馬博凱， 錢(qián) 沖， 王茂媛， 劉珊珊， 黃雯雯，王 尉， 勾新磊， 王祝年， 張 梅

(1.北京市科學(xué)技術(shù)研究院分析測(cè)試研究所(北京市理化分析測(cè)試中心)，有機(jī)材料檢測(cè)技術(shù)與質(zhì)量評(píng)價(jià)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100094；2.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所，海南?？?571101；3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部熱帶農(nóng)業(yè)野生植物基因資源鑒定評(píng)價(jià)中心/海南省熱帶藥用植物工程研究中心，海南儋州 571737)

牛大力(MillettiaspecioseChamp)是豆科崖豆藤屬植物的根，又名美麗崖豆藤，作為一種藥食同源植物，主要分布在我國(guó)的廣東、廣西和海南等地[1]。在民間，牛大力廣泛用于煲湯原料，且具有補(bǔ)虛潤(rùn)肺的保健功效[2]；其作為藥物可用于調(diào)節(jié)人類(lèi)免疫系統(tǒng)，如抑制腫瘤、抗菌[3]，對(duì)呼吸道疾病具有鎮(zhèn)咳、平喘的功效[4]。牛大力中含有的黃酮類(lèi)和生物堿類(lèi)成分，如刺桐堿(Hypaphorine)、芒柄花素(Formononetin)和高麗槐素(Maackiain)[5]起到了主要的藥理作用，他們的結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1。其中，高麗槐素是檢驗(yàn)牛大力質(zhì)量的一個(gè)重要指標(biāo)[3]，具有抑制癌細(xì)胞的增殖、克隆與遷移能力[6]；芒柄花素具有抗腫瘤生物活性，可用作抗腫瘤藥物[7]；刺桐堿對(duì)消炎和抗腫脹具有一定效果[8,9]。因此，上述3種化合物可作為評(píng)價(jià)中藥材牛大力優(yōu)劣的關(guān)鍵指標(biāo)成分，因此，建立簡(jiǎn)單、快速且能同時(shí)測(cè)定牛大力中刺桐堿、芒柄花素和高麗槐素含量的方法，對(duì)篩選優(yōu)良品質(zhì)的牛大力具有非常重要的實(shí)際意義。

圖1 刺桐堿、芒柄花素和高麗槐素的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structures of hypaphorine,formononetin and maackiain

考察與評(píng)價(jià)不同生長(zhǎng)周期的牛大力中刺桐堿、芒柄花素和高麗槐素3種化學(xué)成分的差異，對(duì)確定該藥材的最佳栽培年限具有重要的指導(dǎo)作用。目前，牛大力中化學(xué)成分的分離、提純、鑒定及藥理作用是研究熱點(diǎn)[1 - 4,10]，但對(duì)不同年份牛大力的品質(zhì)評(píng)價(jià)研究卻較少[11]。高效液相色譜法是檢測(cè)牛大力中刺桐堿、芒柄花素和高麗槐素3種指標(biāo)成分的主要方法[5,11 - 13]，而超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法具有更高的靈敏度和分離度，專(zhuān)屬性更好、分析速度更快、基質(zhì)效應(yīng)更小、抗干擾能力更強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[14 - 16]，然而，還鮮見(jiàn)應(yīng)用該技術(shù)同時(shí)測(cè)定牛大力中的刺桐堿、芒柄花素和高麗槐素的文獻(xiàn)報(bào)道。本研究利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，通過(guò)優(yōu)化色譜和質(zhì)譜分析條件，建立了同時(shí)測(cè)定牛大力中上述3種指標(biāo)成分的方法，并對(duì)不同生長(zhǎng)周期牛大力中3種指標(biāo)成分的含量進(jìn)行了比較，確定了7年為最佳栽培年限，為中藥材牛大力的科學(xué)采收、品質(zhì)控制提供了重要的科學(xué)理論支持。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器及試劑

WatersAcquity超高效液相色譜儀，配有Xevo TQ型三重四極桿質(zhì)譜儀(美國(guó)，Waters公司)；Sartorius分析天平(日本，Shimadzu公司)；KQ-300GDV型恒溫?cái)?shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

