程經(jīng)緯，柳楊青，汪艷芳

肌肉生長(zhǎng)抑制素（Mstn）是1997年發(fā)現(xiàn)的于骨骼肌中高表達(dá)的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β超家族成員之一，又稱為生長(zhǎng)分化因子8，其從小鼠骨骼肌cDNA文庫克隆，對(duì)肌肉量起負(fù)調(diào)節(jié)作用［1］。除影響肌肉生長(zhǎng)分化外，Mstn還具有調(diào)節(jié)脂代謝的作用。文獻(xiàn)報(bào)道，Mstn可在體外抑制前體脂肪細(xì)胞的分化；特異性敲除Mstn基因后，高脂或正常飲食喂養(yǎng)的小鼠均表現(xiàn)為脂肪量減少，肌肉量增加［2-3］。本研究觀察Mstn基因敲除的2型糖尿?。═2DM）小鼠白色脂肪棕色化相關(guān)基因表達(dá)變化，探究Mstn對(duì)T2DM小鼠白色脂肪棕色化的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 野生型（wild type，WT）小鼠12只，雜合型Mstn基因敲除〔Mstn（+/-）〕小鼠12只，純合型Mstn基因敲除〔Mstn（-/-）〕小鼠12只，SPF級(jí)，品系C57BL/6N，6周齡，雄性，由賽業(yè)生物科技有限公司提供〔動(dòng)物實(shí)驗(yàn)許可證號(hào)：SCXK（蘇）2020-0006〕。小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，室內(nèi)溫度22～24 ℃，濕度40%～60%，保持晝夜12 h節(jié)律，自由進(jìn)食、飲水。本研究實(shí)驗(yàn)過程遵循河南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理相關(guān)規(guī)定，符合3R原則。本實(shí)驗(yàn)時(shí)間為2019年1月至2020年1月。

1.2 主要儀器與試劑 AU400全自動(dòng)生化分析儀（美國(guó)Beckman公司）；酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTeK公司）；脫水機(jī)、包埋機(jī)、病理切片機(jī)（武漢俊杰電子有限公司）；光學(xué)顯微鏡及成像系統(tǒng)（日本Nikon公司）；脫色搖床、電泳儀（北京六一生物科技有限公司）；鏈脲佐菌素（STZ，美國(guó)Sigma公司）；游離脂肪酸（FFA）酶聯(lián)免疫試劑盒、兔抗小鼠過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPAR-γ）、過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α（PGC-1α）、解偶聯(lián)蛋白1（UCP1）多克隆抗體（武漢云克隆科技股份有限公司）；兔抗小鼠分化簇137（CD137）多克隆抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）。

本研究行業(yè)貢獻(xiàn)：

目前的肥胖控制手段仍然有限，缺乏治療肥胖和相關(guān)代謝性疾病的有效藥物。白色脂肪主要用于儲(chǔ)存熱量，棕色脂肪主要負(fù)責(zé)產(chǎn)熱。探究白色脂肪向棕色脂肪轉(zhuǎn)化的調(diào)控機(jī)制以及對(duì)外部刺激的感應(yīng)機(jī)制，有助于開發(fā)治療肥胖的新藥物。既往研究表明，肌肉生長(zhǎng)抑制素（Mstn）可能調(diào)控脂肪代謝。本研究在Mstn基因敲除基礎(chǔ)上構(gòu)建2型糖尿病（T2DM）小鼠模型，探究Mstn對(duì)T2DM小鼠白色脂肪棕色化的影響，發(fā)現(xiàn)抑制Mstn基因表達(dá)可上調(diào)白色脂肪棕色化相關(guān)基因表達(dá)，促進(jìn)T2DM白色脂肪棕色化，改善肥胖，為肥胖、T2DM等代謝性疾病的治療提供了新策略及新靶點(diǎn)。

