劉 浪，蔡 風(fēng)，彭源祥，余 波，黎 騰，黃加裕，陳欽燦，萬文兵，廖 琦

(南昌市第一醫(yī)院骨科，南昌 330008)

骨關(guān)節(jié)炎(OA)是全世界中老年人最常見的關(guān)節(jié)疾病，其特征是局部炎癥、關(guān)節(jié)軟骨損傷和軟骨退化[1]。軟骨細(xì)胞是關(guān)節(jié)軟骨組織中唯一的細(xì)胞，分布在軟骨基質(zhì)中，在維持關(guān)節(jié)軟骨的結(jié)構(gòu)和功能完整性方面發(fā)揮著重要作用[2]，是OA發(fā)病的主要促成因素之一[3]，調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞增殖、凋亡、分化等生理功能是防治OA的關(guān)鍵[4]。當(dāng)前OA的治療策略主要是控制癥狀，缺乏有效的治療手段[5]。因此，有必要開發(fā)新的有效治療方法來預(yù)防OA的發(fā)生。長鏈非編碼RNA(lncRNAs)是一類長度超過200個(gè)核苷酸的非編碼RNA分子，不僅與腫瘤的生長、耐藥和轉(zhuǎn)移有關(guān)，而且還參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡和炎癥反應(yīng)[6-9]。目前，隨著對OA發(fā)病機(jī)制研究的深入，lncRNAs對OA發(fā)生發(fā)展的調(diào)控作用不斷被發(fā)現(xiàn)[10-11]。小核仁RNA宿主基因1(SNHG1)是一種新型lncRNA，位于染色體11q12.3。越來越多的證據(jù)[12-13]表明，SNHG1的功能障礙與骨肉瘤、結(jié)直腸癌、肝癌等人類疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。此外，近期研究[14]還發(fā)現(xiàn)lncRNA SNHG1可能參與了OA的發(fā)生發(fā)展。然而，SNHG1在OA發(fā)展過程中的生物學(xué)作用需進(jìn)一步研究，基于此，本研究旨在探討SNHG1在OA發(fā)展過程中對軟骨細(xì)胞的保護(hù)作用及其潛在機(jī)制，為OA治療提供理論基礎(chǔ)與新的視角。

1 材料與方法

1.1 軟骨樣本

人軟骨標(biāo)本來源于南昌市第一醫(yī)院2019年12月31日至2020年12月31日收治的12例膝骨關(guān)節(jié)炎行關(guān)節(jié)置換患者(年齡57～71歲，平均64.5歲)，按照軟骨損傷Outerbridge分級對切取的軟骨標(biāo)本進(jìn)行分級，其中Ⅰ級定義為相對正常軟骨組織，Ⅲ級為骨關(guān)節(jié)炎軟骨組織。

1.2 軟骨細(xì)胞培養(yǎng)

軟骨細(xì)胞系A(chǔ)TDC5來自吉妮歐生物科技公司，細(xì)胞在含10% FBS(Gibco)的DMEM(Gibco)中重懸，并置于無菌濕潤的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(37 ℃和5%CO2)。

1.3 構(gòu)建OA軟骨細(xì)胞模型

使用10 ng·mL-1IL-1β(上海生工生物工程有限公司)誘導(dǎo)ATDC5軟骨細(xì)胞24 h，建立OA軟骨細(xì)胞模型。

1.4 qRT-PCR檢測

使用Trizol試劑(美國Invitrogen公司)從OA軟骨組織或軟骨細(xì)胞中提取總RNA。將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。接下來，使用SYBR Green PCR Kit(日本Takara公司)對引物片段進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增。GAPDH作為mRNA和lncRNA的內(nèi)參，U6作為miRNA的內(nèi)參。各基因的相對表達(dá)量采用2-△△Ct法計(jì)算。

