龍亞輝 周輝

[摘要] 目的 探討重組人血管內(nèi)皮抑素聯(lián)合表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（EGFR-TKIs）耐藥細(xì)胞系H1975體外及對(duì)裸鼠移植瘤的抗瘤作用。方法 建立H1975肺癌細(xì)胞系裸鼠移植瘤模型24只，并隨機(jī)分為對(duì)照組、單一用藥組和聯(lián)合用藥組，每組各8只，建立H1975肺癌細(xì)胞系裸鼠移植瘤模型，對(duì)照組小鼠不做任何處理，單一用藥組注射恩度，聯(lián)合用藥組注射厄洛替尼和恩度，2周后處死實(shí)驗(yàn)鼠，并將腫瘤取出進(jìn)行測量，分析不同用藥方法對(duì)裸鼠移植瘤的抗瘤作用。結(jié)果 隨著給藥時(shí)間的延長，對(duì)照組小鼠慢慢精神較差，活動(dòng)量與飲食量減少，卷縮扎堆，毛色灰暗無光澤度。聯(lián)合用藥組小鼠活動(dòng)情況與飲食情況基本正常，單一用藥組小鼠表現(xiàn)介于兩組之間;三組小鼠的腫瘤體積與重量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001），對(duì)照組最大，其次為單一用藥組，最后為聯(lián)合用藥組;小鼠腫瘤組織中MVD計(jì)數(shù)與VEGF表達(dá)比較，三組小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（VEGF）表達(dá)與微血管密度 （MVD）計(jì)數(shù)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001），聯(lián)合用藥組的數(shù)值最小;兩組不同治療方法對(duì)小鼠體內(nèi)H1975細(xì)胞和ECV細(xì)胞的抑制作用比較，聯(lián)合用藥組的抑制率明顯優(yōu)于單一用藥組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。結(jié)論 應(yīng)用恩度與厄洛替尼聯(lián)合作用于肺癌腫瘤，能夠減小腫瘤大小，能夠抵抗腫瘤，可以應(yīng)用在EGFR-TKIs耐藥患者中，值得臨床推廣。

[關(guān)鍵詞] 重組人血管內(nèi)皮抑素;EGFR-TKIs;耐藥;肺癌

[中圖分類號(hào)] R734.2? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-9701（2022）11-0016-04

[Abstract] Objective? To investigate the antitumor effect of the epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor （EGFR-TKIs） in combination with recombinant human vascular endostatin on xenograft tumor in nude mice in vitro using drug-resistant cell line H1975. Methods Twenty four nude mouse xenograft tumor models of the H1975 lung cancer cell line were established and randomly divided into the control group， the monotherapy group and the combination group， with 8 mice in each group. Mice in the control group were given no treatment. The monotherapy group was injected with endostar， and the combination group was injected with erlotinib and endostar. After 2 weeks， the mice were sacrificed， and the tumors were removed for measurement to analyze the anti-tumor effect of different medication methods on transplanted tumors in nude mice. Results? With the prolongation of administration time， the mice in the control group were in poor spirits gradually， with reduced activity and diet， and their hair color was dark without gloss. The activity and diet of mice in the combination group were basically normal， while those in the single group were between the two groups. Statistically significant differences were observed in the tumor volume and weight among the three groups， with the largest in the control group， followed by the monotherapy group， and the smallest in the combination group （P<0.05）. The comparison of MVD count and VEGF expression in tumor tissues of mice showed that the vascular endothelial growth factor （VEGF） expression and microvessel density （MVD） count were statistically significantly different among the three groups. The values were the least in the combination group， with statistically significant differences （P<0.001）. By comparing the inhibitory effects of different treatment methods on H1975 cells and ECV cells in mice， it was found that the inhibitory rate of the combination group was statistically significantly lower than that of the monotherapy group （P<0.001）. Conclusion? The combined action of endostar and erlotinib on lung cancer tumors can reduce the tumor size and resist the tumor， which can be applied in patients with drug resistance to EGFR-TKIs and is worthy of clinical promotion.37F02D83-6E2B-4E2E-8EBA-CB51506ADABE

[Key words] Recombinant human vascular endostatin; EGFR-TKIs; Drug resistance; Lung cancer

