王鳴凱, 張新化, 李 偉, 強(qiáng) 萍

(1. 南通大學(xué)附屬醫(yī)院分院 藥劑科, 江蘇 南通, 226001;2. 南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院 人體解剖學(xué)系, 江蘇 南通, 226001;3. 江蘇省南通市中醫(yī)院 腎內(nèi)分泌科, 江蘇 南通, 226001;4. 蘇州大學(xué)附屬張家港醫(yī)院 婦產(chǎn)科, 江蘇 蘇州, 215600)

多囊卵巢綜合征(PCOS)是一種生殖異常及內(nèi)分泌紊亂性疾病[1], 主要病理表現(xiàn)之一為胰島素抵抗[2]。近年來研究[3]發(fā)現(xiàn)，慢性炎癥是引起PCOS患者發(fā)生胰島素抵抗、卵巢多囊樣改變及激素分泌異常的始動(dòng)因素。白細(xì)胞介素-6(IL-6)是參與炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵因子之一，可刺激gp130使信號(hào)傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT)家族成員STAT3活化，介導(dǎo)炎癥活化[4]、降解胰島素受體底物(IRS)表達(dá)引起胰島素抵抗的發(fā)生[5]; IL-6/STAT3通路還能通過誘導(dǎo)微小RNA-21(miR-21)轉(zhuǎn)錄表達(dá)介導(dǎo)雄激素的分泌[6-7], 提示調(diào)控IL-6/STAT3信號(hào)通路表達(dá)可能是治療PCOS的潛在機(jī)制。二甲雙胍為臨床常用降糖藥，可增強(qiáng)機(jī)體對(duì)胰島素的敏感性，近年來研究[8]發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍對(duì)PCOS患者的臨床癥狀有一定改善作用，但其具體分子機(jī)制尚未闡明。本研究從IL-6/STAT3通路方面探討二甲雙胍治療PCOS的可能機(jī)制，以期為二甲雙胍在PCOS領(lǐng)域的推廣應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與材料

SPF級(jí)健康雌性SD大鼠(23日齡)，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，許可證號(hào)SCXK(京)2021-0004, 實(shí)驗(yàn)符合3R原則并經(jīng)蘇州大學(xué)附屬張家港醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)文號(hào)為IACUC-01(20210007); 脫氫表雄酮(貨號(hào)DKO124, 上海滬震實(shí)業(yè)有限公司); 二甲雙胍(國藥準(zhǔn)字H20080251, 江蘇德源藥業(yè)股份有限公司); STAT3抑制劑Stattic(貨號(hào)M00248, 北京百奧萊博科技有限公司); IL-6激活劑IL-6重組蛋白(貨號(hào)HY-P7103A, 上海MCE公司); IL-6 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(貨號(hào)EK-R30201, 上海酶研生物科技有限公司); 胰島素ELISA試劑盒(貨號(hào)10-1250-01, 廣州市進(jìn)德生物科技有限公司); 雄激素-睪酮ELISA試劑盒(貨號(hào)SND-R595, 滁州仕諾達(dá)生物科技有限公司); 蘇木精-伊紅(HE)染液(貨號(hào)BIR615, 北京博爾西科技有限公司); 兔抗大鼠抗體IL-6(貨號(hào)ab281935), STAT3(貨號(hào)ab68153)，磷酸化STAT3(p-STAT3)(貨號(hào)ab76315), 胰島素受體底物-2(IRS-2)(貨號(hào)ab76315), 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制蛋白3(SOCS-3)(貨號(hào)ab280884), 過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)(貨號(hào)ab178866)，均購自美國abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 模型建立及分組: 參照文獻(xiàn)[9]方法，于SD大鼠頸背部皮下注射脫氫表雄酮油劑60 mg/kg(大豆油溶解成30 mg/mL油劑，以2 mL/kg給藥體積連續(xù)注射20 d, 1次/d)建立PCOS模型，連續(xù)2個(gè)性周期前檢測(cè)陰道涂片，若陰道上皮細(xì)胞出現(xiàn)角化現(xiàn)象、動(dòng)情周期不完整，視為造模成功(共50只)，隨機(jī)分為模型組、二甲雙胍組、STAT3抑制劑組、IL-6激活劑組、二甲雙胍+IL-6激活劑組，每組10只; 另取10只大鼠于頸背部皮下注射油劑2 mL/kg, 設(shè)為假手術(shù)組。二甲雙胍組參照文獻(xiàn)[9]方法灌胃給予二甲雙胍270 mg/kg(用生理鹽水溶解成27 mg/mL混懸液, 10 mL/kg給藥體積連續(xù)給藥14 d, 1次/d); STAT3抑制劑組參照文獻(xiàn)[10]經(jīng)尾靜脈注射STAT3抑制劑Stattic(500 μg/kg, 1次/2 d); IL-6激活劑組參照文獻(xiàn)[11]經(jīng)尾靜脈注射重組IL-6蛋白(1 μg/kg, 1次/2 d); 二甲雙胍+IL-6激活劑組給予二甲雙胍的同時(shí)經(jīng)尾靜脈注射重組IL-6蛋白進(jìn)行治療; 模型組及假手術(shù)組給予10 mL/kg的生理鹽水灌胃。所有組連續(xù)給藥14 d后，進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.2 大鼠胰島素抵抗指數(shù)及雄激素水平檢測(cè): 各組大鼠給藥結(jié)束后禁食、禁水12 h, 取腹主動(dòng)脈血3 mL, 30 000轉(zhuǎn)/min離心10 min后取血清，應(yīng)用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)空腹血糖水平，采用ELISA試劑盒檢測(cè)雄激素睪酮、胰島素、血清炎癥因子IL-6水平，計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)(胰島素抵抗指數(shù)=空腹血糖×胰島素/22.5)。

