章順，肖文濤

九江市檢驗(yàn)檢測(cè)認(rèn)證中心，江西 九江 332000

感冒止咳顆粒由柴胡等九味中藥材混合制成，適用于外感風(fēng)熱所致咳嗽［1］。方中柴胡、山銀花疏散退熱，共為君藥；葛根解肌退熱，青蒿退虛熱，連翹、黃芩清熱解毒，共為臣藥；桔梗、苦杏仁宣降肺氣以止咳化痰，薄荷腦芳香辛散，共為佐藥，諸藥合用，共奏清熱解表、止咳化痰之功效。目前感冒止咳顆粒主要收載于《中國(guó)藥典》2020 年版，其中定量測(cè)定的有效成分只有黃芩苷，且其他諸多研究也只限于感冒止咳顆粒中君方兩藥和臣方四藥的主要有效成分［2-6］。而薄荷腦作為易揮發(fā)的佐藥，具有清輕涼散，疏風(fēng)解毒和提神醒腦的功效，有助于更好地治療感冒和咳嗽，故為了更全面地保證感冒止咳顆粒的質(zhì)量，本研究采用薄層色譜法和氣相色譜法對(duì)12 個(gè)不同廠家生產(chǎn)的39 批感冒止咳顆粒中薄荷腦進(jìn)行了準(zhǔn)確的定性、定量分析。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent Technologies 7890A 氣相色譜儀（Agilent公司）；YIY-UL300W-C 型超聲機(jī)（上海藝源設(shè)備有限公司）；薄層加熱板Ⅲ（Camag 公司）；薄層色譜數(shù)碼系統(tǒng)（Camag 公司）；BP 211D 型電子天平（Sartorius 公司）。

1.2 對(duì)照品

薄荷腦對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110728-201707，含量100.0%）；萘對(duì)照品（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)制劑有限公司，批號(hào)：Lot.No.20160919，含量99.5%）。

1.3 材料與試劑

感冒止咳顆粒生產(chǎn)企業(yè)A（批號(hào)ZCB2007、ZCB2008、ZAB2114、ZAB2101、ZCB2105、ZBB1918），生產(chǎn)企業(yè)B（批號(hào)191101、200320、210105、201205、201210、210107），生產(chǎn)企業(yè)C（批號(hào)201203、201105、201206、201004、210102），生產(chǎn)企業(yè)D（批號(hào)1912023、2012013、2101002、2012012），生產(chǎn)企業(yè)E(批號(hào)W2011038、W2101004、W2101005），生產(chǎn)企業(yè)F（批號(hào)201110、200609、200608），生產(chǎn)企業(yè)G（批號(hào)201101、201203），生產(chǎn)企業(yè)H（批號(hào)200334、201124），生產(chǎn)企業(yè)I（批號(hào)201111、201112），生產(chǎn)企業(yè)J（批號(hào)20190602032、20190604086），生產(chǎn)企業(yè)K（批號(hào)210112、201116），生產(chǎn)企業(yè)L（批號(hào)20210108、20210107）。

薄層色譜板（德國(guó)默克公司，批號(hào)HX90656226）；超純水；甲苯、乙酸乙酯、無水乙醇（均為分析純）。

2 薄荷腦薄層色譜鑒別

2.1 薄層色譜條件

以甲苯-乙酸乙酯（19∶1）為展開劑，展開晾干后再噴以5%香草醛硫酸溶液，放于105 ℃的薄層加熱板至斑點(diǎn)顯色清楚［7］。

2.2 溶液配制

2.2.1 供試品溶液A、B、C、D 的制備稱取A、B、C、D 不同廠家的感冒止咳顆粒各約10 g，分別置錐形瓶中，各加乙醇20 mL，超聲處理30 min，濾過，取續(xù)濾液。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備取薄荷腦對(duì)照品適量，加乙醇制成每1 mL 含2 mg 的溶液。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液的制備按照《中國(guó)藥典》2020年版中感冒止咳顆粒的處方配比進(jìn)行制備，在工藝最后不噴灑薄荷腦作為陰性對(duì)照物，取約10 g，照“2.2.1”項(xiàng)下制備方法制備。

2.3 鑒別試驗(yàn)

