董玉娟，李素梅，周敏

廣東省第二中醫(yī)院，廣東 廣州 510095

柔肝方由鉤藤、天麻、白芍、川牛膝等七味中藥組方而成，是廣東省第二中醫(yī)院心血管科專家多年來總結(jié)的臨床驗方。本方具有平肝柔肝功效，臨床研究表明可明顯改善高血壓肝陽上亢癥患者的頭痛、頭暈、頭脹等不適癥狀，且可有效降低患者血壓、血漿腎素及血管緊張素Ⅱ水平［1-2］。為了減少中藥煎煮煩瑣，保證用藥質(zhì)量，推進中醫(yī)藥現(xiàn)代化，已將其開發(fā)為使用方便的顆粒劑。本課題采用薄層色譜法與高效液相色譜法二者結(jié)合來為保證柔肝顆粒質(zhì)量提供方法學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器

微量分析天平（Mettler-Toledo XPE26）；電子分析天平（Mettler-Toledo ME55）；電熱數(shù)恒溫水浴鍋（HH-2 LICHEN）；數(shù)控超聲波清洗機（KQ-50E昆山）；薄層自動點樣器（CAMAG AUTOMATIC TLC SAMPLER 4）；高效液相色譜儀（Agilent 1100）；Agilent Extend-C18 液相色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；自動純水機（MilliPore Advantage A10）。

1.2 藥品與試劑

芍藥苷對照品（批號：110736-201640，純度為95.2%）；鉤藤對照藥材（批號：121190-201204）；白芍對照藥材（批號：120905-201610）；川牛膝對照藥材（批號：121065-201406）均購于中國食品藥品檢定研究院。柔肝顆粒（批號：20200506、20200507、20200508，規(guī)格：每袋裝6 g，每袋相當(dāng)于飲片23.35 g）來源于廣東省第二中醫(yī)院制劑室。柔肝顆粒陰性對照所用藥材均為廣州至信藥業(yè)股份有限公司購買并經(jīng)鑒定符合《中國藥典》中各藥材標(biāo)準(zhǔn)。

2 方法與結(jié)果

2.1 TLC 的定性鑒別

2.1.1 鉤藤（1）供試品溶液制備：三個批號樣品分別取樣2 g，研缽研細，加入2 mL 濃氨試液，樣品浸泡30 min 后加入50 mL 三氯甲烷，置水浴鍋中加熱回流2 h，取20 mL 濾液蒸干，殘渣加1 mL 甲醇溶解殘渣即得。（2）對照藥材溶液制備：取鉤藤對照藥材1 g，同（1）法制備。（3）陰性對照溶液制備：按柔肝顆粒處方比例，取除鉤藤以外六味中藥參照工藝制法進行水煮、濃縮、干燥等步驟制得陰性對照溶液，取樣2 g，同（1）法制備。自動點樣器精密吸?。?）（2）（3）溶液點于硅膠G 薄層板上，展開缸里展開，展開劑：石油醚（60～90 ℃）-丙酮（6∶4），顯色劑：改良碘化鉍鉀試液。由圖1 可見：三個批號樣品的色譜圖基本一致，表明本制劑生產(chǎn)工藝穩(wěn)定，且供試品的色譜圖與對照藥材的色譜圖在相同位置上有相同的黃色斑點，該黃色斑點在陰性對照色譜圖中未出現(xiàn)。

圖1 鉤藤的薄層色譜圖

2.1.2 川牛膝（1）供試品溶液制備：三個批號樣品分別取樣4 g，研缽研細后置具塞錐形瓶中，加入甲醇50 mL，置于數(shù)控超聲波清洗機中進行超聲處理30 min，取濾液蒸干，殘渣加10 mL 水溶解，水溶液用50 mL 水飽和正丁醇分次進行萃取，得正丁醇萃取液，用氨試液分次洗滌，棄去，蒸干正丁醇液并加1 mL 甲醇溶解即得。（2）對照藥材溶液制備：取1 g 川牛膝對照藥材，同（1）法制備。（3）陰性對照溶液制備：按柔肝顆粒處方比例，取除川牛膝以外六味中藥，參照工藝制法進行水煮、濃縮、干燥等步驟制得陰性對照溶液，取樣4 g，同（1）法制備。自動點樣器精密吸取（1）（2）（3）溶液點于硅膠G薄層板上，放置于展開缸中展開，展開劑：三氯甲烷-甲醇-甲酸（9∶1∶0.5），顯色劑：1%對二甲氨基苯甲醛10%硫酸乙醇溶液，60 ℃加熱至斑點顯色清晰，放置于紫外光燈365 nm 下進行檢視。結(jié)果顯示：三個批號樣品的色譜圖基本一致，且在與對照藥材色譜圖中相同位置上均有相同的顏色熒光斑點，該熒光斑點在陰性對照色譜圖中未出現(xiàn)。見圖2。

