李曉麗,王洪江,池洪杰

心肌梗死是由于冠狀動(dòng)脈供血不足，引起心肌細(xì)胞不可逆死亡，導(dǎo)致的心功能障礙和衰退[1-2]。近年來文獻(xiàn)證實(shí)，自噬參與了心肌梗死的發(fā)生發(fā)展[3]。曲美他嗪(TMZ)是細(xì)胞保護(hù)類藥物，可改善心肌的能量代謝，增強(qiáng)其缺血耐受性，是臨床廣泛用于緩解心絞痛的經(jīng)典藥物[4]。ZHANG等[5]發(fā)現(xiàn)，TMZ可以保護(hù)心肌細(xì)胞，減少細(xì)胞凋亡和自噬，降低心肌纖維化，改善心功能。馬曉瑋等[6]發(fā)現(xiàn),TMZ可通過轉(zhuǎn)化脂肪與糖代謝，增強(qiáng)原代心肌細(xì)胞存活能力。此外，TMZ還被發(fā)現(xiàn)可通過提高超氧化物歧化酶(SOD)活性，減輕細(xì)胞凋亡[7]。但是關(guān)于TMZ保護(hù)心肌細(xì)胞、減輕心肌損傷的作用，是否與mTOR信號(hào)通路調(diào)控自噬水平有關(guān)，目前尚不明確。本研究采用TMZ處理原代乳鼠心肌細(xì)胞損傷模型，觀察TMZ對(duì)缺血損傷心肌細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞分組及處理 采用胰酶膠原酶消化法和差速培養(yǎng)法分離培養(yǎng)SD大鼠乳鼠原代心肌細(xì)胞，在10%胎牛血清(FBS，GIBCO)的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，應(yīng)用1 μmol/L血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)處理，建立心肌細(xì)胞損傷模型。分別采用10、50和100 μmol/L的TMZ預(yù)處理?yè)p傷心肌細(xì)胞，以探索最佳TMZ處理濃度。本研究TMZ最佳處理濃度為50 μmol/L。對(duì)照組(Control組)：在DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h，饑餓12 h，繼續(xù)用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h；模型組(Model組)：DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h，饑餓12 h后，在DMEM培養(yǎng)基中加入1 μmol/L AngⅡ繼續(xù)培養(yǎng)12 h；Model+TMZ組：在Model組基礎(chǔ)上加入50 μmol/L的TMZ共同培養(yǎng)12 h；Model+1 mmol/L的mTOR阻滯劑西羅莫司(RAPA)組：在Model組處理基礎(chǔ)上加入1 mmol/L的RAPA共同培養(yǎng)12 h；Model+TMZ+RAPA組：在Model+TMZ組處理基礎(chǔ)上加入1 mmol/L的RAPA共同培養(yǎng)12 h。所用試劑均來源于Sigma Aldrich。