依次吸取對(duì)照品溶液5 μL，供試品溶液A 各5、10、15、20 μL，按照“2.1”項(xiàng)下薄層色譜條件進(jìn)行，在白光下觀察。結(jié)果表明：色譜圖中，供試品與對(duì)照品在相應(yīng)斑點(diǎn)位置上，顯相同樣的藍(lán)色斑點(diǎn)，且當(dāng)供試品點(diǎn)樣量為20 μL 時(shí)，其色譜圖中的薄荷腦斑點(diǎn)清晰，易于結(jié)果的判斷，結(jié)果見圖1。

圖1 薄荷腦薄層鑒別色譜圖

再依次吸取對(duì)照品溶液5 μL，供試品溶液A、B、C、D 和陰性對(duì)照溶液各20 μL，同法進(jìn)行，在白光下觀察。結(jié)果表明：供試品與對(duì)照品色譜在相應(yīng)斑點(diǎn)位置上，顯相同樣的藍(lán)色斑點(diǎn)，但不同廠家樣品斑點(diǎn)深淺不一，同時(shí)陰性對(duì)照溶液顯示無干擾，結(jié)果見圖2。

圖2 不同溶液的薄層鑒別色譜圖

3 薄荷腦含量測(cè)定

3.1 色譜條件

安捷倫7890A 氣相色譜儀（FID），色譜柱：DB-WAX（30.0 m×320 μm×0.25 μm）毛細(xì)管柱；柱溫：130 ℃，保持12 min；載氣：高純N2，流速40 mL/min，空氣流速400 mL/min，氫氣流速30 mL/min；分流比5∶1；檢測(cè)器溫度：300 ℃；進(jìn)樣口溫度：200 ℃；進(jìn)樣方式：直接液體進(jìn)樣；進(jìn)樣量5 μL。

3.2 溶液配制

3.2.1 萘內(nèi)標(biāo)溶液和對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備精密稱取萘對(duì)照品22.59 mg 和薄荷腦對(duì)照品13.18 mg，分別置于50 mL 量瓶中，加入無水乙醇定容，即得。

3.2.2 對(duì)照品溶液的制備精密吸取4 mL 對(duì)照品儲(chǔ)備液和1 mL 萘內(nèi)標(biāo)溶液于50 mL 容量瓶中，用無水乙醇定容，即得。

3.2.3 供試品溶液的制備稱取“1.3”項(xiàng)下所有批號(hào)的感冒止咳顆粒約20 g 于錐形瓶中，精密加入50 mL 含萘的無水乙醇溶液（精密吸取“3.2.1”中萘內(nèi)標(biāo)溶液20 mL，置1 000 mL 量瓶中，加無水乙醇至刻度，搖勻，即得），超聲30 min，濾過，取續(xù)濾液。

3.2.4 陰性對(duì)照溶液的制備稱取“2.2.3”項(xiàng)下的陰性對(duì)照品的20 g，按“3.2.3”項(xiàng)下方法配制，即得。

3.3 方法學(xué)驗(yàn)證

3.3.1 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)取“3.2.2，3.2.3，3.2.4”項(xiàng)下各溶液，按“3.1”進(jìn)行GC 分析，結(jié)果顯示，供試品與對(duì)照品色譜呈相同保留時(shí)間的薄荷腦色譜峰，且陰性樣品無干擾，結(jié)果見圖3。

圖3 感冒止咳顆粒氣相色譜圖：A.對(duì)照品溶液；B.供試品溶液；C.陰性對(duì)照品溶液

3.3.2 線性關(guān)系考察將上述對(duì)照品儲(chǔ)備液分別精密吸取1、2、4、10、20 mL 于50 mL 容量瓶中，精密加入1 mL 萘內(nèi)標(biāo)溶液，用無水乙醇定容，分別按“3.1”進(jìn)樣色譜分析。以薄荷腦與萘峰面積比（Y）對(duì)薄荷腦與萘質(zhì)量濃度比（X）進(jìn)行線性回歸得到回歸方程為Y=0.740 7X+0.008 3，相關(guān)系數(shù)r=0.999 8，說明在5.27×10-3～1.05×10-1mg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；用無水乙醇對(duì)對(duì)照品儲(chǔ)備液進(jìn)行逐級(jí)稀釋進(jìn)行色譜分析，當(dāng)信噪比（S/N）分別為3 和10 時(shí)，來確定薄荷腦的檢測(cè)限為8.02×10-4mg/mL，定量限為1.60×10-3mg/mL。

