李雪微，郭超程，宋瑤，高長(zhǎng)斌，張小康，熊秋芳，劉克德

1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070；2.武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，武漢 430345；3.武漢萊菔農(nóng)業(yè)科技有限公司，武漢 430345

蘿卜（Raphanus sativusL.）是十字花科蘿卜屬1年生或2年生草本植物，是我國(guó)秋、冬季的主要蔬菜之一。葉片是植物進(jìn)行光合作用及蒸騰作用的主要場(chǎng)所。蘿卜葉形各異，根據(jù)葉緣形狀及裂刻深淺可大致分為花葉（羽狀深裂或全裂）和板葉（全緣或葉緣淺裂）2 種類型［1-2］。研究表明，花葉透光性好，空氣流通性強(qiáng)，可減輕病蟲危害，提高作物的品質(zhì)與產(chǎn)量，是植物適應(yīng)環(huán)境的重要表現(xiàn)［3-4］。因此，葉形是蘿卜重要的產(chǎn)量性狀。此外，蘿卜花葉對(duì)板葉為顯性，在生產(chǎn)上常作為指示性狀用于雜種純度鑒定，是蘿卜育種的重要性狀之一［5］。然而，目前關(guān)于蘿卜花葉性狀的遺傳機(jī)制尚不明確。

近年來，隨著蘿卜參考基因組的公布及高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，蘿卜重要性狀的遺傳及基因定位研究有了較大的進(jìn)展，但多集中在根部性狀如根部形態(tài)、色澤等，未見花葉基因的相關(guān)報(bào)道［6］。十字花科植物葉緣裂刻基因（花葉基因）的定位主要集中蕓薹屬植物白菜（Brassica rapa）［7］、甘藍(lán)型油菜（B.napus）［8-9］和甘藍(lán)（B. oleracea）［10］。前人研究表明，蘿卜（2n=18，RR）與蕓薹屬植物親緣關(guān)系近，蘿卜基因組與擬南芥基因組（2n=10）及蕓薹屬物種基因組如白菜基因組（2n=20，AA）之間存在較好的共線性關(guān)系，這些共線性區(qū)塊可為蘿卜重要性狀QTLs的候選基因鑒定提供幫助［11-13］。本研究以胞質(zhì)雄性不育材料WA（板葉）為母本、恢復(fù)系材料J4（花葉）為父本構(gòu)建F2葉形分離群體，利用BSA 結(jié)合GBS 的極端混池測(cè)序法（bulked segregant analysis sequencing，BSA-seq）對(duì)蘿卜花葉基因進(jìn)行初定位，通過將蘿卜全基因組與甘藍(lán)型油菜全基因組進(jìn)行共線性比對(duì)，并結(jié)合基因功能注釋確定蘿卜花葉性狀的候選基因，旨在為蘿卜花葉基因克隆、葉形改良及輔助選育蘿卜花葉品種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

以胞質(zhì)雄性不育材料WA（板葉）為母本，恢復(fù)系材料J4（花葉）為父本，構(gòu)建F2群體，用于花葉性狀的遺傳分析和基因定位研究。11個(gè)蘿卜栽培品種（7個(gè)花葉品種與4 個(gè)板葉品種）用于候選基因的序列分析。供試材料均由武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所蘿卜育種室提供。

1.2 葉形性狀調(diào)查及遺傳分析

蘿卜植株長(zhǎng)至5～6 片真葉時(shí)進(jìn)行葉形調(diào)查。F2單株表型鑒定時(shí)要先對(duì)單株編號(hào)并掛牌，每個(gè)單株的表型分別調(diào)查3次，確保表型無誤后計(jì)算F2群體的葉形分離比，并進(jìn)行卡方檢驗(yàn)。

1.3 基因組DNA的提取及Bulk池建立

按照掛牌順序進(jìn)行取樣，每個(gè)單株約取0.25 g幼嫩葉片，放入96 孔深孔板內(nèi)。采用改良的CTAB 法提取DNA，并用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)所提DNA的質(zhì)量。根據(jù)F2群體表型，隨機(jī)選取20個(gè)花葉單株DNA和20 個(gè)板葉單株DNA，經(jīng)Qubit 測(cè)定濃度后，將20個(gè)花葉單株的DNA 和20個(gè)板葉單株的DNA 分別等質(zhì)量混合構(gòu)成花葉DNA 混池（Bulk 1，BK1）和板葉DNA 混池（Bulk 2，BK2），并將終質(zhì)量濃度調(diào)整至25 ng/μL。