SNHG1正向(F)：5′-CCGCTCGAGCTCATT-TTTCCTTGTTCG-3′，反向(R)：5′-CGCGGATC-CGCAAAGAATTATTTCATC-3′；miR-186-5p(F)：5′-AAGAATTCTCCTTTTGGGCT-3′，(R)：5′-GT-GCGTGTCGTGGAGTCG-3′；Runx2(F)：5′-AACGATCTGAGATTTGTGGGC-3′，(R)：5′-CCTGC-GTGGGATTTCTTGGTT-3′；PCNA(F)：5′-AACCAGGAGAAAGTTTCAG-3′，(R)：5′-GCACAGGAAATTACAACAG-3′。

1.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

使用Lipofectamine 2000試劑(美國Life Technologies公司)進(jìn)行轉(zhuǎn)染(詳細(xì)步驟參考Lipofectamine 2000 reagent說明書)將寡核苷酸或重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到OA軟骨細(xì)胞模型中。SNHG1質(zhì)粒、miR-186-5p模擬物、si-SNHG1及其相應(yīng)的陰性對照(蘇州Genepharma公司)。

1.6 MTT法檢測

采用MTT法檢測OA軟骨細(xì)胞的增殖活性，具體步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。將轉(zhuǎn)染的軟骨細(xì)胞接種在96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，按培養(yǎng)基1/5體積加入MTT工作液繼續(xù)孵4 h，離心機(jī)離心后棄上清。加入DMSO 100 μL·孔-1，待結(jié)晶完全溶解，用酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光度值。

1.7 細(xì)胞凋亡率檢測

使用膜聯(lián)蛋白V-FITC凋亡檢測試劑盒(美國Invitrogen公司)檢測細(xì)胞凋亡率。軟骨細(xì)胞被胰蛋白酶消化并重新懸浮在培養(yǎng)基中，在避光暗盒中使用V-FITC和PI染色后通過流式細(xì)胞儀測量細(xì)胞凋亡的百分比。

1.8 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測

使用Lipofectamine 2000試劑將miR-186-5p模擬物或miR-NC轉(zhuǎn)入含有突變型SNHG1(SNHG1- MUT)或野生型SNHG1(SNHG1-WT)質(zhì)粒載體的OA軟骨細(xì)胞模型中。轉(zhuǎn)染48 h后，使用試劑盒(美國Promega公司)測定軟骨細(xì)胞中的熒光素酶活性。

1.9 蛋白質(zhì)免疫印跡法

使用RIPA(萬特生物工程有限公司)裂解液和提取細(xì)胞中的總蛋白質(zhì)，并使用BCA(萬特生物)蛋白質(zhì)濃縮試劑盒進(jìn)行定量。定量總蛋白通過10% SDS-PAGE凝膠分離并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，然后，用5%的脫脂牛奶封閉膜2 h，接著分別用抗PCDA、抗Runx2一抗(美國Proteintech Group公司)將膜在4 ℃下孵育過夜，然后用二抗(美國Proteintech Group公司)在室溫下孵育1 h。使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)對蛋白質(zhì)條帶進(jìn)行著色，并以GAPDH作為蛋白質(zhì)的內(nèi)參。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 SNHG1在OA軟骨組織與細(xì)胞中的表達(dá)

與正常軟骨組織相比，SNHG1在OA軟骨組織中的表達(dá)水平明顯降低(P<0.01)；同時(shí)，與正常軟骨細(xì)胞相比，SNHG1在OA軟骨細(xì)胞中的表達(dá)水平顯著下調(diào)(P<0.01)。此外，將si-SNHG1或SNHG1轉(zhuǎn)染OA軟骨細(xì)胞后，SNHG1過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染明顯上調(diào)SNHG1表達(dá)(P<0.01)，而si-SNHG1轉(zhuǎn)染明顯下調(diào)SNHG1表達(dá)(P<0.01)。見圖1。