據(jù)相關(guān)專家統(tǒng)計(jì)，到2030年我國每年肺癌的發(fā)病人數(shù)會(huì)達(dá)到100萬人，患者5年生存率只有10%左右[1]，其發(fā)病率居全球惡性腫瘤首位，也是我國發(fā)病率和死亡率均居第1位的惡性腫瘤。在當(dāng)前肺癌的治療中，應(yīng)用表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors，EGFR-TKI5）效果確切，且不良反應(yīng)小，成為敏感突變?nèi)巳菏走x用藥。但是隨著藥物使用，EGFR-TKIs會(huì)在6～12個(gè)月后出現(xiàn)耐藥性[2-3]。相關(guān)研究表明[4-6]，重組人血管內(nèi)皮抑素可抑制腫瘤學(xué)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和增殖，從而抑制腫瘤形成新生血管，同時(shí)抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，對(duì)轉(zhuǎn)移性腫瘤和原發(fā)性腫瘤的種植瘤均有顯著的抑制作用且無明顯毒副反應(yīng)。相關(guān)研究表明，聯(lián)合EGFR-TKI5和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體（vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2）抑制劑具有協(xié)同抗腫瘤作用。本文建立H1975肺癌細(xì)胞系裸鼠移植瘤模型24個(gè)，分析重組人血管內(nèi)皮抑素增強(qiáng)EGFR-TKIs對(duì)肺癌的抗瘤作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1材料與方法

1.1材料來源

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物? 選擇無特殊病原體、健康的C57BL/6小鼠，5～7周齡，共24只，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（京）2005-0013，來自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所。應(yīng)用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)環(huán)境系統(tǒng)進(jìn)行養(yǎng)殖。在飼養(yǎng)8 d后體重增至16.6～22.2 g后應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)。

1.1.2免疫組織化學(xué)試劑? 抗鼠CD34單克隆抗體、兔抗鼠VEGF單克隆抗體、小鼠VEGF試劑盒（ELISA）、正常羊血清、防脫片劑多聚賴氨酸、濃縮型DAB試劑盒、二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。RIPA蛋白抽提試劑盒及BCA蛋白定量試劑盒（北京賽馳生物科技公司）。攜帶L858R和T790M的人肺腺癌H1975細(xì)胞株（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心）。

1.1.3主要設(shè)備? 超純水純化系統(tǒng)（臺(tái)灣艾柯公司）;H-7500透射電子顯微鏡（日立）;LEICA ASP300S全自動(dòng)脫水機(jī)[德國徠卡（1eica）公司];形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng)（Motic）;HEPA100型二氧化碳培養(yǎng)箱（美國熱電公司）、臺(tái)式離心機(jī)（Sigma公司）;4°C冰箱（中國海爾）;倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司）;SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物實(shí)驗(yàn)? 將H1975細(xì)胞接種于96孔板中，5000個(gè)/孔，分3個(gè)處理組，每組設(shè)置8個(gè)復(fù)孔;實(shí)驗(yàn)第2天待細(xì)胞貼壁后應(yīng)用藥物進(jìn)行處理，對(duì)照組小鼠應(yīng)用DMSO處理，單一用藥組應(yīng)用恩度[山東先聲麥得津生物制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字S20050088，規(guī)格：15 mg/（3 ml·支）]濃度為10 μg/ml，聯(lián)合用藥組小鼠應(yīng)用10 μg/ml恩度聯(lián)合4 μg/ml厄洛替尼[Roche Pharma（Switzerland）Ltd，國藥準(zhǔn)字H20090599，規(guī)格：100 mg/150 mg]處理。對(duì)所有組別小鼠行腹腔注射，每次0.2 ml，每日一次。兩周實(shí)驗(yàn)結(jié)束后測量小鼠腫瘤的體積和重量。

1.2.2體外細(xì)胞培養(yǎng)? 將H1975細(xì)胞在100 U/ml鏈霉素、100 U/ml青霉素和10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，放置于5%CO2、37℃的培養(yǎng)箱之中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)2 d后行一次傳代，取對(duì)數(shù)生長細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 觀察指標(biāo)