圖2 川牛膝的薄層色譜圖

2.1.3 白芍（1）供試品溶液制備：三個批號樣品分別取樣1 g，研缽研細，加入25 mL 乙醇進行超聲處理30 min，取濾液蒸干，加1 mL 乙醇溶解殘渣即得。（2）對照藥材溶液制備：取白芍對照藥材0.5 g，同（1）法制備。（3）陰性對照溶液制備：按柔肝顆粒處方比例，取除白芍以外六味中藥參照工藝制法進行水煮、濃縮、干燥等步驟制得陰性對照溶液，取樣1 g，同（1）法制備。自動點樣器精密吸?。?）（2）（3）溶液點于硅膠G 薄層板上進行展開，展開劑：三氯甲烷-甲醇-乙酸乙酯（8∶4∶1），氨蒸氣預(yù)飽和，顯色劑：5%香草醛硫酸溶液加熱至斑點顯色清晰。結(jié)果顯示：三個批號樣品的色譜圖基本一致，且均有相同的藍紫色斑點與對照藥材色譜圖的對應(yīng)位置一致，在陰性對照色譜圖中未見該藍紫色斑點。見圖3。

圖3 白芍的薄層色譜圖

2.2 高效液相色譜的定量分析

2.2.1 溶液的制備供試品溶液的制備：取已研細的柔肝顆粒樣品約0.5 g，置于50 mL 具塞錐形瓶中精密稱定，精密加入25 mL 稀乙醇，稱定重量，超聲處理30 min 后，取出放冷，待其冷卻后再稱重，用稀乙醇補重后取續(xù)濾液進行檢測。對照品儲備液的制備：精密稱定芍藥苷對照品2.647 mg，置于25 mL 容量瓶中，加甲醇溶解至刻度搖勻制成100.8 μg/mL 的溶液。陰性對照溶液的制備：按柔肝顆粒處方比例，取除白芍以外六味中藥參照工藝制法進行水煮、濃縮、干燥等步驟制得陰性對照，取已研細的陰性對照0.5 g，精密稱定，同法制得。

2.2.2 色譜條件液相色譜柱：Agilent Extend-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相：乙腈-0.1%磷酸溶液（15∶85），檢測波長：230 nm，柱溫：25 ℃，流速：1 mL/min，進樣量：10 μL。

2.2.3 測定法分別精密吸取上述“2.2.1”項中的三種溶液注入高效液相色譜儀中進行測定，在供試品溶液的HPLC 色譜圖中可找到與對照品芍藥苷一致的色譜峰，且在陰性對照的色譜圖中未出現(xiàn)該色譜峰。見圖4。

圖4 高效液相色譜圖：A.芍藥苷對照品；B.供試品；C.陰性樣品

2.2.4 方法學(xué)考察（1）線性關(guān)系考察：取芍藥苷對照品溶液（100.8 μg/mL）加甲醇稀釋制成分別為10.08 μg/mL、20.16 μg/mL、30.24 μg/mL、50.40 μg/mL、70.56 μg/mL、100.80 μg/mL 6 種不同濃度的溶液。精密吸取6 種不同濃度的對照品溶液各10 μL 進行檢測，橫坐標(biāo)為芍藥苷進樣量，縱坐標(biāo)為芍藥苷峰面積，得回歸方程：Y=3 132.8X+51.719（r=0.999 9），表明在0.100 8～1.008 μg 范圍內(nèi)芍藥苷呈良好線性回歸。（2）精密度試驗：同一供試品溶液連續(xù)進樣檢測6 次，計算6 次所得芍藥苷峰面積的RSD 為0.46%，表明所用HPLC 儀器精密度良好。（3）重復(fù)性試驗：分別精密稱取6 份供試品，制備供試品溶液，進樣檢測，6 份供試品溶液中芍藥苷含量的RSD 計算結(jié)果為0.58%，表明所建立的HPLC 含量檢測方法重現(xiàn)性良好。（4）穩(wěn)定性試驗：同一供試品溶液分別于0、2、4、8、12 h 進樣檢測，5 次所得芍藥苷峰面積的RSD 計算結(jié)果為0.21%，表明在12 h 內(nèi)樣品溶液穩(wěn)定，保證檢測結(jié)果可靠。（5）加樣回收試驗：精密稱取已知芍藥苷含量的供試品9 份，分別按80%、100%、120%加入芍藥苷對照品各3 份，制備供試品溶液，檢測，計算得回收率為98.56%，RSD 為1.04%。