A：SNHG1在OA軟骨組織與正常軟骨組織中的表達(dá)；B：SNHG1在OA軟骨細(xì)胞與正常軟骨細(xì)胞中的表達(dá)；C：SNHG1過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染OA軟骨細(xì)胞后SNHG1的表達(dá)；D：si-SNHG1轉(zhuǎn)染OA軟骨細(xì)胞后SNHG1的表達(dá)；**P<0.01。

2.2 SNHG1對OA軟骨細(xì)胞增殖、凋亡、分化的影響

si-SNHG1轉(zhuǎn)染后OA軟骨細(xì)胞凋亡率顯著增加(P<0.01)，增殖活力顯著降低(P<0.05)，分化相關(guān)分子Runx2(runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2)mRNA蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.01)，增殖相關(guān)分子PCNA(增殖細(xì)胞核抗原)表達(dá)水平顯著降低(P<0.01)；而SNHG1過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后OA軟骨細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)，增殖活力顯著升高(P<0.01),Runx2 mRNA蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.01)，PCNA表達(dá)水平顯著增加(P<0.01)，見圖2。結(jié)果表明，過表達(dá)的SNHG1可以增強(qiáng)OA軟骨細(xì)胞活力，抑制OA軟骨細(xì)胞凋亡及分化，對OA軟骨細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用。

A、B：流式細(xì)胞術(shù)檢測過表達(dá)SNHG1質(zhì)粒、si-SNHG1轉(zhuǎn)染后OA軟骨細(xì)胞凋亡率；C、D：MTT法檢測過表達(dá)SNHG1質(zhì)粒、si-SNHG1轉(zhuǎn)染后OA軟骨細(xì)胞增殖活力；E—H:蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測過表達(dá)SNHG1質(zhì)粒、si-SNHG1轉(zhuǎn)染后OA軟骨細(xì)胞中PCNA和Runx2 mRNA的表達(dá)；*P<0.05，**P<0.01。

2.3 miR-186-5p作為lncRNA-SNHG1的靶基因鑒定

本研究利用Starbase預(yù)測SNHG1在miR-186-5p中可能存在靶向結(jié)合位點(diǎn)(圖3A)。將SNHG1-MUT(突變型)或SNHG1-WT(野生型)載體與miR-186-5p mimics(模擬物)或miR-NC共轉(zhuǎn)染到OA軟骨細(xì)胞中，以確定SNHG1和miR-186-5p間的相互作用，結(jié)果顯示，在與miR-186-5p模擬物共轉(zhuǎn)染后，SNHG1-WT組細(xì)胞的熒光素酶活性顯著低于SNHG1-MUT組(P<0.01，圖3B)。此外，qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，過表達(dá)SNHG1轉(zhuǎn)染顯著降低miR-186-5p的表達(dá)(P<0.05)，而si-SNHG1轉(zhuǎn)染顯著增加miR-186-5p的表達(dá)(P<0.01，圖3C)；且miR-186-5p與OA軟骨組織中SNHG1基因表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)(圖3D)。以上結(jié)果證實(shí)miR-186-5p是SNHG1在OA軟骨細(xì)胞中的直接靶基因。

A：SNHG1與miR-186-5p的結(jié)合位點(diǎn)；B：雙熒光素酶基因檢測報(bào)告；C：qRT-PCR檢測結(jié)果；D：OA軟骨組織中miR-186-5p與SNHG1基因表達(dá)的相關(guān)性；*P<0.05，**P<0.01。

2.4 SNHG1通過靶向抑制miR-186-5p調(diào)控OA軟骨細(xì)胞的增殖、凋亡和分化

與SNHG1單獨(dú)轉(zhuǎn)染相比，miR-186-5p模擬物和SNHG1共轉(zhuǎn)染的OA軟骨細(xì)胞凋亡率顯著增加(P<0.01，圖4A—B)；細(xì)胞增殖活力顯著降低(P<0.01，圖4C)；PCNA表達(dá)水平顯著降低，Runx2表達(dá)水平顯著增加(P<0.01，圖4D—E)。結(jié)果表明，SNHG1可以與OA軟骨細(xì)胞中的miR-186-5p競爭性結(jié)合，從而改善軟骨細(xì)胞的增殖、分化并抑制細(xì)胞凋亡。