1.2.3 HE染色法觀察卵巢病理改變: 斷頭處死大鼠，取左右卵巢，右側(cè)卵巢置于液氮中保存?zhèn)溆?，左?cè)卵巢用4%多聚甲醛固定、梯度乙醇脫水、石蠟包埋后，制成4 μm厚度切片，取切片行HE染色后于光鏡下觀察。

1.2.4 免疫組化法檢測(cè)卵巢組織IL-6陽性表達(dá)情況: 取左側(cè)卵巢石蠟切片，烘烤脫蠟、梯度乙醇水化、3%過氧化氫封閉及抗原修復(fù)處理后，滴加1∶200的IL-6一抗封閉孵育過夜，與辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗室溫封閉20 min, 二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色及蘇木素復(fù)染后，光鏡下觀察拍照，應(yīng)用圖像處理系統(tǒng)Image Pro plus 6.0檢測(cè)單位面積內(nèi)陽性染色的平均光密度值。

1.2.5 實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)法檢測(cè)卵巢組織miR-21: 取右側(cè)冰凍卵巢組織約1 g, 粉碎后勻漿處理，用Trizol試劑盒提取勻漿液中總RNA, 逆轉(zhuǎn)錄合成單鏈cDNA并以其為模板進(jìn)行qRT-PCR。反應(yīng)條件為94 ℃ 110 s(1個(gè)循環(huán)), 94 ℃ 20 s、55～60 ℃ 30 s、72 ℃ 60 s(45個(gè)循環(huán)), 72 ℃ 200 s(1個(gè)循環(huán))。miR-21上游引物5′-TTGATATGTTGGATGATGGAGT-3′, 下游引物5′-TTACTCCATCATCCAACATATC-3′; 內(nèi)參基因U6上游引物5′-ACACGACGGCTTCGCTC-3′, 下游引物5′-TGCGTTTAAGCACTTCGCAA-3′。采用2-△△Ct法計(jì)算miR-21相對(duì)表達(dá)量。