標(biāo)準(zhǔn)品刺桐堿、高麗槐素和芒柄花素來(lái)自成都植標(biāo)化純生物技術(shù)有限公司(純度≥98%)。乙醇、甲醇(色譜純，純度99.9%)購(gòu)自美國(guó)Fisher公司。中藥材牛大力樣品由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所提供。

1.2 混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的配制

分別精確稱(chēng)取標(biāo)準(zhǔn)品刺桐堿6.0 mg、芒柄花素12.5 mg和高麗槐素20.0 mg，用甲醇定容至10 mL，作為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，再用75%甲醇將其稀釋成混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液。所有溶液在4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 樣品制備

準(zhǔn)確稱(chēng)取牛大力樣品粉末500 mg(過(guò)三號(hào)篩)，置于150 mL錐形瓶中，加入50 mL 75%甲醇，稱(chēng)定重量，超聲提取30 min,靜置放冷至室溫，再稱(chēng)定重量，并用75%甲醇補(bǔ)足重量。取1 mL上清液，置于10 mL容量瓶中，加75%甲醇定容至刻度，混勻，過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜后，上機(jī)測(cè)試。

1.4 儀器分析條件

色譜條件：色譜柱為Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流動(dòng)相為甲醇(A)-0.1%甲酸水溶液(B)。梯度洗脫程序：0～6 min，10%A→90%A；6～8 min，90%A；8～8.50 min，90%A→10%A；8.50～10 min,10%A。柱流速：0.2 mL/min；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣體積：5 μL。

質(zhì)譜條件：離子源為ESI源，掃描模式為負(fù)離子；監(jiān)測(cè)模式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)。優(yōu)化后的參數(shù)如下：毛細(xì)管電壓3.2 kV；離子源溫度150 ℃；錐孔氣流速20 L/h；錐孔電壓10.0 V；去溶劑氣溫度350 ℃；去溶劑氣流速650 L/h。各待測(cè)物質(zhì)的母離子、子離子、錐孔電壓和碰撞能等參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 刺桐堿、高麗槐素和芒柄花素的質(zhì)譜分析參數(shù)

(續(xù)表1)

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的選擇

采用流動(dòng)注射方式，分別將刺桐堿、芒柄花素和高麗槐素的標(biāo)準(zhǔn)溶液注入離子源，利用正負(fù)離子掃描模式，選擇合適的電離方式。結(jié)果表明，3種目標(biāo)分析物在負(fù)離子模式下產(chǎn)生的信號(hào)較強(qiáng)，均可獲得較高豐度的[M-H]-準(zhǔn)分子離子峰。采用二級(jí)質(zhì)譜子離子掃描方式確定定量離子和定性離子，調(diào)節(jié)錐孔電壓和碰撞能量，使3種分析物的離子化效率達(dá)到最佳，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2 色譜條件的選擇

考察了甲醇-0.1%甲酸溶液和乙腈-0.1%甲酸溶液作為流動(dòng)相對(duì)刺桐堿、芒柄花素和高麗槐素的分離效果。結(jié)果顯示，以乙腈-0.1%甲酸作為流動(dòng)相時(shí)，刺桐堿的峰形差、有分叉；芒柄花素峰形有拖尾，整體分離效果欠佳，如圖2A所示。采用甲醇-0.1%甲酸作為流動(dòng)相時(shí)，刺桐堿和高麗槐素峰形均好，且芒柄花素?zé)o明顯拖尾現(xiàn)象，3種目標(biāo)分析物在10 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)完全分離，分離效果好，如圖2B所示。因此選擇甲醇-0.1%甲酸水體系作為流動(dòng)相。

圖2 刺桐堿(750 μg/L)、芒柄花素(31.2 μg/L)和高麗槐素(500 μg/L)在乙腈-0.1%甲酸溶液(A)和甲醇-0.1%甲酸(B)中的選擇離子色譜圖Fig.2 Selected ion chromatograms of hypaphorine(750 μg/L),formononetin(31.2 μg/L) and maackiain(500 μg/L) in acetonitrile -0.1% formic acid(A) and methanol-0.1% formic acid systems(B)