1.3 分組及動(dòng)物模型構(gòu)建 將12只WT小鼠、12只Mstn（+/-）小鼠、12只Mstn（-/-）小鼠隨機(jī)各分為2組，每組6只，分別為WT組、WT+DM組，Mstn（+/-）組、Mstn（+/-）+DM組，Mstn（-/-）組、Mstn（-/-）+DM組，每組6只，其中WT組、Mstn（+/-）組、Mstn（-/-）組給予普通飲食6周，WT+DM組、Mstn（+/-）+DM組、Mstn（-/-）+DM組給予高脂飲食6周+STZ誘導(dǎo)構(gòu)建T2DM模型。WT+DM組、Mstn（+/-）+DM組、Mstn（-/-）+DM組給予高脂飲食喂養(yǎng)6周后，在不禁食狀態(tài)下以50 mg/kg腹腔注射2% STZ（檸檬酸鈉緩沖液配制），72 h后禁食6 h，取尾靜脈血，血糖儀檢測(cè)空腹血糖≥16.7 mmol/L，并出現(xiàn)多飲、多食、多尿、消瘦癥狀，即可認(rèn)為T2DM模型構(gòu)建成功。WT組、Mstn（+/-）組、Mstn（-/-）組小鼠腹腔注射等劑量檸檬酸緩沖液。普通飲食：總熱量為13.5 kJ/g，糖類、脂肪、蛋白質(zhì)分別占66%、10%、24%；高脂飲食：總熱量為18.7 kJ/g，糖類、脂肪、蛋白質(zhì)分別占28%、56%、16%。

1.4 體質(zhì)量、體長(zhǎng)測(cè)定 建模前及建模成功后，用電子秤測(cè)定各組小鼠體質(zhì)量，卷尺測(cè)定小鼠體長(zhǎng)（鼻尖至肛門的距離），計(jì)算Lee's指數(shù)=體質(zhì)量（g）1/3×1 000/體長(zhǎng)（cm）。

1.5 血清三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、FFA水平檢測(cè) 各組小鼠禁食6 h后取尾靜脈血0.2 ml，以 3 000 r/min離心5 min，離心半徑12 cm，留取上清液，應(yīng)用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清TG、TC、LDL-C、HDL-C水平；采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)血清FFA水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.6 白色及棕色脂肪質(zhì)量測(cè)定 以上實(shí)驗(yàn)完成后將小鼠斷椎處死，迅速解剖取出小鼠白色脂肪組織（腹股溝、附睪、腸系膜）、棕色脂肪組織（肩胛），吸取表面血液及體液，用電子秤稱濕重。計(jì)算白棕比=白色脂肪質(zhì)量（g）/棕色脂肪質(zhì)量（g），脂肪指數(shù)=（白色脂肪質(zhì)量+棕色脂肪質(zhì)量）（g）/體質(zhì)量（g）。將腹股溝白色脂肪組織及肩胛棕色脂肪組織一半保存于液氮中，一半保存于體積分?jǐn)?shù)4%的中性甲醛溶液中，石蠟包埋固定。

1.7 白色及棕色脂肪組織形態(tài)分析 采用蘇木精-伊紅（HE）染色法觀察脂肪組織形態(tài)。包埋好的白色及棕色脂肪組織標(biāo)本切成4 μm厚薄片，二甲苯及酒精脫蠟，水洗；蘇木精染液染色5 min，鹽酸水溶液分化，氨水水溶液返藍(lán)，水洗；伊紅染液染色3 min，經(jīng)梯度酒精及二甲苯脫水透明，中性樹膠封固。脂肪組織切片均于光學(xué)顯微鏡下采集圖像，采用Image J軟件分析脂肪組織形態(tài)。