1.4 簡(jiǎn)化基因組測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建

用Chen 等［14］的方法構(gòu)建簡(jiǎn)化基因組測(cè)序文庫(kù)。即用SacⅠ和MseⅠ對(duì)親本和2 個(gè)混池的基因組DNA 分別進(jìn)行雙酶切，然后分別連接上含有不同標(biāo)簽序列的接頭。將帶有不同標(biāo)簽的連接產(chǎn)物混合成1個(gè)測(cè)序文庫(kù)，經(jīng)PCR 產(chǎn)物回收試劑盒（Qiagen）純化濃縮后在2%的瓊脂糖凝膠上電泳分離，并用膠回收試劑盒（Qiagen）將220～500 bp的片段進(jìn)行回收。利用PCR 反應(yīng)給每個(gè)混合測(cè)序文庫(kù)引入與Illumina flow cell上固定的寡核苷酸互補(bǔ)配對(duì)的序列，PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后用膠回收試劑盒回收目標(biāo)片段。構(gòu)建好的測(cè)序文庫(kù)在HiSeq 4000 平臺(tái)上進(jìn)行測(cè)序。

1.5 測(cè)序數(shù)據(jù)分析

用 FastQC（https：//www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/）檢測(cè)測(cè)序原始序列的質(zhì)量，并用Trimmomatic［15］軟件進(jìn)行質(zhì)量控制。質(zhì)控后的數(shù)據(jù)經(jīng)BWA 比對(duì)到蘿卜參考基因組（http：//radish-genome.org/）上，再用 GATK［16］提取全基因組變異信息，用ANNOVAR［17］對(duì)變異信息進(jìn)行注釋。BWA 和Samtools 分析均使用默認(rèn)參數(shù)，GATK使用的過濾參數(shù)為“QUAL ＜30.0 || QD ＜4.0 ||FS ＞ 60.0||MQ ＜ 40.0 ”。

1.6 候選基因的初定位

以蘿卜參考基因組作為參考，利用QTLseqr 軟件［18］計(jì)算每個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)在2 個(gè)混池中的SNP-index 及Δ（SNP-index）。使用滑窗分析方法計(jì)算500 kb 區(qū)段內(nèi)SNP-index 及Δ（SNP-index）的均值，并對(duì)其在染色體上的分布作圖，步長(zhǎng)2 Mb。兩池中差異較大的區(qū)段即為蘿卜花葉基因的候選區(qū)段。

1.7 蘿卜基因組與油菜基因組的共線性分析

利用MCScanX［19］分析蘿卜基因組與甘藍(lán)型油菜基因組的共線性關(guān)系。并對(duì)蘿卜花葉基因定位區(qū)間內(nèi)的共線性區(qū)段進(jìn)行基因功能注釋，預(yù)測(cè)蘿卜花葉候選基因。

1.8 候選基因的序列分析

基于蘿卜參考基因組，在Rs390250全長(zhǎng)、上游1 kb 和下游 200 bp 處共設(shè)計(jì) 3 對(duì)引物（Rs-1F/Rs-1R、Rs-2F/Rs-2R、Rs-3F/Rs-3R）分別對(duì)親本進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 產(chǎn)物直接進(jìn)行測(cè)序，并利用Sequencher（GeneCodes，USA）軟件進(jìn)行測(cè)序序列的比對(duì)與變異位點(diǎn)檢測(cè)。針對(duì)親本序列間存在的664 bp插入變異（Indel664）開發(fā)成分子標(biāo)記（Rs-3F/Rs-2R），擴(kuò)增F2群體中表型為板葉（隱性）的單株，檢測(cè)該候選基因是否與花葉性狀共分離。引物序列見表1。

