楊文軍，朱煒瑋

1解放軍總醫(yī)院第六醫(yī)學(xué)中心急診醫(yī)學(xué)科，北京 100048

2解放軍總醫(yī)院第七醫(yī)學(xué)中心泌尿外科，北京 100027

腎細(xì)胞癌也稱為腎癌，是泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，流行病學(xué)統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，腎癌的發(fā)病率、病死率均呈逐漸上升趨勢[1]。腎透明細(xì)胞癌是最常見的腎癌類型，發(fā)病率占全部腎癌的75%[2]。目前，手術(shù)仍是早期腎透明細(xì)胞癌的首選治療方法。轉(zhuǎn)移性晚期腎透明細(xì)胞癌患者對放化療的敏感性較差，可選擇的治療方法較少。即使早期接受手術(shù)治療，亦有20%～50%的患者存在復(fù)發(fā)風(fēng)險，30%的患者存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移風(fēng)險[3-4]。因此，需要探索一種新的腎透明細(xì)胞癌治療策略，如分子靶向治療，但僅20%～40%的腎透明細(xì)胞癌患者對現(xiàn)有的靶向治療有效[5]，且其長期生存率并未發(fā)生明顯改善[6]。因此，需尋求新的與患者臨床特征及預(yù)后相關(guān)的基因，為腎透明細(xì)胞癌的治療提供新的靶點(diǎn)與目標(biāo)。

prohibitin（PHB）屬于SPFH家族成員，廣泛參與正常細(xì)胞增殖、遷移和凋亡等生理學(xué)過程，在肥胖、衰老、腫瘤發(fā)生發(fā)展等過程中發(fā)揮了重要作用[7-9]。有研究表明，PHB是一種潛在的抑癌基因，可以影響膀胱癌、食管癌等腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移過程[10]。但目前有關(guān)PHB在腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)及與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系尚未明確。本研究基于生物信息學(xué)分析PHB在腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)及臨床意義，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 PHB基因表達(dá)水平分析

通過癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫、人類蛋白質(zhì)圖譜（Human Protein Atlas，HPA）數(shù)據(jù)庫（http:/www.proteinatlas.org）[11]檢索PHB基因，條件設(shè)定為tissue，可獲得PHB基因在人體不同組織中的表達(dá)水平。通過UALCAN數(shù)據(jù)庫（http://ualcan.path.uab.edu/index.html）[12]分析PHB基因在腎透明細(xì)胞癌組織和正常腎臟組織中的表達(dá)水平，設(shè)置參數(shù)：基因PHB，腫瘤類型kidney renal clear cell carcinoma，分型類型選擇expression。

1.2 PHB基因表達(dá)水平與腎透明細(xì)胞癌患者臨床特征和預(yù)后的關(guān)系

通過UALCAN數(shù)據(jù)庫評估PHB基因表達(dá)水平與腎透明細(xì)胞癌患者臨床特征的關(guān)系，包括性別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況和分化程度。通過基因表達(dá)譜交互分析（gene expression profiling interactive analysis，GEPIA）數(shù)據(jù)庫（http://gepia.cancer-pku.cn/）[13]分析PHB基因表達(dá)水平與腎透明細(xì)胞癌患者生存情況的關(guān)系。設(shè)置參數(shù)：基因PHB，腫瘤類型為kidney renal clear cell carcinoma，生存分析類型為overall survival；取cut-off-high（%）為50%，cut-offlow（%）為50%。

1.3 PHB基因相互作用靶點(diǎn)的獲取及蛋白質(zhì)互作（proteinprotein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

通過 String數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/）[14]檢索出20個與PHB基因相互作用的關(guān)鍵蛋白，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，物種類型設(shè)定為human，置信度選擇“Medium 0.4”，相互作用最大數(shù)選擇20。

1.4 基因本位（gene ontology，GO）分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）分析

將交集基因輸入在線網(wǎng)站DAVID（https://david.ncifcrf.gov/）進(jìn)行GO、KEGG分析。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

通過TCGA、UALCAN、String等數(shù)據(jù)庫統(tǒng)計數(shù)據(jù)，非正態(tài)分布計量資料以中位數(shù)（四分位數(shù)）[M（P25，P75）]表示，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PHB基因相對表達(dá)量的比較