1.8 白色及棕色脂肪PPAR-γ、PGC-1α、UCP1、CD137蛋白相對(duì)表達(dá)量檢測(cè) 采用Western-blotting法檢測(cè)蛋白表達(dá)水平。取脂肪組織50 mg置于勻漿器，加入蛋白裂解液、蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑，反復(fù)多次勻漿及冰浴以確保完全裂解。將勻漿液轉(zhuǎn)移至離心管中，以 12 000 r/min 離心 10 min（離心半徑 12 cm）后留取上清液。BCA法配制標(biāo)準(zhǔn)蛋白和待測(cè)蛋白，37 ℃孵育30 min，用酶標(biāo)儀測(cè)蛋白濃度，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。裝好潔凈干燥的玻璃板，根據(jù)蛋白大小配制分離膠和濃縮膠，分離膠灌至2/3處，40 min后灌入濃縮膠至頂，然后將梳子插入濃縮膠中，盡量避免氣泡產(chǎn)生。靜置10 min后加入電泳液，將樣品緩慢加入電泳孔中，電壓60 V，電泳至溴酚藍(lán)到達(dá)底部時(shí)停止電泳。加入含有甲醇的轉(zhuǎn)移緩沖液，電壓60 V轉(zhuǎn)膜2 h，將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜。TBST緩沖液洗膜3次，10 min/次。質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1 h。加入TBST緩沖液稀釋一抗，4 ℃孵育過夜，TBST緩沖液洗膜3次，10 min/次。加入TBST緩沖液稀釋二抗，室溫下孵育1 h，TBST緩沖液洗膜3次，10 min/次。等體積ECLA液、ECLB液混勻，加至PVDF膜，1 min后除凈殘液并放入暗匣中曝光，然后依次放入顯影液及定影液中至膠片透明，晾干，掃描膠片。以β-actin為內(nèi)參蛋白，采用Image J軟件分析目標(biāo)條帶的光密度值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 六組小鼠體質(zhì)量、體長(zhǎng)、Lee's指數(shù)、白棕比、脂肪指數(shù)比較 本研究18只T2DM小鼠模型均構(gòu)建成功。六組小鼠體質(zhì)量、體長(zhǎng)、Lee's指數(shù)、白棕比、脂肪指數(shù)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。其中Mstn（+/-）組白棕比低于WT組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；Mstn（-/-）組體質(zhì)量高于WT組，體長(zhǎng)低于WT組、Mstn（+/-）組，Lee's指數(shù)、白棕比均低于WT組、Mstn（+/-）組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；WT+DM組Lee's指數(shù)低于WT組，白棕比及脂肪指數(shù)高于WT組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；Mstn（+/-）+DM組白棕比及脂肪指數(shù)低于WT+DM組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；Mstn（-/-）+DM組體質(zhì)量高于WT+DM組，體長(zhǎng)長(zhǎng)于WT+DM組，Lee's指數(shù)及白棕比均低于WT+DM組、Mstn（+/-）+DM組，脂肪指數(shù)低于WT+DM組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 六組小鼠體質(zhì)量、體長(zhǎng)、Lee's指數(shù)、白棕比、脂肪指數(shù)比較（±s）Table 1 Comparison of weight，body length，Lee index，white-brown fat ratio and fat mass index in six groups of mice

表1 六組小鼠體質(zhì)量、體長(zhǎng)、Lee's指數(shù)、白棕比、脂肪指數(shù)比較（±s）Table 1 Comparison of weight，body length，Lee index，white-brown fat ratio and fat mass index in six groups of mice

注：WT=野生型，Mstn=肌肉生長(zhǎng)抑制素，Mstn（+/-）=雜合型Mstn基因敲除，Mstn（-/-）=純合型Mstn基因敲除，DM=糖尿病；a表示與WT組相比P＜0.05，b表示與Mstn（+/-）組相比P＜0.05，c表示與Mstn（-/-）組相比P＜0.05，d表示與WT+DM組相比P＜0.05，e表示與Mstn（+/-）+DM組相比P＜0.05

