萬(wàn)嘉峻， 孟凡華， 代先東， 范崇旭， 曹 瑛*

(國(guó)民核生化災(zāi)害防護(hù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102205)

海洋生物貝類毒素特指由海洋生物產(chǎn)生、能夠在海洋生物尤其是雙殼貝類中富集的一類小分子有毒化學(xué)物質(zhì)[1]，可對(duì)其他生物包括人類產(chǎn)生危害。這類海洋生物貝類毒素根據(jù)其溶解性可分為水溶性貝類毒素和脂溶性貝類毒素，其中脂溶性貝類毒素主要為含聚醚結(jié)構(gòu)的化合物，具有一定的熱穩(wěn)定性，易溶于甲醇、乙醚等有機(jī)溶劑[2]。目前，常見(jiàn)的脂溶性貝類毒素主要有大田軟海綿酸毒素(Okadaic Acid,OA)，以及其衍生物鰭藻毒素(Dinophysistoxin,DTX)組、蝦夷扇貝毒素(Yessotoxin,YTX)組、原多甲藻酸毒素(Azaspiracid,AZA)組、蛤毒素(Pectenotoxin,PTX)組、環(huán)亞胺毒素(Cyclic Imine,CI)組[3]，結(jié)構(gòu)如圖1所示。貝類毒素易通過(guò)食物鏈傳遞并累積在濾食性的雙殼類軟體動(dòng)物中，消除半衰期長(zhǎng)達(dá)數(shù)十天甚至數(shù)月，給消費(fèi)者帶來(lái)潛在危害[4]。美國(guó)對(duì)OA組和AZA組毒素的安全限量為160 μg/kg[5]，歐盟在此基礎(chǔ)上還設(shè)置了PTX組和YTX組的安全限量，分別為160 μg/kg(PTX)和3 750 μg/kg(YTX)[6]。我國(guó)對(duì)貝類毒素在食品中安全限量的相關(guān)研究起步較晚，目前國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)以毒性為計(jì)量單位，將OA組毒素安全限量設(shè)定為0.05 MU/g[7]。

圖1 常見(jiàn)脂溶性貝類毒素的基本結(jié)構(gòu)Fig.1 The basic structure of common lipophilic shellfish toxin

目前脂溶性貝類毒素分析方法主要有小鼠毒性分析法、細(xì)胞毒性分析法、免疫分析法、高效液相色譜法和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)法[8]。其中，HPLC-MS/MS法在貝類毒素分析中具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、分析時(shí)間短、能夠準(zhǔn)確定量不同毒素組分等特點(diǎn)[9]，被各國(guó)推薦用作脂溶性貝類毒素檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)方法。2015年，歐盟制定了HPLC-MS/MS法測(cè)定軟體動(dòng)物中脂溶性貝類毒素的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)操作程序[10]，我國(guó)規(guī)定HPLC-MS/MS法為測(cè)定貝類中腹瀉性貝類毒素的標(biāo)準(zhǔn)方法[11]。近年來(lái)，隨著新材料與新方法的引入，對(duì)脂溶性貝類毒素分析檢測(cè)方法的研究越來(lái)越多，檢測(cè)方法也在不斷完善[12 - 15]。

HPLC-MS/MS法在分析脂溶性貝類毒素時(shí)具有靈敏度高、檢出限低、重復(fù)性好和檢測(cè)速度快等特點(diǎn)，但貝類基質(zhì)嚴(yán)重影響目標(biāo)物的質(zhì)譜響應(yīng)，導(dǎo)致樣品預(yù)處理流程復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)，使得該方法在應(yīng)用中受到一定限制。本研究采用甲醇提取，利用正己烷液-液萃取除油脂，結(jié)合固相萃取柱富集凈化，建立了HPLC-MS/MS同時(shí)檢測(cè)貝類中10種脂溶性貝類毒素的方法。10種脂溶性貝類毒素包括OA組的OA、DTX1、DTX2，YTX組的YTX、hYTX，AZA組的AZA1、AZA2、AZA3，CI組的米氏裸甲藻毒素(Gymnodimine,GYM)以及PTX組的PTX2，涵蓋了目前海產(chǎn)品中常見(jiàn)的脂溶性貝類毒素。該方法前處理后的溶液更加澄清，減少了對(duì)液相色譜和質(zhì)譜儀的污染，降低了基質(zhì)干擾，提高了目標(biāo)物的質(zhì)譜響應(yīng)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器及試劑