通過HPA數(shù)據(jù)庫分析PHB基因在人體正常組織中的表達(dá)情況顯示，PHB在腎臟、甲狀腺及心臟組織中高表達(dá)，在正常腎臟組織中的表達(dá)豐度較高，提示PHB在腎臟組織中可能發(fā)揮了重要作用。同樣，本研究通過UALCAN數(shù)據(jù)庫分析PHB基因在腎透明細(xì)胞癌（n=72）及正常腎臟組織中（n=533）的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，PHB基因在腎透明細(xì)胞癌組織中的相對表達(dá)量為118.001（101.249，137.871），明顯低于正常腎臟組織的209.904（190.427，237.008），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。（圖1）

圖1 PHB在人體各組織中的表達(dá)豐度

2.2 不同臨床特征腎透明細(xì)胞癌患者腫瘤組織中PHB基因相對表達(dá)量的比較

不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況腎透明細(xì)胞癌患者腫瘤組織中PHB基因相對表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；男性、未分化腎透明細(xì)胞癌患者腫瘤組織中PHB基因相對表達(dá)量分別低于女性、低中高分化患者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。（表1）

表1 533例不同臨床特征腎透明細(xì)胞癌患者腫瘤組織中PHB基因的相對表達(dá)量[M（P25，P75）]

2.3 PHB基因相對表達(dá)量與腎透明細(xì)胞癌患者預(yù)后的關(guān)系

依據(jù)PHB基因相對表達(dá)量，取cut-off-high（%）為50%，cut-off-low（%）為50%，將腎透明細(xì)胞癌患者分為PHB高表達(dá)組（n=258）和PHB低表達(dá)組（n=258），因部分患者隨訪資料不全，因此總例數(shù)少于533例，結(jié)果顯示，PHB低表達(dá)組腎透明細(xì)胞癌患者總生存期短于PHB高表達(dá)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），表明PHB低表達(dá)可能與患者的預(yù)后不良相關(guān)。（圖2）

圖2 PHB高表達(dá)組（n=258）和PHB低表達(dá)組（n=258）腎透明細(xì)胞癌患者的總生存曲線

2.4 PHB相互作用蛋白的PPI網(wǎng)絡(luò)

將PHB基因相互作用的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫，得到PPI網(wǎng)絡(luò)，共篩選出20個PHB基因相互作用的蛋白，分別為SPG7、AFG3 ATP酶家族基因3樣2多克隆抗體（AFG3 like matrix AAA peptidase subunit 2，AFG3L2）、PHB2、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脂質(zhì)Raft關(guān)聯(lián)蛋白（ER lipid raft associated，ERLIN）1、ERLIN2、SOS-Ras/Rac鳥嘌呤核苷酸交換因子1（SOS Ras/Rac guaninenucleotide exchange factor1，SOS1）、表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）、磷脂酰肌醇-4，5二磷酸 3-激酶催化亞單位γ（phosphatidylinositol-4，5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit gamma，PIK3CG）、鳥嘌呤核苷酸解離刺激因子（Ral guanine nucleotide dissociation stimulator，RALGDS）、MLLT4、重組人Ras相關(guān)蛋白Krev-1（Ras-related protein Krev-1，RAP1A）、酪氨酸3-加單氧酶/色氨酸5-加單氧酶激活蛋白（tyrosine 3-monooxygenase/tryptophan 5-monooxygenase activation protein，delta polypeptide，YWHAZ）、酪氨酸3-單加氧酶/色氨酸5-單加氧酶激活蛋白β（tyrosine 3-monooxygenase/tryptophan 5-monooxygenase activation protein beta，YWHAB）、迅速加速纖維肉瘤1（rapidly accelerated fibrosarcoma 1，RAF1）、鼠類肉瘤病毒癌基因同源物B1（vraf murine sarcoma viral oncogene homolog B1，BRAF）、磷脂酰肌醇-4，5二磷酸3-激酶催化亞單位α（phosphatidylinositol-4，5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit α，PIK3CA）、Harvery鼠肉瘤病毒癌基因（v-Ha-ras Harvey rat sarcoma viral oncogene homolog，HRAS）、鼠類肉瘤病毒癌基因（kirsten rat sarcoma viral oncogene，KRAS）、絲裂原活化蛋白激酶 1（mitogen-activated protein kinase 1，MAP2K1）、酪氨酸3-單加氧酶/色氨酸5-單加氧酶激活蛋白eta（tyrosine 3-monooxygenase/tryptophan 5-monooxygenase activation protein eta，YWHAH）。（圖3）

圖3 PHB相互作用蛋白的PPI網(wǎng)絡(luò)

2.5 GO分析結(jié)果

對20個蛋白對應(yīng)的基因進(jìn)行GO分析，結(jié)果顯示，細(xì)胞成分主要集中于細(xì)胞內(nèi)液、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞質(zhì)膜及線粒體等，生物進(jìn)程主要集中于細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞死亡調(diào)控及細(xì)胞凋亡調(diào)控等，分子功能主要集中于蛋白結(jié)合、ATP結(jié)合、蛋白酶激活等。（圖 4）