組別 只數(shù) 體質(zhì)量（g） 體長(zhǎng)（cm） Lee's指數(shù) 白棕比 脂肪指數(shù)WT 組 6 27.48±1.16 8.30±0.32 363.84±11.01 3.05±0.09 0.020 7±0.003 8 Mstn（+/-）組 6 29.26±1.55 8.58±0.15 359.19±10.80 2.24±0.12a0.017 7±0.004 1 Mstn（-/-）組 6 31.14±1.71a9.12±0.18ab345.07±12.80ab1.75±0.14ab0.014 9±0.001 5 WT+DM 組 6 22.22±2.29a8.36±0.19 335.95±7.70a 4.33±0.19a0.041 2±0.006 5a Mstn（+/-）+DM 組 6 23.88±1.94 8.76±0.28 334.39±5.31 3.28±0.06d0.025 1±0.004 0d Mstn（-/-）+DM 組 6 24.22±1.70d9.28±0.13d 311.62±4.44de2.13±0.15de0.016 9±0.005 0d F值 19.510 16.621 21.199 259.435 24.230 P 值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.2 六組小鼠血清TG、TC、LDL-C、HDL-C、FFA水平比較 六組小鼠血清TG、TC、LDL-C、HDL-C、FFA水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。其中Mstn（+/-）組血清TC水平低于WT組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；Mstn（-/-）組血清TG水平低于WT組、Mstn（+/-）組，TC水平低于WT組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；WT+DM組血清TG、TC、LDL-C、FFA水平高于WT組，HDL-C水平低于WT組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；Mstn（+/-）+DM組血清TG、TC、FFA水平低于WT+DM組，HDL-C水平高于WT+DM組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；Mstn（-/-）+DM組血清TG、LDL-C、FFA水平低于WT+DM組，TC水平低于WT+DM組、Mstn（+/-）+DM組，HDL-C水平高于WT+DM組、Mstn（+/-）+DM組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 六組小鼠血清TG、TC、LDL-C、HDL-C、FFA水平比較（±s，mmol/L）Table 2 Comparison of levels of serum TG，TC，LDL-C，HDL-C and FFA of in six groups of mice

表2 六組小鼠血清TG、TC、LDL-C、HDL-C、FFA水平比較（±s，mmol/L）Table 2 Comparison of levels of serum TG，TC，LDL-C，HDL-C and FFA of in six groups of mice

注：TG=三酰甘油，TC=總膽固醇，LDL-C=低密度脂蛋白膽固醇，HDL-C=高密度脂蛋白膽固醇，F(xiàn)FA=游離脂肪酸；a表示與WT組相比P＜0.05，b表示與Mstn（+/-）組相比P＜0.05，c表示與Mstn（-/-）組相比P＜0.05，d表示與WT+DM組相比P＜0.05，e表示與Mstn（+/-）+DM組相比P＜0.05

組別 只數(shù) TG TC LDL-C HDL-C FFA WT組 6 1.17±0.06 2.84±0.23 0.36±0.02 0.66±0.04 0.62±0.01 Mstn（+/-）組 6 1.11±0.03 2.45±0.21a 0.37±0.02 0.67±0.03 0.62±0.01 Mstn（-/-）組 6 1.02±0.06ab 2.51±0.05a 0.43±0.13 0.67±0.01 0.61±0.01 WT+DM 組 6 1.62±0.06a 5.13±0.20a 0.50±0.03a 0.38±0.01a 0.78±0.02a Mstn（+/-）+DM 組 6 1.44±0.04d 4.27±0.18d 0.49±0.02 0.44±0.02d 0.72±0.01d Mstn（-/-）+DM 組 6 1.38±0.02d 3.81±0.18de 0.43±0.02d 0.50±0.01de 0.70±0.01d F值 112.663 174.600 31.258 458.253 110.621 P 值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.3 六組小鼠白色及棕色脂肪細(xì)胞形態(tài)比較

2.3.1 六組小鼠白色脂肪細(xì)胞形態(tài)比較 WT組白色脂肪細(xì)胞形態(tài)飽滿、大小均勻；與WT組相比，Mstn（-/-）組白色脂肪細(xì)胞數(shù)量明顯增多，體積明顯縮小，形態(tài)不規(guī)則；Mstn（+/-）組表現(xiàn)介于WT組與Mstn（-/-）組之間。WT+DM組白色脂肪細(xì)胞體積較WT組明顯增大，大小不均勻、細(xì)胞間有融合；與WT+DM組相比，Mstn（-/-）+DM組白色脂肪細(xì)胞數(shù)量明顯增多，體積明顯縮??；Mstn（+/-）+DM組表現(xiàn)介于WT+DM組與Mstn（-/-）+DM組之間，見圖1。

圖1 六組小鼠白色脂肪細(xì)胞形態(tài)比較（HE染色，×400）Figure 1 Comparison of the morphology of white adipocytes in six groups of mice