Agilent 1260-6400Triple Quad高效液相色譜-質(zhì)譜儀(美國(guó)，Agilent公司)；12位固相萃取裝置(美國(guó)，Agilent公司)；RVC 2-18 CD plus真空離心濃縮儀(德國(guó)，Christ公司)；Lab Dancer旋渦混合器(德國(guó)，IKA公司)；Sigma 3-16PK高速離心機(jī)(德國(guó)，Sigma公司)；Oasis HLB固相萃取小柱(60 mg/3mL，美國(guó)Waters公司)、Strata-X固相萃取小柱(30 mg/3mL，美國(guó)Phenomenex公司)、Bond Elut-C18固相萃取小柱(200 mg/3mL，美國(guó)Agilent公司)。

脂溶性貝類毒素標(biāo)準(zhǔn)品：AZA1(1.30±0.07 μg/mL)、AZA2(1.22±0.06 μg/mL)、AZA3(1.18±0.05 μg/mL)、PTX2(4.40±0.13 μg/mL)、GYM(2.50±0.13 μg/mL)、YTX(5.10±0.24 μg/mL)、hYTX(5.75±0.31 μg/mL)、OA(8.40±0.4 μg/mL)、DTX1(7.80±0.5 μg/mL)、DTX2(3.80±0.2 μg/mL)，均購(gòu)自加拿大海洋生物科學(xué)研究所；甲酸、甲酸銨(質(zhì)譜純，德國(guó)CNW公司)；甲醇、乙腈(色譜純，美國(guó)Sigma公司)；氨水、正己烷(分析純，上海麥克林生化科技有限公司)。實(shí)驗(yàn)用水均來(lái)自Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國(guó)Millipore公司)。

實(shí)驗(yàn)所用貝類樣品購(gòu)買于海產(chǎn)品市場(chǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品前處理用清水沖洗新鮮貽貝外殼，去除雜質(zhì)，切開(kāi)閉殼肌，取出全部軟體組織并用超純水沖洗，去除泥沙后，瀝干水分并充分均質(zhì)。稱取樣品1.0±0.05 g于50 mL離心管中，加入4.5 mL甲醇，渦旋振蕩2 min，10 000 g離心10 min，轉(zhuǎn)移上清液至50 mL離心管中；向沉淀中加入4.5 mL甲醇，重復(fù)提取1次，合并兩次上清液，加超純水定容至15 mL并混勻，加入15 mL正己烷，渦旋振蕩2 min，靜置待其分層，移除正己烷層，再加入15 mL正己烷，重復(fù)除油一次，用超純水定容至35 mL。

固相萃取(SPE)柱依次用3 mL甲醇、3 mL 25%甲醇水溶液進(jìn)行活化，將提取液緩慢上樣后，用3 mL 25%甲醇水溶液淋洗，6 mL 1%氨水-甲醇洗脫，合并洗脫液，真空離心濃縮至干，1 mL 30%乙腈水溶液充分溶解，10 000 g離心10 min，取上清液進(jìn)行HPLC-MS/MS檢測(cè)。