①隨著給藥時(shí)間的延長，觀察三組小鼠精神狀態(tài)、活動(dòng)量、飲食量及毛色情況;②三組小鼠腫瘤體積與重量分析：兩周實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死小鼠，取接種部位腫瘤，稱量體重，然后用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的最長徑（a）和最小徑（b），根據(jù)計(jì)算公式V=0.5 ab2計(jì)算腫瘤體積; ③三組小鼠腫瘤組織中MVD計(jì)數(shù)與VEGF表達(dá)：取三組小鼠的腫瘤組織的3張石蠟切片，在100倍顯微鏡下每張切片隨機(jī)選取兩個(gè)視野，先在光鏡低倍鏡（×100）下每張切片選取3個(gè)血管密度高的區(qū)域，再轉(zhuǎn)到高倍鏡（×200）下計(jì)數(shù)每一區(qū)域血管數(shù)量，以其平均值作為MVD計(jì)數(shù);VEGF蛋白的表達(dá)從三組腫瘤組織的石蠟切片中隨機(jī)選3張進(jìn)行改良ABC免疫酶標(biāo)記法檢測，測定方法按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行操作。在100倍顯微鏡下每張切片隨機(jī)選取兩個(gè)視野，利用免疫組化定量分析軟件進(jìn)行圖像分析，測定各組在統(tǒng)一光度下陽性細(xì)胞面積（Area）和光密度（ID）值，計(jì)算免疫組化指數(shù)（IA）。計(jì)算公式：IA=Area×ID×0.28;④兩組不同治療方法對(duì)H1975細(xì)胞和ECV細(xì)胞的抑制：瘤重抑制率（%）=（對(duì)照組平均瘤重-藥物組平均瘤重）/對(duì)照組平均瘤重×100%。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以[n（%）] 表示，采用χ2檢驗(yàn);符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用F檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物觀察比較

隨著給藥時(shí)間的延長，對(duì)照組小鼠慢慢精神較差，活動(dòng)量與飲食量減少，卷縮扎堆，毛色灰暗無光澤度（圖1A）。聯(lián)合用藥組小鼠活動(dòng)情況與飲食情況基本正常，單一用藥組小鼠表現(xiàn)介于兩組之間（圖1B）。

2.2實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)三組腫瘤體積與重量比較

三組小鼠的腫瘤體積與重量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001），對(duì)照組最大，其次為單一用藥組，最后為聯(lián)合用藥組。見表1。37F02D83-6E2B-4E2E-8EBA-CB51506ADABE

2.3三組小鼠腫瘤組織中MVD計(jì)數(shù)與VEGF表達(dá)比較

三組小鼠VEGF表達(dá)與MVD計(jì)數(shù)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001），聯(lián)合用藥組的數(shù)值最小。見表2。

2.4兩組不同治療方法對(duì)H1975細(xì)胞和ECV細(xì)胞的抑制作用比較

聯(lián)合用藥組的抑制率明顯優(yōu)于單一用藥組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。見表3。

3討論

肺癌在全球范圍內(nèi)已成為癌癥死亡的重要原因，其中有70%～80%的肺癌患者為非小細(xì)胞肺癌，在發(fā)現(xiàn)時(shí)已經(jīng)失去了手術(shù)治療機(jī)會(huì)[7]。所以需要應(yīng)用免疫治療、放化療等綜合治療方法，但效果并不理想。因?yàn)槟[瘤的生長需要血管的形成代謝廢物、提供營養(yǎng)，腫瘤轉(zhuǎn)移、浸潤需要依賴血管生成，因此抗血管生成治療成為肺癌治療研究的熱點(diǎn)。重組人血管內(nèi)皮技術(shù)是針對(duì)于內(nèi)皮細(xì)胞作為靶點(diǎn)的一種合成內(nèi)皮抑素制劑。當(dāng)前大量研究表明[8-10]，重組人血管內(nèi)皮抑素具有抵抗肺癌的作用，這是因?yàn)橹亟M人血管內(nèi)皮抑素能夠抑制腫瘤新生血管生成，并修剪不成熟血管，強(qiáng)化殘留血管，能夠讓腫瘤組織出現(xiàn)短暫正?；瘯r(shí)間窗，增加血流灌注效率，提高化療效果，而且也能夠減輕機(jī)體其他氣管對(duì)化療藥物的負(fù)擔(dān)。EGFR-TKIs是目前世界范圍內(nèi)肺癌治療領(lǐng)域中應(yīng)用最廣泛的靶向藥物。多數(shù)患者初期使用EGFR-TKIs治療有效，但一段時(shí)期后會(huì)出現(xiàn)繼發(fā)性耐藥，最常見的機(jī)制是發(fā)生T790M突變[11-13]。因此本文對(duì)小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，聯(lián)合應(yīng)用重組人血管內(nèi)皮抑素和EGFR-TKIs。