1.2.6 蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測(cè)卵巢組織蛋白表達(dá): 取剩余右側(cè)冰凍卵巢組織，機(jī)械粉碎勻漿后得勻漿液，提取勻漿液中蛋白，采用二喹啉甲酸(BCA)法測(cè)蛋白總濃度，取60 μg蛋白進(jìn)行電泳及轉(zhuǎn)膜反應(yīng)操作，滴入1∶500的一抗抗體(IL-6、STAT3、p-STAT3、IRS-2、SOCS-3、PPARγ)及1∶700的β-actin內(nèi)參抗體4 ℃孵育過夜，室溫滴加HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗孵育40 min, 化學(xué)發(fā)光法顯色、曝光，使用分析軟件Alpha Ease FC掃描條帶并分析條帶相對(duì)灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 二甲雙胍對(duì)大鼠空腹血糖、胰島素、胰島素

抵抗指數(shù)、睪酮和IL-6水平的影響模型組大鼠空腹血糖、胰島素、胰島素抵抗指數(shù)、睪酮和IL-6水平均高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 二甲雙胍組、STAT3抑制劑組大鼠空腹血糖、胰島素、胰島素抵抗指數(shù)、睪酮和IL-6水平均低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); IL-6激活劑組大鼠空腹血糖、胰島素、胰島素抵抗指數(shù)、睪酮和IL-6水平均高于模型組、二甲雙胍組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 二甲雙胍+IL-6激活劑組大鼠空腹血糖、胰島素、胰島素抵抗指數(shù)、睪酮和IL-6水平均高于二甲雙胍組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠空腹血糖、胰島素、胰島素抵抗指數(shù)、睪酮和IL-6水平比較

2.2 二甲雙胍對(duì)大鼠卵巢組織病理形態(tài)的影響

假手術(shù)組大鼠卵巢組織卵泡及黃體結(jié)構(gòu)正常，無病變; 模型組卵巢組織可見閉鎖卵泡及無卵丘的囊性濾泡增多，卵母細(xì)胞放射冠消失，顆粒細(xì)胞層減少，黃體萎縮明顯; 二甲雙胍組和STAT3抑制劑組大鼠卵泡逐漸恢復(fù)正常，囊性濾泡數(shù)量減少，卵母細(xì)胞放射冠逐漸清晰，黃體及顆粒細(xì)胞層增多; IL-6激活劑組大鼠囊性卵泡增多，卵巢顆粒細(xì)胞層減少，黃體減少及消失嚴(yán)重; 二甲雙胍+IL-6激活劑組上述病理損傷較二甲雙胍組嚴(yán)重。見圖1。

圖1 各組大鼠卵巢組織HE染色圖(放大倍數(shù)100倍)

2.3 二甲雙胍對(duì)大鼠卵巢組織IL-6陽性表達(dá)的影響

假手術(shù)組大鼠卵巢組織中IL-6呈弱陽性表達(dá); 模型組大鼠卵巢組織卵泡上皮細(xì)胞、顆粒細(xì)胞層中IL-6呈強(qiáng)陽性表達(dá), IL-6陽性表達(dá)強(qiáng)于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 與模型組相比，二甲雙胍組、STAT3抑制劑組大鼠IL-6陽性表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); IL-6激活劑組大鼠IL-6陽性表達(dá)高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。二甲雙胍+IL-6激活劑組IL-6陽性表達(dá)高于二甲雙胍組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2、表2。

圖2 各組大鼠卵巢組織IL-6免疫組化染色圖(放大倍數(shù)100倍)

表2 各組大鼠卵巢組織IL-6陽性表達(dá)比較

2.4 二甲雙胍對(duì)大鼠卵巢組織miR-21表達(dá)的影響

模型組大鼠卵巢組織miR-21表達(dá)高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 二甲雙胍組、STAT3抑制劑組大鼠miR-21表達(dá)低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); IL-6激活劑組大鼠miR-21表達(dá)高于模型組、二甲雙胍組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。二甲雙胍+IL-6激活劑組miR-21表達(dá)高于二甲雙胍組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠組織miR-21表達(dá)比較