2.3.2 六組小鼠棕色脂肪細(xì)胞形態(tài)比較 WT組、Mstn（+/-）組、Mstn（-/-）組棕色脂肪細(xì)胞形態(tài)均呈多房樣，未見單泡脂肪細(xì)胞；Mstn（-/-）組較WT組、Mstn（+/-）組棕色脂肪細(xì)胞分布更密集。WT+DM組可見多房樣棕色脂肪細(xì)胞中有大量單泡脂肪細(xì)胞分布，細(xì)胞中央有一圓形脂滴；Mstn（-/-）+DM組可見多房樣棕色脂肪細(xì)胞中散在分布單泡脂肪細(xì)胞，與WT+DM組相比數(shù)量明顯減少，脂滴體積明顯減??；Mstn（+/-）+DM組表現(xiàn)介于WT+DM組與Mstn（-/-）+DM組之間，見圖2。

圖2 六組小鼠棕色脂肪細(xì)胞形態(tài)比較（HE染色，×400）Figure 2 Comparison of the morphology of brown adipocytes in six groups of mice

2.4 六組小鼠白色脂肪PPAR-γ、PGC-1α、UCP1、CD137蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 六組小鼠白色脂肪PPAR-γ、PGC-1α、UCP1、CD137蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。其中Mstn（+/-）組UCP1、CD137蛋白相對(duì)表達(dá)量高于WT組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；Mstn（-/-）組PPAR-γ、PGC-1α、CD137蛋白相對(duì)表達(dá)量均高于WT組、Mstn（+/-）組，UCP1高于WT組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；WT+DM 組 PPAR-γ、PGC-1α、UCP1、CD137蛋白相對(duì)表達(dá)量均低于WT組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；Mstn（+/-）+DM組CD137蛋白相對(duì)表達(dá)量高于WT+DM組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；Mstn（-/-）組 PPAR-γ、PGC-1α、UCP1、CD137蛋白相對(duì)表達(dá)量均高于WT+DM組、Mstn（+/-）+DM組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表3、圖3。

圖3 六組小鼠白色脂肪PPAR-γ、PGC-1α、UCP1、CD137蛋白表達(dá)情況Figure 3 Expression levels of PPARγ，PGC-1α，UCP1 and CD137 proteins in white fat of six groups of mice

表3 六組小鼠白色脂肪PPARγ、PGC-1α、UCP1、CD137蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（±s）Table 3 Comparison of relative expression levels of PPARγ，PGC-1α，UCP1 and CD137 protein in white fat of six groups of mice

表3 六組小鼠白色脂肪PPARγ、PGC-1α、UCP1、CD137蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（±s）Table 3 Comparison of relative expression levels of PPARγ，PGC-1α，UCP1 and CD137 protein in white fat of six groups of mice

注：PPAR-γ=過氧化物酶體增殖物激活受體γ，PGC-1α=過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α，UCP1=解偶聯(lián)蛋白1，CD137=分化簇 137；a表示與 WT組相比 P＜0.05，b表示與 Mstn（+/-）組相比 P＜0.05，c表示與 Mstn（-/-）組相比 P＜0.05，d表示與WT+DM組相比P＜0.05，e表示與Mstn（+/-）+DM組相比P＜0.05

組別 只數(shù) PPAR-γ PGC-1α UCP1 CD137 WT 組 6 0.879±0.016 0.705±0.012 0.236±0.020 0.081±0.002 Mstn（+/-）組 6 0.908±0.112 0.711±0.023 0.767±0.069a 0.111±0.004a Mstn（-/-）組 6 1.108±0.026ab 0.926±0.076ab 0.800±0.049a 0.129±0.003ab WT+DM 組 6 0.170±0.005a 0.189±0.012a 0.073±0.001a 0.025±0.002a Mstn（+/-）+DM 組 6 0.190±0.010 0.173±0.010 0.095±0.010 0.060±0.002d Mstn（-/-）+DM 組 6 0.348±0.009de0.311±0.008de0.165±0.008de0.104±0.008de F值 446.360 539.281 528.637 538.335 P 值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.5 六組小鼠棕色脂肪PPAR-γ、PGC-1α、UCP1、CD137蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 六組小鼠棕色脂肪PPAR-γ、PGC-1α、UCP1、CD137蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。其中Mstn（+/-）組PPAR-γ、PGC-1α、UCP1、CD137蛋白相對(duì)表達(dá)量均高于WT組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；Mstn（-/-）組PPAR-γ、PGC-1α、CD137蛋白相對(duì)表達(dá)量均高于WT組、Mstn（+/-）組，UCP1高于WT組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；WT+DM組PPAR-γ、PGC-1α、UCP1、CD137蛋白相對(duì)表達(dá)量均低于WT組（P＜0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；Mstn（+/-）+DM組PPAR-γ、PGC-1α、UCP1、CD137蛋白相對(duì)表達(dá)量均高于WT+DM組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；Mstn（-/-）+DM組PPAR-γ、PGC-1α、UCP1、CD137蛋白相對(duì)表達(dá)量均高于WT+DM組、Mstn（+/-）+DM組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表4、圖4。

