孫軍濤，張智超，薛文龍，周潤(rùn)浩，王怡馨，王怡卓

(許昌學(xué)院，河南 許昌 461000)

低聚木糖是由2～9個(gè)木糖單元，以β-1,4-糖苷鍵連接而成的低聚糖混合物[1]。低聚木糖具有較高的耐熱和耐酸性能，在pH 2.5～8.0范圍內(nèi)100 ℃加熱1 h幾乎不分解，是雙歧桿菌增殖所需用量最小的低聚糖[2]，具有改善人體腸道、抗齲齒、提高免疫機(jī)能、促進(jìn)鈣的吸收、改善脂質(zhì)代謝等功能[3-6]。

玉米芯是制備低聚木糖的主要原材料之一[7]，2020年我國玉米總產(chǎn)量約2.76億噸，大約有0.88億噸的玉米芯副產(chǎn)物，為低聚木糖的制備提供了豐富的原料資源。目前低聚木糖的制備方法主要包括兩種：一種是采用酸解法、蒸煮法和微波法等直接將木質(zhì)纖維素降解為低聚木糖；另一種方法是預(yù)處理-酶解法制備低聚木糖，其中預(yù)處理方法有酸水解法、堿水解法、水熱法、有機(jī)溶劑法、超聲波輔助法和微波輔助法等[8-9]。文章以玉米芯為原料，采用復(fù)合酶法、超聲波輔助復(fù)合酶法、堿-酶法、高溫蒸煮-酸法、堿-超聲波輔助酶法和酸-復(fù)合酶法制備低聚木糖，分別對(duì)6種方法玉米芯組織結(jié)構(gòu)變化和低聚木糖組分進(jìn)行對(duì)比分析，為用玉米芯制備功能性低聚木糖提供一定的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

玉米芯：河南省許昌市；纖維素酶、木聚糖酶：江蘇銳陽生物科技有限公司；3,5-二硝基水楊酸：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；木糖、木二糖、木三糖、木四糖：上海甄準(zhǔn)生物科技有限公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

EVO LS15型掃描電子顯微鏡 英國蔡司公司；FA1004B型分析天平 上海佑科儀器儀表有限公司；T6型紫外分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；NLD-6DI型超微粉碎機(jī) 濟(jì)南納力德超微粉碎技術(shù)公司；1260 Infinity高效液相色譜儀 安捷倫科技(中國)有限公司；KQ-250E型超聲波清洗器 上海邁坤化工有限公司；LDZX-75KBS型立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 測(cè)定方法

1.2.1.1 還原糖

還原糖的測(cè)定采用DNS法[10]。

1.2.1.2 可溶性總糖

向待測(cè)液中加入終濃度為72 g/L的濃硫酸，沸水浴2 h，中和至中性，按還原糖的測(cè)定方法測(cè)定待測(cè)液中可溶性總糖的含量。

1.2.1.3 聚合度

1.2.2 玉米芯低聚木糖的制備

1.2.2.1 復(fù)合酶法

粉碎后的玉米芯按照料液比1∶15(g/mL)的比例加入蒸餾水，調(diào)pH至5.0，加入1.5%的復(fù)合酶(木聚糖酶與纖維素酶按照2∶1的比例混合)，混勻后，在50 ℃下水浴酶解1 h制備低聚木糖。

1.2.2.2 超聲波輔助復(fù)合酶法

粉碎后的玉米芯按照料液比1∶15(g/mL)的比例加入蒸餾水，調(diào)pH至5.0，加入玉米芯質(zhì)量1%的復(fù)合酶(木聚糖酶與纖維素酶按照3∶2的比例混合)，混勻后，在溫度55 ℃、超聲功率250 W下超聲波輔助酶解20 min制備低聚木糖[11-12]。

1.2.2.3 堿-酶法

粉碎后的玉米芯按照料液比1∶25(g/mL)的比例加入1 mol/L的氫氧化鈉，置于110 ℃高壓滅菌鍋中處理40 min，冷卻至室溫后調(diào)pH至5.0，再加入玉米芯質(zhì)量6%的木聚糖酶，在55 ℃下水浴加熱50 min制備低聚木糖[13]。

1.2.2.4 高溫蒸煮-酸法

按照料液比1∶20(g/mL)加1.4 mol/L的硫酸于玉米芯中，置于110 ℃高壓滅菌鍋中處理50 min，冷卻后的溶液即為低聚木糖粗液。

1.2.2.5 堿-超聲波輔助酶法

按照料液比1∶20(g/mL)加15%氫氧化鈉溶液于玉米芯中，置于100 ℃高壓滅菌鍋中處理2 h, 冷卻至室溫后調(diào)pH至5.0，再加入6%的木聚糖酶，在溫度55 ℃和超聲功率250 W下超聲波輔助酶解10 min[14]。