2.5 二甲雙胍對(duì)大鼠IL-6、p-STAT3/STAT3、IRS-2、SOCS-3和PPARγ蛋白表達(dá)的影響

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠IL-6、p-STAT3/STAT3、SOCS-3蛋白表達(dá)升高, IRS-2、PPARγ蛋白表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組相比，二甲雙胍組和STAT3抑制劑組大鼠IL-6、p-STAT3/STAT3、SOCS-3蛋白表達(dá)降低, IRS-2、PPARγ蛋白表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); IL-6激活劑組大鼠IL-6、p-STAT3/STAT3、SOCS-3蛋白表達(dá)高于模型組、二甲雙胍組, IRS-2、PPARγ蛋白表達(dá)低于模型組、二甲雙胍組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。二甲雙胍+IL-6激活劑組IL-6、p-STAT3/STAT3、SOCS-3蛋白表達(dá)高于二甲雙胍組, IRS-2、PPARγ蛋白表達(dá)低于二甲雙胍組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3、表4。

A: 假手術(shù)組; B: 模型組; C: 二甲雙胍組; D: STAT3抑制劑組; E: IL-6激活劑組; F: 二甲雙胍+IL-6激活劑組。圖3 各組大鼠卵巢組織IL-6、p-STAT3/STAT3、SOCS-3、IRS-2和PPARγ蛋白Western blot結(jié)果

表4 各組大鼠卵巢組織IL-6、p-STAT3/STAT3、SOCS-3、IRS-2、PPARγ蛋白表達(dá)比較

3 討 論

胰島素抵抗與高雄激素血癥可相互關(guān)聯(lián)，促進(jìn)PCOS發(fā)展。相關(guān)研究[12]證實(shí)，胰島素分泌過多，一方面可使卵巢間質(zhì)、卵泡膜細(xì)胞、顆粒細(xì)胞合成雄激素相關(guān)酶的活性升高而大量分泌雄激素，另一方面可干擾肝臟合成性激素結(jié)合球蛋白，引起雄激素游離睪酮水平升高。較高水平的雄激素不僅會(huì)促進(jìn)胰島素水平增高，還會(huì)促進(jìn)顆粒細(xì)胞迅速黃素化、小竇卵泡發(fā)育停止而影響卵泡的發(fā)育及成熟，導(dǎo)致PCOS患者排卵功能異常[13]。戚懷鉆[14]發(fā)現(xiàn), PCOS患者胰島素抵抗指數(shù)及雄激素水平均顯著高于假手術(shù)組，且胰島素抵抗指數(shù)與雄激素水平存在一定相關(guān)性。研究[15]發(fā)現(xiàn)，減輕胰島素抵抗，可改善PCOS患者雄激素水平分泌過高，緩解卵巢形態(tài)改變。二甲雙胍可增強(qiáng)組織細(xì)胞對(duì)胰島素的敏感性，緩解PCOS癥狀。臨床研究[16-17]發(fā)現(xiàn), PCOS患者口服二甲雙胍，可改善子宮內(nèi)膜形態(tài)，并緩解激素分泌及代謝紊亂，證實(shí)了二甲雙胍在治療PCOS方面有潛在應(yīng)用價(jià)值。本研究也發(fā)現(xiàn)，給予PCOS大鼠二甲雙胍治療后，大鼠胰島素抵抗指數(shù)下降，雄激素水平趨于正常，卵巢組織閉鎖卵泡增多、顆粒細(xì)胞減少及黃體萎縮等病理損傷緩解，證實(shí)二甲雙胍可改善PCOS胰島素抵抗、雄激素分泌增多及卵巢形態(tài)改變等病理癥狀，但其具體作用機(jī)制還不甚明確。