圖4 六組小鼠棕色脂肪PPAR-γ、PGC-1α、UCP1、CD137蛋白表達(dá)情況Figure 4 Expression levels of PPAR-γ，PGC-1α，UCP1 and CD137 proteins in brown fat of six groups of mice

表4 六組小鼠棕色脂肪PPAR-γ、PGC-1α、UCP1、CD137蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（±s）Table 4 Comparison of relative expression levels of PPAR-γ，PGC-1α，UCP1 and CD137 protein in brown fat of six groups of mice

表4 六組小鼠棕色脂肪PPAR-γ、PGC-1α、UCP1、CD137蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（±s）Table 4 Comparison of relative expression levels of PPAR-γ，PGC-1α，UCP1 and CD137 protein in brown fat of six groups of mice

注：a表示與WT組相比 P＜0.05，b表示與 Mstn（+/-）組相比P＜0.05，c表示與 Mstn（-/-）組相比 P＜0.05，d表示與 WT+DM 組相比P＜0.05，e表示與Mstn（+/-）+DM組相比P＜0.05

組別 只數(shù) PPAR-γ PGC-1α UCP1 CD137 WT 組 6 1.359±0.060 0.929±0.008 0.658±0.038 0.079±0.002 Mstn（+/-）組 6 1.920±0.050a 1.111±0.050a 0.809±0.017a 0.152±0.009a Mstn（-/-）組 6 2.052±0.040ab1.556±0.059ab 0.830±0.030a 0.273±0.016ab WT+DM 組 6 0.301±0.014a 0.187±0.011a 0.092±0.007a 0.062±0.003a Mstn（+/-）+DM 組 6 0.455±0.027d 0.251±0.020d 0.129±0.006d 0.130±0.006d Mstn（-/-）+DM 組 6 1.218±0.085de0.645±0.014de0.288±0.010de0.168±0.004de F 值 1 196.913 1 463.654 1 493.055 490.418 P 值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

3 討論

越來越多的研究發(fā)現(xiàn)Mstn在脂肪生長(zhǎng)、分化、代謝中發(fā)揮重要作用，參與肥胖的發(fā)生。有研究結(jié)果顯示，Mstn（-/-）小鼠與WT小鼠相比脂肪含量明顯減少，血清TG、FFA水平明顯降低［4-5］。Mstn（-/-）梅山豬皮下脂肪含量與體質(zhì)量的比例、血清TG水平明顯低于WT［6］。本研究結(jié)果顯示，Mstn（-/-）組Lee's指數(shù)、血清TG、TC水平低于WT組；WT+DM組Lee's指數(shù)、HDL-C水平低于WT組，脂肪指數(shù)和血清TG、TC、LDL-C、FFA水平高于WT組；Mstn（-/-）+DM組Lee's指數(shù)、脂肪指數(shù)和血清TG、TC、LDL-C、FFA水平低于WT+DM組，HDL-C水平高于WT+DM組。Lee's指數(shù)反映小鼠肥胖程度，脂肪指數(shù)反映小鼠體內(nèi)脂肪量，而血清TG、TC、LDL-C、FFA水平升高，HDL-C水平降低是機(jī)體脂代謝紊亂的特征性生化改變，上述結(jié)果提示敲除Mstn基因后可明顯拮抗T2DM引起的脂肪堆積、脂代謝紊亂等肥胖表征。Mstn（-/-）小鼠脂肪量減少可能與Mstn抑制前體脂肪細(xì)胞向成熟脂肪細(xì)胞分化有關(guān)。在脂肪組織形成初期，前體脂肪細(xì)胞由于解除了Mstn的抑制，分化能力增強(qiáng)，提前發(fā)育成熟，從而無法繼續(xù)分裂增殖，成熟脂肪細(xì)胞數(shù)量減少，導(dǎo)致脂肪總量減少［3］。