1.2.2 高效液相色譜條件Kinetex XB-C18色譜柱(50 mm×2.1 mm，2.6 μm)；流動(dòng)相A為水，B為95%乙腈水溶液，均含0.1%甲酸和10.0 mmol/L甲酸銨。正離子模式梯度下洗脫程序：0～3.0 min，30%～90%B；3.0～9.0 min，90%B；9.0～11.0 min，90%～30%B，11.0～16.0 min，30%B；負(fù)離子模式下梯度洗脫程序：0～1.0 min，40%～50%B；1.0～8.0 min，50%～70%B，8.0～10.0 min，70%B，10.0～12.0 min，70%～40%B，12.0～16.0 min，40%B。進(jìn)樣體積10.0 μL；柱溫30.0 ℃；流速0.200 mL/min。

1.2.3 質(zhì)譜條件電噴霧電離(ESI)源；正負(fù)離子模式掃描；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)檢測(cè)；毛細(xì)管電壓4.0 kV；干燥氣溫度350 ℃；干燥氣流量：10 L/min；霧化氣壓力：103.42 kPa；分辨率：?jiǎn)挝环直妗?/p>

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

AZA1、AZA2、AZA3、PTX2、GYM采用正離子模式；OA、DTX1、DTX2、YTX、hYTX采用負(fù)離子模式。使用200 μg/L毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液對(duì)質(zhì)譜條件進(jìn)行優(yōu)化，分別在正、負(fù)離子模式下進(jìn)行全掃描，得到目標(biāo)化合物的分子離子峰，將其作為母離子，以目標(biāo)物響應(yīng)為參數(shù)優(yōu)化碎裂電壓(Fragmentor)。對(duì)選取母離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，以豐度高的兩個(gè)碎片離子分別作為定性與定量分析的特征離子對(duì)，再以確定的母離子和子離子進(jìn)行MRM掃描，優(yōu)化碰撞能。10種毒素經(jīng)優(yōu)化后的質(zhì)譜條件如表1所示。

表1 10種脂溶性貝類毒素的質(zhì)譜多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)儀器條件

2.2 色譜條件優(yōu)化

文獻(xiàn)報(bào)道的脂溶性貝類毒素的HPLC-MS/MS檢測(cè)，流動(dòng)相多采用含甲酸-甲酸銨的水-乙腈體系或含氨水的水-乙腈體系。比較兩種流動(dòng)相的檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，含氨水的水-乙腈體系的流動(dòng)相用于正離子模式時(shí)，會(huì)導(dǎo)致離子峰強(qiáng)度顯著降低；含0.1%甲酸-10.0 mmol/L甲酸銨的水-乙腈溶液作為流動(dòng)相時(shí)，10種目標(biāo)物均出峰，且峰形良好。在選定的10種脂溶性貝類毒素中，OA與DTX2的特征離子對(duì)完全相同，需要完全分離才能實(shí)現(xiàn)兩者的定性與定量分析。本研究通過(guò)調(diào)整流動(dòng)相比例，實(shí)現(xiàn)了OA和DTX2的完全分離。另外，YTX和hYTX的保留時(shí)間相近，可以通過(guò)質(zhì)譜靶向檢測(cè)實(shí)現(xiàn)對(duì)兩者的定量分析。

10種脂溶性貝類毒素在優(yōu)化后的色譜條件下的色譜圖見(jiàn)圖2。

圖2 10種脂溶性貝類毒素定量離子MRM色譜圖(a.正離子模式下提取離子流圖；b.負(fù)離子模式下提取離子流圖)Fig.2 Quantitative ion MRM chromatogram of 10 lipophilic shellfish toxins(a.Extracting ion chromatogram in positive ionization;b.Extraction ion chromatogram in negative ionization)