表1 Rs390250擴(kuò)增引物Table 1 Primers for Rs390250 amplification

1.9 表達(dá)量分析

當(dāng)植株長(zhǎng)到5～6 片真葉時(shí)，采用Trizol Reagent方法分別提取花葉與板葉親本真葉的RNA，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA 的質(zhì)量并用Nanodrop（Thermo Scientific，USA）檢測(cè)RNA 純度。利用RevertAid First strand cDNA synthesis kit（Thermo Scientific，USA）合成cDNA 的第一鏈作為模板，進(jìn)行親本的RT-PCR 反應(yīng)，檢測(cè)候選基因Rs390250的表達(dá)水平。Rs390250基因特異性引物Rsa 來自https：//biodb.swu.edu.cn/qprimerdb/［20］，Actin［6］作為對(duì)照基因（引物序列見表1）。

1.10 LMI1-like基因的序列比對(duì)與進(jìn)化樹構(gòu)建

利用MEGA7 軟件對(duì)已報(bào)道的多個(gè)控制葉緣裂刻的LMI1-like基因進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)，并對(duì)來自蕓薹屬植物和蘿卜的基因序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。統(tǒng)計(jì)方法選用最大似然法，系統(tǒng)發(fā)育測(cè)驗(yàn)釆用“Bootstrap”重復(fù)1 000 次。Rs390250的氨基酸序列在http：//radish-genome.org/下載。來自擬南芥、白菜、甘藍(lán)及甘藍(lán)型油菜的基因序列在http：//brassicadb.org/brad/下載，其余基因的序列在 NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）通過 Genbank 號(hào)［ChLMI1（KF939590） ，RCO（LMI1-like2，KF939591） ，LMI1-like3（KF939592） ，CaLMI1（PHT71668） ，CgRCO（KM214233） ，CrRCO（KM214232）］檢索并下載。

2 結(jié)果與分析

2.1 花葉性狀的遺傳分析

親本J4 葉緣鋸齒銳尖，部分裂刻直達(dá)中脈，表現(xiàn)為花葉；親本W(wǎng)A 葉緣有小齒近全緣，表現(xiàn)為板葉（圖1）。F1植株全為花葉，裂刻深度介于雙親中間。F2群體共287 個(gè)單株，其中花葉有219 株，板葉有68株，花葉與板葉的分離比為3.22∶1，符合預(yù)期的孟德爾分離比（χ2＝0.227＜3.84），表明花葉性狀受1 對(duì)基因控制，花葉對(duì)板葉呈不完全顯性。

圖1 蘿卜葉形Fig.1 The leaf shape of Raphanus sativus L.

2.2 混池測(cè)序與葉形基因初步定位

利用BSA-seq［21］分別對(duì)花葉和板葉親本及BK1和BK2進(jìn)行簡(jiǎn)化基因組測(cè)序。花葉親本J4和板葉親本W(wǎng)A分別獲得2 500 383和3 453 168條雙端序列，花葉混池BK1 和板葉混池BK2 分別得到2 851 995和4 844 581 條序列。將親本及2 個(gè)混池的序列分別比對(duì)到蘿卜參考基因組，經(jīng)質(zhì)量控制及親本的基因型篩選后，共得到4 543 個(gè)高質(zhì)量多態(tài)性位點(diǎn)，包括3 851 個(gè) SNP（single nucleotide polymorphism）位點(diǎn)和692個(gè)Inde（lInsertion/Deletion）位點(diǎn)。利用QTLseqr軟件分別計(jì)算 BK1 和 BK2 的 SNP-index 及 Δ（SNP-index）（移動(dòng)窗口為2 Mb）（圖2），結(jié)果顯示在 R7 染色體 66 425～7 968 993 bp 區(qū)間內(nèi)Δ（SNP-index）超過閾值0.5（P=0.000 1），表明蘿卜花葉基因可能位于該區(qū)間內(nèi)。