本研究結(jié)果顯示，隨著給藥時(shí)間的延長，對(duì)照組小鼠慢慢精神較差，活動(dòng)量與飲食量減少，卷縮扎堆，毛色灰暗無光澤度。聯(lián)合用藥組小鼠活動(dòng)情況與飲食情況基本正常，單一用藥組小鼠表現(xiàn)介于兩組之間。曠華香等[14]研究表明，重組人血管內(nèi)皮抑素不僅能夠?qū)е卵苷；饔?，并修剪掉一些無功能和不成熟的血管，能夠讓更多的血流到達(dá)腫瘤內(nèi)部，讓藥物更好地作用于腫瘤細(xì)胞。且能夠抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長，重組人血管內(nèi)皮抑素和EGFR-TKIs聯(lián)合使用效果更好，與本研究結(jié)果相符;三組小鼠的腫瘤體積與重量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001），對(duì)照組最大，其次為單一用藥組，最后為聯(lián)合用藥組。相關(guān)研究表明[15-17]，VEGF屬于機(jī)體重要的一種血管生成因子，能夠更高效地作用于人體血管內(nèi)皮細(xì)胞，并加快分裂與增殖速度，從而促進(jìn)新的血管生成。EGFR-TKIs能夠降低人體VEGF的表達(dá)，這也是抑制腫瘤生長的一個(gè)重要原因。T790M突變可使原來受抑制的EGFR通路發(fā)生磷酸化，VEGF表達(dá)上調(diào)，腫瘤細(xì)胞發(fā)生增殖，如加用VEGF抑制劑可降低VEGF水平，從而抑制已經(jīng)對(duì)EGFR-TKIs耐藥的腫瘤細(xì)胞增殖，實(shí)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)EGFR-TKIs的耐藥，與本研究結(jié)果具有一定相似性;通過對(duì)比小鼠腫瘤組織中MVD計(jì)數(shù)與VEGF表達(dá)發(fā)現(xiàn)，三組小鼠MVD計(jì)數(shù)與VEGF表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001），聯(lián)合用藥組的數(shù)值最小。當(dāng)前很多學(xué)者將腫瘤微血管密度（micro-vascular density，MVD）作為一種腫瘤微血管形成程度的一個(gè)重要標(biāo)志。因此本研究應(yīng)用重組人血管內(nèi)皮抑素和EGFR-TKIs聯(lián)合使用能夠降低MVD計(jì)數(shù)與VEGF表達(dá)，對(duì)肺癌腫瘤產(chǎn)生抑制作用;對(duì)比兩組不同治療方法對(duì)小鼠體內(nèi)H1975細(xì)胞和ECV細(xì)胞的抑制作用發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合用藥組的抑制率明顯優(yōu)于單一用藥組（P<0.05），提示重組人血管內(nèi)皮抑素和EGFR-TKIs聯(lián)合使用對(duì)于H1975細(xì)胞與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞具有抑制作用。相關(guān)研究表明[18-19]，恩度與厄洛替尼對(duì)腫瘤細(xì)胞并沒有直接殺傷作用，但能夠抑制腫瘤細(xì)胞的生長，與本研究結(jié)果相符。

綜上所述，恩度與厄洛替尼聯(lián)合作用于肺癌腫瘤能夠減小腫瘤大小，能夠抵抗腫瘤，可用于EGFR-TKIs耐藥患者中，值得臨床推廣。

[參考文獻(xiàn)]

[1]? ?黃受方.國際肺癌研究協(xié)會(huì)/美國胸科學(xué)會(huì)/歐洲呼吸學(xué)會(huì)國際多學(xué)科肺腺癌分類（2018年版）解讀[J].中華病理學(xué)雜志，2018，40（12）：793-796.

[2]? ?韓楠楠，姜秋穎，李里，等.重組人血管內(nèi)皮抑制素（恩度）臨床機(jī)制的研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2019， 19（15）：203-205.