3 討論

OA是最常見的關(guān)節(jié)疾病之一，正在成為世界范圍內(nèi)的公共衛(wèi)生問題[15]。OA的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，軟骨細(xì)胞增殖和凋亡失衡是導(dǎo)致OA的主要因素之一，而lncRNA與軟骨細(xì)胞關(guān)系密切[8，16]。本研究結(jié)果顯示，SNHG1在OA軟骨細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，這與LEI等[14]的研究一致。最近的一項(xiàng)研究[17]發(fā)現(xiàn)SNHG1通過與多吡啶束結(jié)合蛋白1(PTBP1)相互作用調(diào)節(jié)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞侵襲和增殖。本研究發(fā)現(xiàn)SNHG1可以改善IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞細(xì)胞凋亡、增殖并降低細(xì)胞分化因子runx2的表達(dá)。這些結(jié)果表明SNHG1抑制了OA的發(fā)生和發(fā)展。

有研究[18]表明SNHG1有成為癌癥診斷、預(yù)后和治療的腫瘤生物標(biāo)志物的可能，SNHG1通過激活不同的信號通路參與了人類癌癥的發(fā)生[19-21]。LI等[22]研究表明LncRNA SNHG1通過與DNMT1(DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1)結(jié)合抑制p53表達(dá)促進(jìn)肝癌發(fā)展；JI等[23]研究表明lncRNA SNHG1通過miR-195/NEK2軸促進(jìn)宮頸癌的進(jìn)展。此外，miR-577作為骨肉瘤細(xì)胞中SNHG1的ceRNA通過激活骨肉瘤細(xì)胞中的Wnt/β-catenin通路發(fā)揮致癌作用[24]。然而，SNHG1和OA之間的關(guān)系仍有待闡明。根據(jù)生物學(xué)軟件Starbase預(yù)測miR-186-5p可能是SNHG1的直接靶標(biāo)。因此，筆者推測SNHG1可能通過miR-186-5p在OA中發(fā)揮保護(hù)作用。本研究通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測miR-186-5p在敲低或過表達(dá)SNHG1的軟骨細(xì)胞中的相對表達(dá)，發(fā)現(xiàn)miR-186-5p的表達(dá)量與SNHG1呈負(fù)相關(guān)。此外，雙熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果證實(shí)miR-186-5p是OA軟骨細(xì)胞模型中SNHG1的直接靶基因。本研究進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了miR-186-5p對SNHG1介導(dǎo)的OA軟骨細(xì)胞增殖、分化和凋亡的影響。結(jié)果表明，miR-186-5p mimic能夠部分逆轉(zhuǎn)了pc-SNHG1對關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞增殖、分化和凋亡的影響。這進(jìn)一步說明SNHG1通過靶向調(diào)控miR-186-5p調(diào)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展。有研究[25]表明敲低lncRNA MFI2-AS1通過增加miR-130a-3p/TCF4軸保護(hù)脂多糖(LPS)處理的軟骨細(xì)胞的細(xì)胞活力，但抑制細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞外基質(zhì)降解。還有研究[26]表明lncRNA-TUG1通過lncRNA-TUG1/miR-195/MMP-13軸調(diào)控骨關(guān)節(jié)炎細(xì)胞外基質(zhì)的降解。這可能意味著lncRNAs的失調(diào)在各種尚未相關(guān)的慢性炎癥疾病的發(fā)病機(jī)制中具有深遠(yuǎn)的影響。因此，接下來miR-186-5p的下游靶標(biāo)及調(diào)控的信號通路將是本課題組的研究重點(diǎn)。

綜上所述，SNHG1通過靶向調(diào)控miR-186-5p減輕軟骨細(xì)胞炎癥損傷，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡和分化，為OA的治療提供理論參考。