圖2 BSA-seq定位蘿卜花葉基因Fig.2 Genetic mapping of leaf shape gene by BSA-seq

2.3 共線性分析及蘿卜花葉候選基因分析

通過將蘿卜全基因組與甘藍(lán)型油菜全基因組進(jìn)行共線性分析，發(fā)現(xiàn)位于蘿卜R7 染色體花葉候選區(qū)間0.87～1.32 Mb 與油菜A10 染色體的16.35～16.80 Mb 存在很好的共線性（圖3）。甘藍(lán)型油菜中存在類似的花葉變異，油菜花葉基因BnLL1.LMI1（BnaA10g26320D）和BnA10.LMI1（BnaA10g26330D）都位于該共線性染色體區(qū)段［7-9］。根據(jù)蘿卜參考基因組對(duì)該區(qū)段內(nèi)的70 個(gè)基因進(jìn)行注釋分析發(fā)現(xiàn)，Rs390250（899 863～901 651 bp）與油菜花葉基因BnaA10g26320D、BnaA10g26330D及擬南芥AT5G037 90（LMI1，Late Meristem Identity1）是直向同源基因，都屬于HD-ZipⅠ家族，編碼 HD-ZipⅠ（the classⅠhomeodomain leucine-zipper）轉(zhuǎn)錄因子。在擬南芥葉發(fā)育調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，LMI1位于分生組織調(diào)節(jié)因子LFY（Leafy）下游，誘導(dǎo)CAL（Cauliflower）基因表達(dá)，影響擬南芥鋸齒葉的形成［22］。因而，我們推測(cè)Rs390250為控制蘿卜花葉的候選基因。

圖3 蘿卜花葉基因候選區(qū)間的共線性分析Fig.3 The collinearity analysis in the candidate interval of the lobed-leaf gene

2.4 候選基因的序列比較分析

Rs390250基因全長(zhǎng)1 789 bp，由3 個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子組成，編碼220個(gè)氨基酸。根據(jù)蘿卜參考基因組，分別擴(kuò)增了親本Rs390250翻譯起始點(diǎn)（translation start site，TSS）上游1 kb 及編碼區(qū)序列，并進(jìn)行PCR 產(chǎn)物測(cè)序。序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，在基因的開放閱讀框（open reading frame）內(nèi)存在 3 個(gè) SNP（G84C、A177T 和T425C）。其中，A177T 為同義突變（synonymous mutation），而 G84C 和 T425C 是非同義突變（non-synonymous mutation）（圖4A、B）。在啟動(dòng)子區(qū)，位于 TTS 上游-418 bp 處，J4 存在 149 bp 的插入序列，其中130 bp 與插入位點(diǎn)后的130 bp 序列重復(fù)。另外，在J4 的第一內(nèi)含子內(nèi)還存在664 bp 的插入序列（圖4A）。該插入序列兩側(cè)存在9 bp 目標(biāo)信號(hào)復(fù)制（target sigte duplicate）序列GTTTTTAAA，插入序列兩端存在4 bp 的末端反向重復(fù)序列（GAGTTATTCTTGGGTTCACCCCCTAGGGT -GAACCTTTAGGTTCACC）。檢索轉(zhuǎn)座子數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//pmite.hzau.edu.cn）［23］，發(fā)現(xiàn)該 664 bp 的插入序列屬于Mutator類轉(zhuǎn)座子。

為了檢測(cè)該轉(zhuǎn)座子是否與花葉基因共分離，在664 bp 插入序列兩側(cè)設(shè)計(jì)引物（Rs-3F/Rs-2R），擴(kuò)增F2群體內(nèi)的68 個(gè)隱性單株（板葉表型），瓊脂糖膠檢測(cè)發(fā)現(xiàn)這68 個(gè)單株的基因型同母本（WA）相同，且比J4 擴(kuò)增片段小了約700 bp，即都不含有這664 bp的插入（圖4C），這表明該基因在群體內(nèi)同花葉性狀共分離。RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，Rs390250的轉(zhuǎn)錄水平在WA 和J4 的真葉內(nèi)無明顯差異（圖4D），表明葉形變異可能與啟動(dòng)子及內(nèi)含子中的插入序列無關(guān)。