圖4 GO分析結(jié)果

2.6 KEGG通路富集分析結(jié)果

對這20個蛋白對應(yīng)的基因進(jìn)行KEGG通路富集分析，結(jié)果顯示，這些基因主要富集于磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphoinositide 3-kinases，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又稱AKT）信號通路、免疫反應(yīng)相關(guān)通路等。（圖5）

圖5 KEGG通路富集分析結(jié)果

3 討論

相關(guān)研究顯示，腎癌發(fā)病率占所有惡性腫瘤的2%～3%[15]。腎透明細(xì)胞癌作為腎癌中最常見的類型，在中國及全球的發(fā)病率也不斷上升。2020年，腎透明細(xì)胞癌每年新發(fā)病例超過40萬例，病死超過15萬例[16]。早期腎透明細(xì)胞癌患者主要采用外科手術(shù)治療，而中晚期患者多已經(jīng)失去了最佳的手術(shù)治療時機(jī)。因此，尋找一種早期診斷及預(yù)后評估的相關(guān)分子標(biāo)志物迫在眉睫。

PHB基因廣泛表達(dá)于細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜及線粒體上[17-18]。已有研究表明，PHB參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、DNA轉(zhuǎn)錄等多種生理過程[19]。PHB可以通過調(diào)控E2F、Rb等轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)及RAS/RAF/絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MEK）/細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）信號通路參與細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)，而促凋亡機(jī)制主要通過對細(xì)胞線粒體、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2-associated X protein，BAX）等凋亡相關(guān)蛋白的調(diào)控完成[20]。研究顯示，PHB在乳腺癌、卵巢癌等腫瘤的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮了重要作用[21-22]，但關(guān)于PHB基因在腎癌中表達(dá)及在腎癌發(fā)展過程中的作用機(jī)制均未見相關(guān)研究報道。

本研究利用TCGA數(shù)據(jù)庫中腎透明細(xì)胞癌相關(guān)數(shù)據(jù)，分析PHB基因在腎透明細(xì)胞癌中表達(dá)及與患者臨床特征和預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果顯示：①通過HPA數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，PHB在正常腎臟組織中高表達(dá)，提示其在腎臟正常生理過程中可能發(fā)揮了重要作用，但通過UALCAN數(shù)據(jù)庫中分析PHB基因在正常腎臟組織及腎癌組織中的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，PHB在腎透明細(xì)胞癌組織中明顯低表達(dá)。②通過UALCAN數(shù)據(jù)庫分析PHB與腎透明細(xì)胞癌患者臨床特征的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，PHB的表達(dá)水平與腎透明細(xì)胞癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況無關(guān)，與性別、分化程度有關(guān)。③通過GEPIA數(shù)據(jù)庫分析PHB與腎透明細(xì)胞癌患者預(yù)后的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，PHB低表達(dá)組腎透明細(xì)胞癌患者總生存期短于PHB高表達(dá)組。④通過String數(shù)據(jù)庫篩選出20個與PHB基因相互作用的蛋白質(zhì)，其對應(yīng)基因通過DAVID在線進(jìn)行GO及KEGG富集分析，結(jié)果顯示，PHB的表達(dá)可能與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞黏附、免疫耐受有關(guān)；PI3K/AKT通路可能參與了細(xì)胞增殖及凋亡過程，可明顯促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長，與肝癌、卵巢癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[23]，而PHB是否通過PI3K/AKT通路在腎透明細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮作用至今仍未見報道，可考慮作為以后研究的一個方向。

綜上所述，本研究基于TCGA等數(shù)據(jù)庫，通過對腎透明細(xì)胞癌中PHB相關(guān)信息的分析發(fā)現(xiàn)，PHB基因在腎透明細(xì)胞癌組織中低表達(dá)，且其表達(dá)水平與患者的預(yù)后有關(guān)，表明PHB對腎透明細(xì)胞癌的診斷、分期、分級、治療及預(yù)后評估均有較高的價值。雖然通過相關(guān)數(shù)據(jù)分析可以為PHB與腎透明細(xì)胞癌關(guān)系的研究提供相關(guān)線索，但其具體的作用機(jī)制、信號通路仍需要進(jìn)一步的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)去證實(shí)，使PHB成為一種新的分子標(biāo)志物應(yīng)用于臨床對腎透明細(xì)胞癌的早期診斷、治療及預(yù)后評估成為可能。