1.2.2.6 酸-復(fù)合酶法

按照料液比1∶6(g/mL)加2.5 g/L的硫酸于玉米芯中，置于120 ℃高壓滅菌鍋中處理60 min，冷卻后調(diào)pH至5.0，加入玉米芯質(zhì)量1.5%的復(fù)合酶(由木聚糖酶與纖維素酶按照2∶3的比例混合)，50 ℃下酶解30 min。

1.2.3 玉米芯低聚木糖溶液中糖含量分析

分別對(duì)復(fù)合酶法、超聲波輔助復(fù)合酶法、堿-酶法、高溫蒸煮-酸法、堿-超聲波輔助酶法和酸-復(fù)合酶法制備的低聚木糖溶液中還原糖、可溶性總糖、聚合度進(jìn)行測(cè)定。

1.2.4 玉米芯組織結(jié)構(gòu)掃描電鏡分析

采用掃描電子顯微鏡分別對(duì)粉碎后的玉米芯、不同制備方法玉米芯殘?jiān)奈⒂^結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，研究不同處理?xiàng)l件下玉米芯表面形態(tài)變化。

1.2.5 玉米芯低聚木糖組分分析

1.2.5.1 薄層層析

層析板為硅膠板，展開劑為乙腈和水(體積比為85∶15)，顯色劑為甲醇和5%硫酸(體積比為95∶5)，對(duì)不同方法制備的低聚木糖組分進(jìn)行定性分析[15]。

1.2.5.2 高效液相色譜分析

色譜柱為Hi-Plex Na(300 mm×7.7 mm, 10 μm)，流動(dòng)相為水，流速為0.3 mL/min，柱溫85 ℃。分別對(duì)不同方法制備的玉米芯低聚木糖組分進(jìn)行定量分析[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米芯水解液中還原糖、可溶性總糖和聚合度分析

復(fù)合酶法、超聲波輔助復(fù)合酶法、堿-酶法、高溫蒸煮-酸法、堿-超聲波輔助酶法和酸-復(fù)合酶法制備低聚木糖溶液中還原糖含量、可溶性總糖含量和聚合度見表1。

表1 玉米芯水解液還原糖含量、總糖含量和聚合度分析Table 1 Analysis of reducing sugar content, total sugar content and polymerization degree of corncob hydrolysate

由表1可知，高溫蒸煮-酸法、堿-酶法和酸-復(fù)合酶法制備的低聚木糖溶液中還原糖含量(以玉米芯質(zhì)量計(jì))較高，分別為369.95，206.11，199.14 mg/g，超聲波輔助復(fù)合酶法制備的低聚木糖溶液中還原糖含量最低，為75.00 mg/g。還原糖含量較高的水解液完全水解后得到的可溶性總糖含量也高。酸、堿或高溫高壓預(yù)處理方法便于木質(zhì)纖維素中半纖維素、纖維素和木質(zhì)素的解離，有利于纖維素和半纖維素進(jìn)一步水解成還原糖。該研究的高溫蒸煮-酸法可能導(dǎo)致玉米芯中的多糖徹底降解為單糖，因此水解液中還原糖含量高。超聲波輔助復(fù)合酶法可能由于超聲波作用影響復(fù)合酶的活力，導(dǎo)致酶解效率偏低。

聚合度可用來衡量玉米芯中多糖被水解的程度，越接近1表明水解越徹底。高溫蒸煮-酸法的聚合度為0.9，得到的還原糖基本都是單糖；堿-超聲波輔助酶法的聚合度為2.05，其水解程度最低，含有較多的木聚糖。復(fù)合酶法、超聲波輔助復(fù)合酶法、堿-酶法、酸-復(fù)合酶法的聚合度較合適，利于低聚木糖的制備。

2.2 玉米芯處理前后的結(jié)構(gòu)分析

玉米芯預(yù)處理前后結(jié)構(gòu)掃描電鏡圖見圖1和圖2。

圖1 預(yù)處理前后玉米芯掃描電鏡圖Fig.1 Scanning electron micrograph of corncob before and after pretreatment

圖2 預(yù)處理前后玉米芯掃描電鏡圖Fig.2 Scanning electron micrograph of corncob before and after pretreatment

由圖1和圖2可知，粉碎后的玉米芯原料組織結(jié)構(gòu)完整，沒有破壞的痕跡；復(fù)合酶法和超聲波輔助復(fù)合酶法的玉米芯殘?jiān)慕M織結(jié)構(gòu)出現(xiàn)了不同程度的空洞，結(jié)構(gòu)變得疏松，表面粗糙不平整；高溫蒸煮-酸法處理的玉米芯殘?jiān)M織結(jié)構(gòu)平滑，聚集成塊；堿-酶法和堿-超聲波輔助酶法得到的玉米芯組織結(jié)構(gòu)成碎片狀，并粘連在一起；酸-復(fù)合酶法得到的玉米芯組織結(jié)構(gòu)黏稠不成形，粘在一起，表面出現(xiàn)蜂窩。從玉米芯的組織結(jié)構(gòu)變化可以看出，堿切斷了玉米芯組織粘合成片，酸把玉米芯的結(jié)構(gòu)打碎粘合成塊，酶具有專一性，破壞了玉米芯組織，使玉米芯的組織結(jié)構(gòu)出現(xiàn)空洞，變得疏松。木質(zhì)纖維素玉米芯中的半纖維素以氫鍵和范德華力與木質(zhì)素緊密連接，導(dǎo)致木質(zhì)纖維素具有一定的抗降解能力，不同的預(yù)處理方法均為通過破壞纖維素、半纖維素和木質(zhì)素之間的連接鍵，提高木質(zhì)纖維素的降解效率。不同的玉米芯處理方法均使玉米芯結(jié)構(gòu)變得微細(xì)化，出現(xiàn)多碎片，其組織表面已經(jīng)由處理前的平面結(jié)構(gòu)變成蜂窩狀結(jié)構(gòu)，玉米芯的組織結(jié)構(gòu)受到了破壞，表面積與體積比增大，部分結(jié)構(gòu)分解，產(chǎn)生了低聚合度的糖類物質(zhì)[17]。