脂肪主要分為白色脂肪、棕色脂肪和米色脂肪。白色脂肪組織主要分布于皮下和腸系膜、生殖腺等內(nèi)臟周圍，白色脂肪細(xì)胞包含單個(gè)較大脂滴，含有大量TG，主要作用為儲(chǔ)存機(jī)體多余的能量，是導(dǎo)致肥胖的主要因素；棕色脂肪組織主要分布在肩胛，棕色脂肪細(xì)胞包含多房小脂滴，胞內(nèi)含有大量線粒體，以非偶聯(lián)氧化磷酸化的方式消耗白色脂肪儲(chǔ)存的TG，產(chǎn)生熱量，調(diào)節(jié)體溫平衡；米色脂肪主要分布在白色脂肪組織間，屬于白色脂肪向棕色脂肪轉(zhuǎn)化的中間形態(tài)，可于寒冷等外界刺激后被激活，發(fā)揮類似棕色脂肪的產(chǎn)熱功能，即發(fā)生了白色脂肪棕色化［7］。棕色和米色脂肪均可改善機(jī)體脂肪代謝、減輕肥胖，其細(xì)胞內(nèi)均存在高表達(dá)的標(biāo)志性基因。研究證實(shí)，PPAR-γ、PGC-1α、UCP1、PR結(jié)構(gòu)域蛋白16（PRDM16）、誘導(dǎo)細(xì)胞死亡DNA片段化因子α樣效應(yīng)因子A（Cidea）在棕色脂肪細(xì)胞中高表達(dá)，CD137、跨膜蛋白26（Tmem26）在米色脂肪細(xì)胞中高表達(dá)，以上基因均是白色脂肪棕色化的標(biāo)志物［8-10］。PPAR-γ是一種核激素受體，是體內(nèi)脂肪形成必需的轉(zhuǎn)錄因子，在調(diào)控脂肪細(xì)胞分化中發(fā)揮重要作用［11］。PGC-1α受上游信號(hào)分子PPAR-γ調(diào)控，調(diào)節(jié)線粒體電子傳遞鏈以及氧化呼吸功能，進(jìn)一步調(diào)節(jié)棕色脂肪組織的產(chǎn)熱作用［12］。UCP1是一種線粒體內(nèi)膜蛋白，可以消除線粒體內(nèi)膜兩側(cè)由質(zhì)子濃度差形成的電勢(shì)差，阻礙線粒體呼吸鏈的傳遞，抑制三磷酸腺苷的產(chǎn)生，將儲(chǔ)存的能量轉(zhuǎn)化為熱量，維持體溫平衡［13］。CD137是腫瘤壞死因子受體家族成員之一，是米色脂肪區(qū)別于其他脂肪細(xì)胞的特異性標(biāo)志物［14］。通過檢測(cè)上述基因表達(dá)，可反映白色脂肪棕色化的程度。