2.2.5 供試品含量測定分別稱取3 個批號（20200506、20200507、20200508）柔肝顆粒樣品0.5 g，精密稱定，各2 份，制備供試品溶液，計算得柔肝顆粒中芍藥苷的含量分別為：4.972 6 mg/g、4.753 7 mg/g、4.831 7 mg/g，平均含量為4.852 7 mg/g。以平均含量80%設(shè)限，擬定每袋制劑中芍藥苷的含量不少于23.29 mg。

3 討論

柔肝顆粒由鉤藤、天麻、白芍、川牛膝、桑寄生、杜仲、茯苓七味中藥經(jīng)水提、濃縮、干燥、制粒等步驟制備而成。方中鉤藤長于清肝熱，天麻息風(fēng)止痙，平抑肝陽，二者用以為君藥而達平肝祛風(fēng)功效；白芍養(yǎng)血柔肝、川牛膝味苦善泄降而引血下行，二者相配以為臣，火氣無從上擾，養(yǎng)陰瀉火相得益彰；桑寄生、杜仲補肝腎以固本，茯苓健脾利水以安中焦脾胃，三藥共奏柔肝益腎，寧心安神之功，為佐藥。目前柔肝顆粒只根據(jù)《中國藥典》顆粒劑檢查項下的粒度、水分、溶化性等進行質(zhì)量控制，無針對本方所含的藥材與有效成分進行檢測。由于缺乏系統(tǒng)化標(biāo)準(zhǔn)化的質(zhì)量評價且檢測指標(biāo)較少、檢測手段較低，中藥制劑質(zhì)量良莠不齊，質(zhì)量可控性較差難以保證有效性，臨床使用反饋療效不穩(wěn)定為醫(yī)院制劑存在的主要問題之一［3-5］。為了有效地控制柔肝顆粒制劑的質(zhì)量，本試驗采用TLC 薄層色譜與HPLC含量測定來制定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)檢測方法。

本試驗采用TLC 定性鑒別方法進行鑒別君藥和臣藥，結(jié)果提示天麻色譜圖陰性有干擾；鉤藤、白芍的色譜方法均在《中國藥典》的基礎(chǔ)上進行調(diào)整，分離度較好、無拖尾、斑點清晰、陰性無干擾；川牛膝參照《中國藥典》方法進行鑒別時，斑點分離度差，拖尾嚴(yán)重，在參考文獻［6］的基礎(chǔ)上再做調(diào)整后，結(jié)果理想。鉤藤、白芍、川牛膝的鑒別方法簡便、可操作性強，故選擇上述藥材作為本制劑的快速定性鑒別方法的指標(biāo)。在建立含量測定方法時，應(yīng)選擇君藥為含量測定指標(biāo)，在參考《中國藥典》與文獻［7-9］對鉤藤堿與天麻素進行實驗時，陰性均有干擾，故選擇臣藥白芍進行研究?，F(xiàn)代研究表明［10-11］白芍具有抗炎鎮(zhèn)痛、保肝、擴張血管、改善心肌肥厚等作用，其藥理作用與柔肝顆粒的功效具有顯著相關(guān)性，故選擇芍藥苷為含量檢測指標(biāo)，在建立含量測定方法時，同時對流動相、色譜柱、流速、柱溫等進行了考察，在綜合考慮儀器的耐用性、色譜峰的分離度、色譜峰峰形、分析時間等因素后，明確了芍藥苷的檢測方法，所建立的方法準(zhǔn)確、可靠，重現(xiàn)性好。

本研究所建立的薄層色譜和含量測定方法能對柔肝顆粒的質(zhì)量進行有效地控制，可為保證柔肝顆粒的臨床應(yīng)用和進一步研究提供理論基礎(chǔ)。