋了氣態(tài)氫化物濃度，檢測靈敏度降低，造成有效砷形態(tài)檢測信號減小。相關(guān)研究表明土壤和水產(chǎn)品中的砷形態(tài)檢測中KBH4溶液一般約15～20 g/L[13 - 17]；食品和中藥材樣品一般約30 g/L[13]，不同類型樣品砷形態(tài)檢測使用的KBH4溶液濃度有一定差異。

圖3 不同KBH4濃度條件下有效砷檢測信號Fig.3 Four arsenic species detection signal under different KBH4 concentration conditions

2.2.4 HCl濃度HCl為有效砷形態(tài)檢測提供生成活性氫的H+，HCl濃度會影響氣態(tài)氫化物產(chǎn)率。本文考察了HCl溶液體積分?jǐn)?shù)分別為5.0%、7.0%、9.0%、10%條件下對50 μg/L的有效砷形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)溶液檢測情況(圖4)。結(jié)果表明：隨著載流HCl溶液體積分?jǐn)?shù)的增加，有效砷形態(tài)檢測信號響應(yīng)增大，當(dāng)HCl溶液體積分?jǐn)?shù)大于7%時，有效砷形態(tài)檢測信號響應(yīng)無明顯增大變化，還原反應(yīng)所需的H+趨于飽和。相關(guān)研究表明土壤和水產(chǎn)品中的砷形態(tài)檢測中HCl溶液體積分?jǐn)?shù)一般約7%～10%[13,16,17]，食品和中藥材樣品一般約20%[14,18]，不同類型樣品砷形態(tài)檢測使用的HCl溶液濃度也存在一定差異。

圖4 不同HCl濃度條件下有效砷檢測信號Fig.4 Four arsenic species detection signal under different HCl concentration conditions

2.3 校準(zhǔn)曲線及檢出限

配制含As(Ⅲ)、DMA、MMA、As(Ⅴ)的標(biāo)準(zhǔn)溶液系列，依次均為0、20、40、60、80、100 μg/L，濃度由低至高的順序按照“1.3”儀器條件測定，以濃度為橫坐標(biāo)，熒光響應(yīng)信號的峰高(或峰面積)為縱坐標(biāo)，繪制校準(zhǔn)曲線，計算校準(zhǔn)曲線方程及相關(guān)系數(shù)(表1)。依據(jù)(HJ 168-2020)《環(huán)境監(jiān)測 分析方法標(biāo)準(zhǔn)制修訂技術(shù)導(dǎo)則》，實驗室空白樣品中未檢測出目標(biāo)物質(zhì)可采用樣品加標(biāo)，加標(biāo)濃度為估算檢出限的2～5倍，按照樣品分析的全部步驟測定7次，計算方法檢出限(表1)。

表1 4種有效砷形態(tài)的保留時間、校準(zhǔn)方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限

2.4 方法精密度和準(zhǔn)確度

對土壤樣品SMP01～SMP05添加0.5 mg/kg、5.0 mg/kg、10.0 mg/kg不同濃度的有效砷形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)樣品，按照“1.2”試樣制備與測試和“1.3”儀器條件進(jìn)行測定，計算6次平行測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)和加標(biāo)回收率(表2)。實驗結(jié)果表明：4種有效砷形態(tài)實驗室內(nèi)RSD范圍為1.8%～17.2%，加標(biāo)回收率范圍為62.7%～107%。

表2 4種有效砷形態(tài)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差和加標(biāo)回收率(n=6)

2.5 樣品測試

根據(jù)(GB/T22105.2-208)《土壤質(zhì)量總汞、總砷、總鉛的測定原子熒光法》和(DB35/T 1459-2014)《酸性土壤中有效砷、有效汞的測定 原子熒光法》測定土壤樣品SMP01～SMP05總砷和有效砷含量；按照“1.2” 試樣制備與測試和“1.3”儀器條件測定有效砷形態(tài)含量，結(jié)果見表3。土壤樣品SMP01～SMP05中有效砷占總砷含量的24.1%～39.8%。土壤有效砷形態(tài)以As(Ⅴ)為主，占有效砷含量的66.6%～80.1%；As(Ⅲ) 含量水平與檢出限相當(dāng)，約占有效砷含量的3.0%，甚至更低；DMA和MMA均未檢出。

表3 土壤樣品中4種有效砷形態(tài)測定結(jié)果(mg/kg)

3 結(jié)論

建立了高效液相色譜-原子熒光光譜法測定土壤中亞砷酸根、二甲基砷、一甲基砷和砷酸根4種有效砷形態(tài)。方法操作簡便，靈敏度、精密度和準(zhǔn)確度均能滿足土壤有效砷形態(tài)檢測質(zhì)量控制與保證要求，在實際應(yīng)用中值得推廣。