2.3 除油條件優(yōu)化

甲醇提取脂溶性貝類毒素的過(guò)程中，大量脂質(zhì)、色素和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)同時(shí)進(jìn)入提取液，一些低極性的雜質(zhì)在后續(xù)SPE凈化過(guò)程中嚴(yán)重影響SPE效率。因此，本研究引入正己烷液-液萃取過(guò)程，在樣品進(jìn)行SPE前，預(yù)先去除提取液中的低極性雜質(zhì)，以提高SPE效率。本研究均以AZA1(1.30 μg/kg)為代表優(yōu)化除油條件，然后將優(yōu)化后的條件應(yīng)用到其他毒素檢測(cè)中，均有較好的回收率。首先，為提高目標(biāo)物的回收率，將甲醇提取液用水稀釋至100%、80%、60%后再進(jìn)行液-液萃取凈化。結(jié)果表明，隨著甲醇濃度的降低，脂溶性貝類毒素回收率呈增加趨勢(shì)(圖3a)，60%甲醇水溶液得到AZA1的平均回收率達(dá)90.8%。然后，考察萃取次數(shù)對(duì)脂溶性貝類毒素回收率的影響，結(jié)果表明兩次萃取后即可得到較高的回收率，增加萃取次數(shù)不能明顯提高回收率(圖3b)，反而會(huì)因?yàn)椴僮鞯脑龆鄬?dǎo)致目標(biāo)物流失。

圖3 (a)提取液甲醇濃度對(duì)回收率的影響；(b)正己烷萃取次數(shù)對(duì)回收率的影響Fig.3 (a)Effect of methanol concentration of extraction on recovery;(b)Effect of extraction times of n -hexane on recovery

2.4 SPE富集凈化條件的優(yōu)化

本研究選擇常見(jiàn)的三種SPE柱，其填料分別為C18、HLB、Strata-X，比較它們的富集凈化效果，結(jié)果如圖4所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HLB柱對(duì)10種脂溶性貝類毒素的平均回收率均高于C18、Strata-X柱，且經(jīng)過(guò)HLB柱處理后的溶液更清澈透明。因此，本實(shí)驗(yàn)最終采用Oasis HLB SPE柱進(jìn)行富集凈化。本研究所采用的SPE柱易得、便宜、操作方便，且富集凈化效果與特殊填料SPE柱相近[16]。

圖4 不同固相萃取柱對(duì)回收率的影響Fig.4 Effect of different solid phase extraction cartridges on recovery

本研究以AZA1(1.30 μg/kg)為代表對(duì)SPE過(guò)程中的上樣、淋洗進(jìn)行優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)通過(guò)調(diào)整上樣體系中甲醇含量，直接進(jìn)行SPE凈化的方法(即SPE大體積上樣)，既保證了目標(biāo)物的有效富集，又節(jié)省了上樣前的濃縮時(shí)間，兼顧了操作的連續(xù)性與穩(wěn)定性，降低了操作要求。最終確定的最佳上樣條件為25%甲醇，淋洗條件為3 mL 25%甲醇。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[17]，洗脫液酸堿性會(huì)影響洗脫效果。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)添加1%甲酸或1%氨水改變洗脫液酸堿性，比較不同酸堿條件下的回收率。結(jié)果表明，10種脂溶性貝類毒素在使用堿性洗脫液時(shí)的回收率明顯高于酸性洗脫液(圖5)。因此，本研究選擇1%氨水甲醇溶液作為洗脫條件。

圖5 SPE洗脫液酸堿性對(duì)脂溶性貝毒回收率的影響Fig.5 Effect of acidity and alkalinity of SPE eluent on the recovery of lipophilic shellfish toxins

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 基質(zhì)效應(yīng)本研究以目標(biāo)物在基質(zhì)與溶劑中的響應(yīng)比考察方法的基質(zhì)效應(yīng)。圖6是貽貝樣品中，經(jīng)本方法凈化處理和參考?xì)W盟方法[10]處理后(即無(wú)正己烷萃取和SPE凈化)的基質(zhì)效應(yīng)比較。結(jié)果表明未經(jīng)過(guò)凈化處理的貽貝樣品對(duì)OA組的3種毒素產(chǎn)生了輕微的抑制效應(yīng)，對(duì)其余7種毒素產(chǎn)生了嚴(yán)重的抑制效應(yīng)；經(jīng)過(guò)本方法凈化處理后，抑制效應(yīng)得到改善，顯著降低了基質(zhì)對(duì)目標(biāo)物質(zhì)譜響應(yīng)的干擾，提高了方法的靈敏度。