3.3.3 精密度考察取“3.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，按上述GC 條件連續(xù)測(cè)定6 次薄荷腦與萘的峰面積比，分別為1.670，1.681，1.699，1.690，1.705 和1.703，RSD 值為0.9%。

3.3.4 重復(fù)性考察平行配制6 份同一批號(hào)的感冒止咳顆粒（企業(yè)G，批號(hào)201101）作為供試品溶液，再分別進(jìn)行色譜分析，結(jié)果表明該批次薄荷腦含量的平均值為89.82 μg/g，RSD 值為1.4%。

3.3.5 穩(wěn)定性考察取同一批號(hào)的感冒止咳顆粒分別在0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)行上述色譜分析，通過不同時(shí)間該樣品中薄荷腦含量計(jì)算其RSD值為1.1%。

3.3.6 加樣回收率考察平行稱取上述供試品（企業(yè)G，批號(hào)201101）各9 份，每份約10 g，精密稱定，置錐形瓶中，分別精密依次加入低、中、高3 個(gè)不同含量的薄荷腦對(duì)照品，按“3.2.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行制備待測(cè)溶液，再進(jìn)行GC 分析，結(jié)果見表1。

表1 薄荷腦回收率結(jié)果

3.4 樣品測(cè)定

取“3.2.3”項(xiàng)下所有供試品溶液，按上述條件進(jìn)樣色譜分析。以每袋10 g，通過內(nèi)標(biāo)法計(jì)算其每袋中薄荷腦含量，結(jié)果見表2。

表2 各廠家各批次中薄荷腦的含量測(cè)定結(jié)果（mg/袋）

3.5 包裝袋吸附薄荷腦測(cè)定

感冒止咳顆粒均采用復(fù)合膜包裝，而復(fù)合袋包裝對(duì)薄荷腦有比較強(qiáng)的吸附作用。為了驗(yàn)證包裝袋是否吸附薄荷腦，筆者選取了薄荷腦含量較低的生產(chǎn)企業(yè)A 的兩個(gè)批號(hào)的薄荷腦包裝袋，將其剪碎，加入錐形瓶中，按“3.2.3”制備包裝袋溶液，再按“3.1”條件進(jìn)樣分析，得其薄荷腦含量分別為0.084 8 mg/袋和0.081 3 mg/袋。

4 討論

4.1 TLC 測(cè)定的結(jié)果

當(dāng)感冒止咳顆粒的取點(diǎn)樣為20 μL 時(shí)，其TLC圖中的藍(lán)色斑點(diǎn)清晰，結(jié)果準(zhǔn)確，且由此建立的TLC 法專屬性強(qiáng)，陰性無干擾，可作為感冒止咳顆粒中薄荷腦的鑒別和質(zhì)量控制。

4.2 選擇萘作為內(nèi)標(biāo)物的原因

通過翻閱相關(guān)資料以及上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知萘在該氣相色譜條件下峰形及出峰時(shí)間較好，與薄荷腦有很好的分離，且陰性無干擾［8-10］。

4.3 樣品測(cè)定的結(jié)果

根據(jù)表2 結(jié)果，39 批樣品中均能檢測(cè)出薄荷腦，但薄荷腦含量差異較大且整體數(shù)據(jù)普遍偏低，若根據(jù)本品配方，每1 000 g 樣品中應(yīng)含薄荷腦0.15 g，換算成每袋制劑應(yīng)含薄荷腦1.5 mg，則只有1 批樣品能達(dá)到此限度；如果用本次所有批次樣品測(cè)定平均值下浮20%來擬定限度（0.220 8 mg/袋），依舊有22 個(gè)不同廠家不同批次的樣品不能達(dá)到限度。

4.4 分析薄荷腦含量較低的原因

由于薄荷腦具有揮發(fā)性，其含量受溫度、儲(chǔ)存、包裝材料等的影響，可能導(dǎo)致薄荷腦含量偏低，故本研究測(cè)定了兩批包裝袋中薄荷腦的含量，結(jié)果顯示包裝袋對(duì)薄荷腦確實(shí)有比較強(qiáng)的吸附作用，但從結(jié)果上看可能并不是薄荷腦含量偏低的主要原因，主要可能與生產(chǎn)過程中的投料多少、工藝是否存在噴灑不均勻、儲(chǔ)存等因素有關(guān)，具體原因有待進(jìn)一步研究。