[3]? ?秦叔逵，苗靜，韓寶惠，等.重組人血管內(nèi)皮抑制素聯(lián)合常用含鉑化療方案治療晚期非小細(xì)胞肺癌的Ⅳ期臨床研究[J].臨床腫瘤學(xué)雜志，2019，24（4）：6-15.

[4]? ?魏蕾，秦叔逵.重組人血管內(nèi)皮抑制素治療惡性心包積液的研究進(jìn)展[J].臨床腫瘤學(xué)雜志，2019，24（8）：81-89.

[5]? ?曹軍麗，王欣.鹽酸?？颂婺崧?lián)合阿帕替尼一線治療表皮生長因子受體21外顯子敏感突變的晚期非小細(xì)胞肺癌的效果與安全性評(píng)價(jià)[J].中國綜合臨床，2020，36（4）：319-323.

[6]? ?Hanahan D，Weinberg RA.Hallmarks of cancer：The next generation[J].Cell，2019，144（5）：646-674.

[7]? ?Ellis LM，Hicklin DJ.VEGF-targeted therapy：Mechanisms of anti-tumour activity[J].Nat Rev Cancer，2018，8（8）：579-591.

[8]? ?Ferrara N，Gerber HP，Lecouter J.The biology of VEGF and its receptors[J].Nat Med，2019，9（6）：669-676.37F02D83-6E2B-4E2E-8EBA-CB51506ADABE

[9]? ?Tan H，Mu G，Zhu W，et al.Down-regnlation of vascu1ar endothelial growth factor and up-regulation of pigment epithelium derived factor make low molecularweight heparin endostatin and polyethylene glycol-endostatin potential candidates for anti·angiogenesis drug[J].Biol Pharm Bull，2020，34（4）：545-550.

[10]? Naumov GN，Nilsson MB，Cascone T，et al.Combined vas cular endothelial growth factor receptor and epidermal growth factor receptor（EGFR）blockade inhibits tumor growth in xenograft models of EGFR inhibitor resistance[J].Clin Cancer Res，2019，15（10）：3484-3494.

[11]? 賈麗君，任宏濤，黃珊，等.厄洛替尼聯(lián)合貝伐單抗一線治療晚期非小細(xì)胞肺癌的療效觀察[J].陜西醫(yī)學(xué)雜志，2019，45（4）：492-493.

[12]? 童琳，周建，白春學(xué)，等.晚期非小細(xì)胞肺癌患者腫瘤突變負(fù)荷與靶向治療療效相關(guān)性[J].中國臨床醫(yī)學(xué)，2019， 26（4）：538-542.

[13]? 王慧娟，張國偉，王啟鳴，等.吉非替尼耐藥的晚期非小細(xì)胞肺癌聯(lián)合重組人血管內(nèi)皮抑素解救治療的臨床研究[J].實(shí)用臨床醫(yī)藥雜志，2020，16（21）：16-18.

[14]? 曠華香，徐世林，歐陽偉煒，等.重組人血管內(nèi)皮抑制素對(duì)大鼠放射性心肌纖維化的影響[J].中華放射醫(yī)學(xué)與防護(hù)雜志，2020，40（5）：343-348.

[15]? 江文帥，代先慧，黃春雷，等.重組人血管內(nèi)皮抑制素注射液聯(lián)合順鉑對(duì)肺癌合并惡性胸腔積液的療效研究[J].藥物評(píng)價(jià)研究，2019，42（5）：141-145.

[16]? 蘇楠，林森森，袁勝濤.腫瘤細(xì)胞與腫瘤微環(huán)境間的相互作用[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2020，12（30）：5985-5987.

[17]? 彭芳，陳明.抗血管生成和腫瘤血管正常化的研究進(jìn)展[J].中國肺癌雜志，2019，12（7）：799-804.

[18]? 杜凱.重組人血管內(nèi)皮抑素聯(lián)合第3代含鉑化療方案治療晚期非小細(xì)胞肺癌的療效觀察[J].當(dāng)代醫(yī)學(xué)，2019， 19（1）：34-35.

[19]? 付榆.恩度抗血管生成和在腫瘤血管正?；械难芯窟M(jìn)展[J].中國當(dāng)代醫(yī)藥，2020，18（13）：21-23.

（收稿日期：2021-07-22）37F02D83-6E2B-4E2E-8EBA-CB51506ADABE