1.2流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 Annexin V-FITC/碘化丙啶(PI)染色法用于檢測(cè)處理后的心肌細(xì)胞凋亡率。將不同分組處理的乳鼠原代心肌細(xì)胞消化收集于離心管中，以1000 r/min離心5 min，PBS洗滌2次后，以膜聯(lián)蛋白V-FITC結(jié)合緩沖液重懸，分裝至1.5 ml EP管中，每管500 μl。膜聯(lián)蛋白V-FITC/PI(BD Pharmingen，USA)用于在黑暗中染色細(xì)胞。最后，通過在熒光激活細(xì)胞分選流式細(xì)胞儀(BD Pharmingen， USA)上PI和膜聯(lián)蛋白V陽(yáng)性細(xì)胞來評(píng)估凋亡細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3微板法檢測(cè)乳酸脫氫酶(LDH)和SOD水平 LDH檢測(cè)：按照10×104個(gè)/孔細(xì)胞數(shù)將乳鼠原代心肌細(xì)胞懸浮液接種于6孔板，正常培養(yǎng)24 h。按照分組給予不同處理后轉(zhuǎn)移至2 ml EP管中，離心取上清。按照LDH測(cè)試盒(南京建成生物)說明書依次加入試劑和樣本。SOD檢測(cè)：將不同分組處理的細(xì)胞洗滌后轉(zhuǎn)移至1.5 ml EP管中，使用超聲破碎機(jī)碎裂細(xì)胞，離心取上清，按照SOD測(cè)試盒(南京建成生物)說明書嚴(yán)格操作。分別室溫靜置5 min，15 min后采用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司)檢測(cè)細(xì)胞上清液LDH和SOD水平，于450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定光密度值，并計(jì)算濃度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4蛋白質(zhì)免疫印跡試驗(yàn)檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá) 將不同處理的心肌細(xì)胞離心后棄上清，預(yù)冷PBS洗滌2次，吸去瓶?jī)?nèi)剩余液體，加入細(xì)胞裂解液(上海碧云天)，2～3 min后刮出細(xì)胞，于1.5 ml EP管中，冰上孵育25 min。低溫高速離心15 min后吸取細(xì)胞總蛋白。BCA法測(cè)定蛋白濃度。根據(jù)文獻(xiàn)[8]中方法檢測(cè)目標(biāo)靶蛋白表達(dá)。一抗采用抗LC3-Ⅰ/Ⅱ、P62、Bax、Bcl-2、Caspase-3及mTOR，根據(jù)抗體稀釋比例預(yù)先配置，以上抗體均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。與HRP偶聯(lián)的山羊抗兔(鼠)二抗，在37 ℃溫育2 h。目標(biāo)蛋白采用ECL蛋白免疫印跡試驗(yàn)檢測(cè)試劑盒(FulenGen，廣州，中國(guó))進(jìn)行可視化。

1.5熒光共聚焦檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)自噬小體及自噬流 按8×103個(gè)/孔稀釋細(xì)胞懸液，接種至Φ15 mm共聚焦培養(yǎng)皿內(nèi)，正常培養(yǎng)24 h。依據(jù)CYTO-ID?Autophagy Detection Kit 2.0(美國(guó) Enzo Life Sciences公司)說明書配置試劑，避光操作。將不同處理的細(xì)胞棄培養(yǎng)基，用含5% FBS 1x Assay Buffer洗滌2次，加入配置好的檢測(cè)試劑150 μl，正常培養(yǎng)30 min。棄檢測(cè)試劑，用含5% FBS 1x Assay Buffer洗滌3次。加入4%多聚甲醛2 ml，室溫放置15 min。吸去多聚甲醛，用1x Assay Buffer洗滌3次。后加入200 μl 1x Assay Buffer，4 ℃避光保存。采用激光共聚焦掃描顯微鏡(日本尼康)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)自噬小體及自噬流，激發(fā)光波長(zhǎng)488 nm，觀察并拍照，綠色熒光代表自噬泡，藍(lán)色表示細(xì)胞核。

2 結(jié)果

2.1TMZ對(duì)損傷心肌細(xì)胞凋亡的影響 Control組、Model組、Model+TMZ組、Model+RAPA組、Model+TMZ+RAPA組心肌細(xì)胞凋亡率分別為(4.83±1.25)%、(19.24±1.59)%、(7.95±0.71)%、(18.49±1.58)%、(15.54±1.16)%。Model組細(xì)胞凋亡率高于Control組，Model+TMZ組低于Model組，Model+RAPA組和Model+TMZ+RAPA組高于Model+TMZ組(P<0.05)。見圖1。

圖1 TMZ對(duì)心肌細(xì)胞損傷大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響 TMZ為曲美他嗪，RAPA為西羅莫司

2.2心肌細(xì)胞損傷標(biāo)志物檢測(cè) Model組LDH水平高于Control組，TMZ處理后顯著下降，Model+RAPA組和Model+TMZ+RAPA組均高于Model+TMZ組(P<0.05)；Model組SOD水平低于Control組，TMZ處理后明顯上升，Model+RAPA組和Model+TMZ+RAPA組均低于Model+TMZ組(P<0.05)。見表1。

2.3心肌細(xì)胞自噬流檢測(cè) Model組心肌細(xì)胞自噬熒光積累，自噬小體形成，自噬流增加；Model+TMZ組自噬熒光少于Model組；Model+RAPA組和Model+TMZ+RAPA組自噬熒光較Model+TMZ組增加。見圖2。