Mstn可調(diào)控白色脂肪棕色化。研究發(fā)現(xiàn)，Mstn（-/-）小鼠白色脂肪出現(xiàn)棕色脂肪的表型，能量利用增加，可抵抗遺傳性或飲食誘導(dǎo)的肥胖，且皮下白色脂肪組織PGC-1α、UCP1、CD137及Tmem26基因表達(dá)均升高［4］。Mstn（-/-）梅山豬背部皮下白色脂肪組織中單室大脂滴細(xì)胞數(shù)量減少，多房小脂滴細(xì)胞數(shù)量增加，脂肪 組 織 PGC-1α、PRDM16、Cidea、CD137、Tmem26基因表達(dá)均上調(diào)，提示白色脂肪棕色化趨勢(shì)明顯增強(qiáng)［6］。本研究結(jié)果顯示，Mstn（-/-）組白棕比低于WT組，WT+DM組白棕比高于WT組，Mstn（-/-）+DM組白棕比低于WT+DM組；HE染色觀察到Mstn（-/-）組較WT組白色脂肪細(xì)胞體積明顯縮小，數(shù)量明顯增多，從形態(tài)上有向棕色脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)化的趨勢(shì)，WT+DM組白色脂肪細(xì)胞體積較WT組明顯增大，棕色脂肪細(xì)胞間分布大量圓形單房脂滴，而Mstn（-/-）+DM組上述病理改變較輕，表明抑制Mstn表達(dá)可抑制T2DM引起的脂肪細(xì)胞體積增大，誘導(dǎo)白色脂肪出現(xiàn)棕色脂肪細(xì)胞表征。本研究進(jìn)一步檢測(cè)了棕色脂肪標(biāo)記基因PPAR-γ、PGC-1α、UCP1，米色脂肪標(biāo)記基因CD137在脂肪組織中的表達(dá)，結(jié)果顯示，Mstn（-/-）組白色脂肪及棕色脂肪PPAR-γ、PGC-1α、UCP1、CD137蛋白相對(duì)表達(dá)量均高于WT組，WT+DM組均低于WT組，Mstn（-/-）+DM組高于WT+DM組，結(jié)合白色及棕色脂肪組織HE染色，提示T2DM可誘導(dǎo)棕色脂肪及米色脂肪標(biāo)志性基因表達(dá)減少，白色脂肪表型增加，能量?jī)?chǔ)存過剩，而敲除Mstn基因后可明顯拮抗此現(xiàn)象，上調(diào)棕色脂肪及米色脂肪標(biāo)志性基因表達(dá)，促進(jìn)白色脂肪棕色化，增加機(jī)體產(chǎn)熱，促進(jìn)白色脂肪消耗，減輕肥胖。分析其具體機(jī)制，可能與Mstn缺失通過下調(diào)miR-34a促進(jìn)Ⅲ型纖連蛋白結(jié)構(gòu)域包含蛋白5（FNDC5）/鳶尾素（irisin）表達(dá)有關(guān)［15］。FNDC5是irisin的前體蛋白，主要由骨骼肌分泌，可通過血液循環(huán)進(jìn)入脂肪組織中，促進(jìn)白色脂肪棕色化，消耗白色脂肪，減少脂肪沉積［6］。也有研究發(fā)現(xiàn)，Mstn可調(diào)控Smad3介導(dǎo)的β-連環(huán)蛋白表達(dá)抑制棕色脂肪細(xì)胞分化［16］。

本研究結(jié)果顯示，Mstn（+/-）+DM組白棕比、脂肪指數(shù)、血清TG、TC及FFA水平低于WT+DM組，白色脂肪CD137及棕色脂肪PPAR-γ、PGC-1α、UCP1、CD137蛋白相對(duì)表達(dá)量高于WT+DM組，HE染色顯示Mstn（+/-）+DM組白色及棕色脂肪細(xì)胞形態(tài)介于WT+DM組與Mstn（-/-）+DM組之間，表明部分抑制Mstn表達(dá)可在一定程度上拮抗T2DM引起的白色脂肪增多、米色/棕色脂肪減少及脂代謝紊亂的表現(xiàn)。

本研究結(jié)果提示，抑制Mstn基因表達(dá)可拮抗T2DM引起的白色脂肪堆積、脂代謝紊亂等肥胖表型，上調(diào)PPAR-γ、PGC-1α、UCP1、CD137基因表達(dá)，促進(jìn)白色脂肪棕色化，為T2DM、肥胖、肌少癥等代謝性疾病的防治提供理論依據(jù)。本研究不足之處在于樣本量較小，也未進(jìn)行下游分子機(jī)制研究，因此結(jié)論有一定局限性，Mstn參與白色脂肪棕色化的具體機(jī)制需進(jìn)一步研究證實(shí)。

作者貢獻(xiàn)：程經(jīng)緯負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與實(shí)施，數(shù)據(jù)收集與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，論文的構(gòu)思、設(shè)計(jì)、撰寫；柳楊青負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與實(shí)施，論文修訂；汪艷芳負(fù)責(zé)研究選題，實(shí)驗(yàn)的監(jiān)督管理，論文的質(zhì)量控制及審校，對(duì)論文整體負(fù)責(zé)。

本文無利益沖突。