Rs390250編碼 HD-ZipⅠ（the class I homeodomain leucine-zipper）轉(zhuǎn)錄因子。HD-ZipⅠ蛋白由同源異型域（homeodomain，HD）與緊隨其后的亮氨酸拉鏈（leucine zipper，LZ）結(jié)構(gòu)域組成。LZ 結(jié)構(gòu)域具有多個(gè)亮氨酸，能形成二聚體結(jié)構(gòu)幫助HD-Zip 蛋白識(shí)別目標(biāo)DNA，對(duì)HD-ZipⅠ轉(zhuǎn)錄因子的功能發(fā)揮具有重要作用［24］。本研究中，位于Rs390250第 3 外顯子的非同義突變位點(diǎn)T425C 將導(dǎo)致該位點(diǎn)編碼的絲氨酸（serine，S）變?yōu)榱涟彼幔╨eucine，L），且該位點(diǎn)恰位于LZ 結(jié)構(gòu)域內(nèi)（圖4B）。這表明，該位點(diǎn)的突變可能破壞了LZ 結(jié)構(gòu)域的形成，進(jìn)而對(duì)HD-ZipⅠ轉(zhuǎn)錄因子的功能造成影響。為驗(yàn)證以上猜想，本研究對(duì)多個(gè)已報(bào)道的控制葉緣裂刻的LMI1-like基因在LZ 結(jié)構(gòu)域上的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，并將Rs390250與擬南芥LMI1-like基因及蕓薹屬物種報(bào)道的花葉基因進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。結(jié)果顯示，所有花葉基因同Rs390250-J4 在該位點(diǎn)上都翻譯為S，僅WA 翻譯為L(zhǎng)，表明該位點(diǎn)的S 為保守氨基酸（圖5A），且該基因同BnaA10g26320D屬于RCO（reduced complexity，LMI1-like2）類型（圖5B）。進(jìn)一步對(duì)來自11 個(gè)蘿卜栽培品種的Rs390250序列進(jìn)行擴(kuò)增并進(jìn)行Sanger測(cè)序，結(jié)果顯示，所有板葉品種在該位點(diǎn)上基因型為T/T，花葉材料在該位點(diǎn)上表現(xiàn)為C/C 或C/T（表2）。綜上，T425C 可能是導(dǎo)致蘿卜葉形變異的關(guān)鍵位點(diǎn)。

表2 11個(gè)蘿卜栽培品種的表型與基因型Table 2 The genotype of the 425th nucleotide in the coding sequence of Rs390250 from 11 radish varieties

3 討 論

花葉是十字花科植物廣泛存在的一種類型。LMI1是調(diào)控?cái)M南芥葉緣發(fā)育的重要基因。近年來，十字花科蕓薹屬植物中定位到的控制葉緣裂刻的基因（花葉基因）有Bra009510（B. rapa）、BnaA10g26320D和BnaA10g26330D（B. nupus）、Bol010029和Bol010030（B. oleraceavar .acephala DC.），以上基因都是At5g03790（LMI1）的同源基因，這表明LMI1-like基因在十字花科植物里主要控制葉緣裂刻的發(fā)生，功能相對(duì)保守。

本研究通過將同屬十字花科植物的蘿卜參考基因組與甘藍(lán)型油菜參考基因組進(jìn)行共線性分析，在初定位區(qū)間內(nèi)發(fā)現(xiàn) 1 個(gè)LMI1-like基因（Rs390250），注釋分析和序列分析結(jié)果表明其可能是控制蘿卜花葉的候選基因。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明Rs390250屬于RCO類型，前人研究顯示RCO控制復(fù)葉的小葉形成，將RCO導(dǎo)入擬南芥中，植株葉緣出現(xiàn)明顯的裂刻［25-26］。蘿卜和油菜的葉片都屬于簡(jiǎn)單葉，BnaA10g26320D已被證實(shí)是控制甘藍(lán)型油菜裂葉的關(guān)鍵基因［8］，這表明RCO類基因在簡(jiǎn)單葉中也能控制葉緣的發(fā)育。此外，前人研究結(jié)果顯示BnaA10g26320D在Yuye87（裂葉親本）和Zheyou 50（淺裂親本）中表達(dá)量差異很大；BnaA10g26330D在以上材料中表達(dá)量較低且無明顯變化，但在HY（裂）和J9707（淺裂）中差異顯著［8-9］，這2 個(gè)基因控制的葉形變異都被認(rèn)為是因順式調(diào)控引起的不同等位基因效應(yīng)造成的。本研究中，Rs390250在板葉和花葉親本中的表達(dá)量無明顯差異，而位于第二外顯子的非同義突變位點(diǎn)T425C恰好位于LZ 結(jié)構(gòu)域內(nèi)，且導(dǎo)致保守氨基酸的改變，這對(duì)HD-ZIP 蛋白的功能可能造成影響。故本研究認(rèn)為該位點(diǎn)的變異可能是造成蘿卜葉形變異的關(guān)鍵原因。本研究結(jié)果可為進(jìn)一步解析蘿卜花葉性狀的形成和RCO類基因的作用機(jī)制進(jìn)而為葉形的改良及輔助選育蘿卜花葉品種奠定基礎(chǔ)。