表1 5組大鼠心肌細(xì)胞損傷標(biāo)志物水平比較

圖2 5組大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)自噬小體及自噬流熒光共聚焦檢測(cè)結(jié)果 TMZ為曲美他嗪，RAPA為西羅莫司

2.4TMZ對(duì)心肌細(xì)胞自噬及凋亡相關(guān)蛋白、通路蛋白的影響 Model組LC3-Ⅰ/Ⅱ、Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)水平高于Control組，TMZ處理后表達(dá)水平下降，Model+RAPA組和Model+TMZ+RAPA組高于Model+TMZ組(P<0.05)。Model組P62、Bcl-2、mTOR水平低于Control組，TMZ處理后表達(dá)水平上升，Model+RAPA組和Model+TMZ+RAPA組低于Model+TMZ組(P<0.05)。見圖3。

3 討論

流式細(xì)胞術(shù)和微板法是檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡的經(jīng)典方法。本研究結(jié)果顯示，與Model組比較，給予TMZ處理可以降低LDH水平，升高SOD水平和心肌細(xì)胞存活率。表明TMZ保護(hù)心肌細(xì)胞免受AngⅡ誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞Ⅰ型程序性死亡，在心力衰竭發(fā)展過程中不可缺少[9]。本研究結(jié)果顯示，TMZ處理可明顯降低心肌細(xì)胞凋亡率，但是該作用可被RAPA抑制。表明mTOR通路在TMZ減輕心肌細(xì)胞損傷中發(fā)揮重要作用。因此，RAPA可作為mTOR通路抑制劑而用于進(jìn)一步探討TMZ抑制自噬的機(jī)制。

圖3 5組大鼠心肌細(xì)胞自噬及凋亡相關(guān)蛋白、通路蛋白的表達(dá)情況

mTOR已被證明對(duì)自噬具有調(diào)控作用[10]。研究證實(shí)mTOR激活在心臟保護(hù)中起著至關(guān)重要的作用[11]。激活mTOR能夠調(diào)節(jié)抗凋亡蛋白Bcl-2與促凋亡蛋白Bax，抑制Caspase家族的激活和減少死亡基因表達(dá)[12]。本研究結(jié)果顯示，Model組Caspase-3及Bax蛋白表達(dá)高于Control組，Bcl-2蛋白表達(dá)低于Control組，而TMZ預(yù)處理后可降低Caspase-3及Bax蛋白表達(dá)，升高Bcl-2蛋白表達(dá)，這些作用被RAPA部分抵消。本研究結(jié)果還顯示，損傷心肌細(xì)胞中自噬小體的數(shù)量和LC3-Ⅱ的表達(dá)增多，而P62蛋白表達(dá)減少。P62蛋白是自噬底物，TMZ預(yù)處理后發(fā)生明顯逆轉(zhuǎn)，卻被RAPA抑制。進(jìn)一步研究結(jié)果顯示，TMZ預(yù)處理可激活mTOR通路，導(dǎo)致自噬下調(diào)；抑制mTOR通路后，自噬減弱。表明TMZ減輕心肌細(xì)胞損傷及凋亡的潛在機(jī)制可能是通過激活mTOR信號(hào)通路而抑制過度自噬實(shí)現(xiàn)的。FAN等[13]證實(shí)丹參素可激活mTOR通路抑制過度自噬及凋亡而減輕心肌細(xì)胞損傷。HUANG等[14]發(fā)現(xiàn)microRNA-21可激活A(yù)KT/mTOR通路抑制心肌細(xì)胞過度自噬，減輕心肌細(xì)胞損傷。本研究結(jié)果與報(bào)道一致。

本研究在體外模型中證實(shí)TMZ可通過激活mTOR來抑制過度自噬，減輕心肌細(xì)胞損傷。TMZ與自噬間的相互作用可為預(yù)防心肌細(xì)胞損傷和凋亡提供參考。關(guān)于自噬激動(dòng)劑和抑制劑評(píng)估TMZ的心臟保護(hù)作用及其確切的分子機(jī)制，還需要更深入的研究，以期為心肌梗死提供新的治療靶點(diǎn)。