2.3 線性關(guān)系、定量限及檢出限

用甲醇將3種分析物的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液分別稀釋成刺桐堿質(zhì)量濃度為60～6 000 μg/L、芒柄花素質(zhì)量濃度為1～125 μg/L，以及高麗槐素質(zhì)量濃度為100～2 000 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液，在上述的分析條件下進(jìn)行測(cè)定。以峰面積(Y)對(duì)相應(yīng)的質(zhì)量濃度(X，μg/L)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明3種分析物在各自的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性相關(guān)系數(shù)均大于0.99。以信噪比(S/N)=3計(jì)算3種分析物的檢出限，以S/N=10計(jì)算其定量限，結(jié)果見(jiàn)表2?？梢钥闯?，刺桐堿、芒柄花素和高麗槐素的檢出限分別為2 μg/g、0.02 μg/g和30 μg/g。

表2 3種分析物的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限(LOD)和定量限(LOQ)

2.4 樣品檢測(cè)、回收率和重復(fù)性

應(yīng)用所建立方法，測(cè)定生長(zhǎng)周期為7年的牛大力樣品中刺桐堿、芒柄花素和高麗槐素的含量，樣品的選擇離子流色譜圖見(jiàn)圖3。結(jié)果顯示，所測(cè)定3份樣品中刺桐堿含量分別為2416±60、2350±51、2323±51 μg/g；芒柄花素含量分別為28.2±0.3、28.1±0.4、28.8±0.5 μg/g；高麗槐素的含量分別為308±7.7、303±8.1、296±7.4 μg/g。

圖3 實(shí)際樣品的選擇離子流色譜圖Fig.3 Selected ion current chromatograms of real samples

選取2號(hào)樣品作為本底值，考察方法的加標(biāo)回收率和重復(fù)性。并根據(jù)樣品含量向樣品基質(zhì)中分別加入50%、100%和150%的3個(gè)級(jí)別的目標(biāo)分析物，平行配制6份，然后進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果如表3所示，刺桐堿、芒柄花素和高麗槐素的平均回收率為86.0%～104%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.12%～5.57%，表明本方法加標(biāo)回收率和重復(fù)性良好，可滿足實(shí)際樣品的分析要求。

表3 回收率和精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.5 不同年限牛大力中3種指標(biāo)成分含量的分析

采用本方法分別對(duì)生長(zhǎng)周期為3年、7年、10年和15年的牛大力實(shí)際樣品進(jìn)行了分析檢測(cè)。圖4是4個(gè)不同生長(zhǎng)周期牛大力中3種指標(biāo)成分含量的匯總圖。從圖4可見(jiàn)，生長(zhǎng)周期為7年的牛大力中刺桐堿和高麗槐素的含量最高。雖然芒柄花素隨著生長(zhǎng)年齡的增加其含量呈下降趨勢(shì)，但生長(zhǎng)7年牛大力中芒柄花素的含量較3年的減少不明顯。因此，綜合3種有效成分的含量比對(duì)，可以得出牛大力的最佳栽培年限為7年。

圖4 不同生長(zhǎng)周期牛大力中3種分析物的含量差異圖Fig.4 Content differences of 3 analytes in Millettia speciose Champ with different ages

3 結(jié)論

本研究建立了一種同時(shí)測(cè)定中藥材牛大力中刺桐堿、芒柄花素和高麗槐素3種有效成份的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。該方法具有簡(jiǎn)單、分離速度快、靈敏度高、基質(zhì)背景干擾少的特點(diǎn)，能對(duì)實(shí)際樣品牛大力進(jìn)行分析檢測(cè)。同時(shí)，利用該方法考察了生長(zhǎng)周期為3年、7年、10年和15年的牛大力中3種指標(biāo)成分的差異及動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，從功能性活性成分積累高峰的角度，確定了生長(zhǎng)周期為7年的牛大力是最佳栽培年限。該研究為實(shí)現(xiàn)其科學(xué)采收、品質(zhì)控制及產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供了必要的科學(xué)理論依據(jù)。