炎癥反應(yīng)可損傷胰島細(xì)胞，進(jìn)而損傷卵巢，導(dǎo)致卵巢囊性改變及激素分泌異常，已受到PCOS研究者的重視[18]。近年來有研究[19]認(rèn)為PCOS是一種亞臨床炎癥性疾病, PCOS患者血清炎癥因子如IL-6等水平與胰島素抵抗指數(shù)呈正比，并認(rèn)為炎癥反應(yīng)是引起PCOS患者胰島素抵抗及雄激素分泌水平升高的始動(dòng)因素。IL-6/STAT3通路是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)、胰島素抵抗、雄激素分泌增加的關(guān)鍵通路。研究[20]證實(shí), IL-6可通過激活Janus激酶，刺激STAT3磷酸化活化，活化的STAT3可引起M2型巨噬細(xì)胞特異性因子PPARγ減少而減弱抗炎反應(yīng)，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)活化。SOCS-3可通過降解IRS-2阻斷胰島素通路過程中的糖原合成及吸收，降低肝臟及組織細(xì)胞對(duì)胰島素的敏感性，誘導(dǎo)胰島素抵抗的發(fā)生，而IL-6/STAT3活化可增加SOCS-3的表達(dá)[21], 提示IL-6/STAT3可通過促進(jìn)SOCS-3活化來介導(dǎo)胰島素抵抗的發(fā)生。雄激素受體可直接介導(dǎo)miR-21的啟動(dòng)子區(qū)域而促進(jìn)miR-21表達(dá), miR-21高表達(dá)可促進(jìn)睪丸去勢(shì)大鼠睪丸非依賴性生長(zhǎng)[6], 有研究[7]發(fā)現(xiàn)IL-6/STAT3通路活化或抑制能引起miR-21表達(dá)的上調(diào)或下調(diào)，提示IL-6/STAT3通路活化可能通過促進(jìn)miR-21表達(dá)來誘導(dǎo)雌激素分泌。ZHANG Y L等[22]研究發(fā)現(xiàn), PCOS模型大鼠血漿中IL-6/STAT3及miR-21表達(dá)均處于活化狀態(tài)。本研究發(fā)現(xiàn), IL-6在PCOS大鼠血清及卵巢組織中的表達(dá)均異常升高，用IL-6激活劑促進(jìn)IL-6表達(dá)后, STAT3及SOCS-3、miR-21表達(dá)也進(jìn)一步升高，且大鼠胰島素抵抗、雄激素分泌升高及卵巢病理改變進(jìn)一步加重，反之抑制STAT3活化后, IL-6及SOCS-3、miR-21表達(dá)均顯著降低，大鼠胰島素抵抗、雄激素分泌升高及卵巢病理改變均顯著緩解，提示IL-6/STAT3通路活化可能參與PCOS胰島素抵抗、雄激素分泌及卵巢形態(tài)病理改變過程。相關(guān)研究[23]報(bào)道，二甲雙胍可通過下調(diào)IL-6/STAT3通路活化來抵抗卵巢癌細(xì)胞惡性增殖，提示二甲雙胍可通過干預(yù)IL-6/STAT3通路改善卵巢惡性病變。本研究發(fā)現(xiàn)，采用二甲雙胍治療PCOS大鼠后，大鼠卵巢組織中IL-6/STAT3信號(hào)通路處于抑制狀態(tài), IL-6/STAT3信號(hào)通路下游與胰島素抵抗、雄激素分泌相關(guān)的因子SOCS-3、miR-21表達(dá)顯著降低, PPARγ、IRS-2表達(dá)顯著升高，提示二甲雙胍治療PCOS可能與抑制IL-6/STAT3信號(hào)通路活化有關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn), IL-6激活劑可顯著削弱二甲雙胍抑制IL-6/STAT3活化、改善PCOS病理癥狀的作用。

綜上所述，二甲雙胍可通過抑制IL-6/STAT3活化而改善PCOS大鼠胰島素抵抗、雄激素分泌及卵巢形態(tài)改變，為闡明二甲雙胍治療PCOS的具體機(jī)制提供了一定參考。但I(xiàn)L-6/STAT3通路參與胰島素抵抗、雄激素分泌的靶基因調(diào)控機(jī)制還存在許多盲點(diǎn)，未來有待進(jìn)一步探討。