圖6 正己烷除油和SPE對(duì)基質(zhì)效應(yīng)的影響Fig.6 Matrix effect after SPE and n-hexane extraction

2.5.2 線性范圍與檢測(cè)限按“1.2.1”處理空白貽貝樣品，得到空白基質(zhì)。添加各脂溶性貝類毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制各脂溶性貝類毒素的工作溶液，以峰面積為縱坐標(biāo)，脂溶性貝類毒素添加濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。10種脂溶性貝類毒素的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)(R2)見(jiàn)表2。結(jié)果表明，10種分析物在相應(yīng)的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性相關(guān)系數(shù)R2均大于0.996，線性良好，滿足儀器分析的需要。方法的檢出限(LOD)和定量限(LOQ)分別以3倍信噪比和10倍信噪比計(jì)算，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 脂溶性貝類毒素的線性關(guān)系、檢測(cè)限(LOD)與定量限(LOQ)

其中YTX和hYTX的LOD、LOQ略高于其他脂溶性貝毒。分析原因：一是YTX組毒素含有磺酸基，與其他脂溶性貝類毒素結(jié)構(gòu)上差異較大，因此所使用的通用前處理?xiàng)l件對(duì)YTX和hYTX的回收率偏低；二是YTX和hYTX保留時(shí)間一致，離子化過(guò)程存在競(jìng)爭(zhēng)，效率偏低。兩個(gè)因素可能會(huì)導(dǎo)致YTX系列的檢出限較高，但該方法的定量限遠(yuǎn)小于歐盟制定的限量標(biāo)準(zhǔn)(3 750 μg/kg)，因此使用本研究中的通用前處理?xiàng)l件能夠滿足脂溶性貝類毒素的檢測(cè)要求。

2.5.3 回收率及精密度以1.00 g貽貝樣品為空白基質(zhì)，添加低、中、高三種不同濃度的脂溶性貝類毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液作為質(zhì)量控制樣品，每個(gè)質(zhì)量控制樣品平行實(shí)驗(yàn)6次，計(jì)算各分析物對(duì)應(yīng)的平均回收率和精密度，如表3所示。10種分析物的平均回收率為77.54%～116.9%；相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.07%～12.3%。

表3 10種脂溶性貝類毒素的平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)(n=6)

(續(xù)表3)

2.5.4 實(shí)際樣品分析為考察方法的適應(yīng)性和實(shí)用性，采用本方法對(duì)市場(chǎng)上購(gòu)買的6種貝類(貽貝、文蛤、青蛤、縊蟶、花蛤和扇貝)進(jìn)行分析檢測(cè)。結(jié)果顯示OA組、YTX組和PTX2在所有樣品中均未檢出，但是在4個(gè)樣品(花蛤、青蛤、文蛤和扇貝)中檢出了GYM(0.461～1.610 μg/kg)，在花蛤樣品中檢出了AZA1(0.400 μg/kg)。陽(yáng)性貝類樣品檢測(cè)結(jié)果如圖7所示，均低于脂溶性貝類毒素安全限量。

圖7 陽(yáng)性貝類樣品色譜圖Fig.7 Chromatograms of positive shellfish sample

3 結(jié)論

采用甲醇提取，正己烷除油脂，HLB固相萃取柱富集凈化，使用HPLC-MS/MS法檢測(cè)，建立了貝類樣品中10種脂溶性貝類毒素的同時(shí)定量分析方法。該方法回收率高、檢出限低、線性良好，能夠?qū)崿F(xiàn)目標(biāo)物的痕量檢測(cè)。將該方法應(yīng)用于6種實(shí)際貝類樣品的檢測(cè)，部分樣品呈陽(yáng)性，含量均低于毒素安全限量。該方法為海產(chǎn)品安全的檢測(cè)方法提供參考。