2.3 不同制備方法水解液中組分分析

2.3.1 薄層層析分析

不同制備方法的薄層層析見圖3。

圖3 薄層層析圖Fig.3 Thin-layer chromatogram

由圖3可知，復(fù)合酶法和超聲波輔助復(fù)合酶法制備的水解液中主要為木糖、木二糖和木三糖，堿-酶法制備的水解液中主要為木四糖，高溫蒸煮-酸法制備的水解液中主要為木糖和木二糖，堿-超聲波輔助酶法制備的水解液中沒有呈現(xiàn)明顯的條帶，酸-復(fù)合酶法制備的水解液中主要為木糖、木二糖和木三糖。

2.3.2 高效液相色譜分析

不同方法制備的水解液中低聚木糖各組分的含量見表2。

表2 玉米芯水解液組分分析

由表2可知，復(fù)合酶法制備的低聚木糖中木糖、木二糖、木三糖和木四糖含量分別為66.56，30.45，6.61，10.04 mg/g，低聚木糖得率為4.71%(以木二糖、木三糖和木四糖之和計(jì))，纖維素酶作用于木質(zhì)纖維素中的纖維素，降低植物細(xì)胞壁的抗降解能力，有利于木聚糖的提取和水解，木聚糖酶可以將木聚糖的β-1,4-糖苷鍵定向水解生成低聚木糖；超聲波輔助復(fù)合酶法制備的低聚木糖中木糖、木二糖和木三糖含量分別為43.35，17.81，1.04 mg/g，木四糖未檢測(cè)出，低聚木糖得率為1.88%，超聲波促使酶與底物作用，在較低溫度和較短時(shí)間內(nèi)完成水解反應(yīng)，但超聲功率過高會(huì)破壞酶的活性；堿-酶法制備的低聚木糖中木糖、木二糖和木四糖含量分別為64.37，57.89，42.83 mg/g，未檢測(cè)出木三糖，低聚木糖得率為10.07%，堿法能夠溶解木質(zhì)素，破壞纖維素、半纖維素和木質(zhì)素之間的連接，易于分離半纖維素，產(chǎn)物中含鹽量高，需脫鹽純化；高溫蒸煮-酸法制備的水解液中主要為木糖，含量為283.35 mg/g，未檢測(cè)出木二糖、木三糖和木四糖，高溫蒸煮利用高溫水破壞木質(zhì)素與半纖維素之間的連接，實(shí)現(xiàn)半纖維素有效分離[18]，酸解法產(chǎn)物中單糖較多，水解程度不易控制；堿-超聲波輔助酶法制備的低聚木糖中木糖、木二糖、木三糖和木四糖含量分別為28.51，73.28，11.13，39.91 mg/g，低聚木糖得率為12.43%；酸-復(fù)合酶法制備的低聚木糖中木糖、木二糖和木三糖含量分別為69.81，71.24，1.98 mg/g，未檢測(cè)出木四糖，低聚木糖得率為7.32%。

3 結(jié)論

通過高溫蒸煮-酸法、堿-酶法和酸-復(fù)合酶法制備的玉米芯低聚木糖水解液中還原糖的含量較高，超聲波輔助復(fù)合酶法制備的水解液中還原糖含量最低。不同制備方法處理后的玉米芯殘?jiān)Y(jié)構(gòu)變得疏松多孔，部分呈現(xiàn)蜂窩狀。

高溫蒸煮-酸法制備的玉米芯水解液中主要為木糖，復(fù)合酶法、超聲波輔助復(fù)合酶法、堿-酶法、堿-超聲波輔助酶法和酸-復(fù)合酶法水解液中均含有不同量的木二糖、木三糖和木四糖，低聚木糖提取率分別為4.71%、1.88%、10.07%、12.43%和7.32%，其中堿-酶法、酸-復(fù)合酶法和堿-超聲波輔助酶法制備的低聚木糖中木二糖含量較高，分別為57.89，71.24，73.28 mg/g；超聲波輔助復(fù)合酶法制備的低聚木糖中木二糖含量最低，為17.81 mg/g。