蔡麗朋，周琪

江西青峰藥業(yè)有限公司，江西 贛州 341000

替格瑞洛是英國(guó)阿斯利康（Astra Zeneca）公司研發(fā)的一種新型選擇性小分子抗凝血藥物［1］，與阿司匹林合用治療急性冠狀動(dòng)脈綜合征（ACS），降低心肌梗死和卒中的發(fā)生率［2］，相比已有的小分子抗凝血藥物更安全［3］。江西青峰藥業(yè)有限公司研發(fā)生產(chǎn)的替格瑞洛原料藥及片劑需要控制13個(gè)雜質(zhì)，含量測(cè)定方法需要考慮替格瑞洛與這13個(gè)雜質(zhì)的分離。文獻(xiàn)［4］提到了替格瑞洛原料藥含量測(cè)定的方法，但是其方法僅考慮了替格瑞洛與兩個(gè)雜質(zhì)之間的分離度，方法適用性差。本研究建立了同時(shí)適用于替格瑞洛原料藥與替格瑞洛片含量測(cè)定的方法，并參照《中國(guó)藥典》2020 年版四部通則9101［5］和人用藥品注冊(cè)技術(shù)要求國(guó)際協(xié)調(diào)會(huì)（ICH）Q2［6］要求進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證，為產(chǎn)品的質(zhì)量控制提供有效的手段。

1 儀器與材料

1.1 儀器

XS105DU 型電子天平（瑞典Mettler Toledo 公司）；KQ-300DE 型臺(tái)式數(shù)控超聲波清洗器（東莞市科橋超聲波設(shè)備有限公司）；Waters e2695-2489型高效液相色譜儀（美國(guó)Waters 公司）。

1.2 試藥

替格瑞洛對(duì)照品［江西青峰藥業(yè)有限公司（以下簡(jiǎn)稱自制），含量99.6%］；替格瑞洛原料藥（自制，含量99.8%）；替格瑞洛片（自制，規(guī)格：90 mg，含量97.0%）；雜質(zhì)A 對(duì)照品（自制，含量99.32%）；雜質(zhì)B 對(duì)照品（自制，含量98.85%）；雜質(zhì)C 對(duì)照品（自制，含量98.84%）；雜質(zhì)D 對(duì)照品（自制，含量98.86%）；雜質(zhì)E 對(duì)照品（自制，含量99.36%）；雜質(zhì)F 對(duì)照品（自制，含量98.69%）；雜質(zhì)G 對(duì)照品（自制，含量97.73%）；雜質(zhì)H 對(duì)照品（自制，含量98.93%）；雜質(zhì)I 對(duì)照品（自制，含量98.77%）；雜質(zhì)J 對(duì)照品（自制，含量99.07%）；雜質(zhì)K 對(duì)照品（自制，含量99.58%）；雜質(zhì)L 對(duì)照品（煙臺(tái)普里醫(yī)藥技術(shù)有限公司，含量99.69%）；雜質(zhì)M 對(duì)照品（自制，含量98.65%）；乙腈為色譜純，磷酸二氫鈉一水合物，磷酸二氫鈉二水合物，磷酸等其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

磷酸鹽緩沖液配制：稱取磷酸二氫鈉一水合物138 g 或磷酸二氫鈉二水合物156 g，加水1 000 mL溶解，用稀磷酸調(diào)pH 值至3.0，得1.0 mol/L 的磷酸二氫鈉溶液；取1.0 mol/L 磷酸二氫鈉溶液10 mL，加水至480 mL，搖勻。色譜柱為Aglient Zorbax SB C18 mm（150 mm×4.6 mm,1.8 μm），流動(dòng)相A：乙腈，流動(dòng)相B：磷酸鹽緩沖液，梯度洗脫；流速：1.0 mL/min；柱溫：55 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：242 nm；進(jìn)樣體積：5 μL。梯度洗脫表見(jiàn)表1。

表1 梯度洗脫表

2.2 溶液配制

（1）空白溶劑：35%乙腈。（2）原料藥供試品溶液配制：取替格瑞洛原料藥適量，精密稱定，加空白溶劑溶解并定量稀釋制成每1 mL 含替格瑞洛0.5 mg 的溶液。（3）片劑供試品溶液配制：取替格瑞洛片5 片，置100 mL 量瓶中，加空白溶劑約50 mL，超聲15 min，放冷，用空白溶劑稀釋至刻度，搖勻，過(guò)濾，取續(xù)濾液1.0 mL 置10 mL 量瓶中，用空白溶劑稀釋至刻度，搖勻。（4）替格瑞洛片空白輔料溶液配制：取處方量的空白輔料1 050 mg，置100 mL 量瓶中，其余操作同替格瑞洛片供試品溶液配制。（5）對(duì)照品溶液配制：取替格瑞洛對(duì)照品適量，精密稱定，加空白溶劑溶解并定量稀釋制成每1 mL含替格瑞洛0.5 mg 的溶液。（6）系統(tǒng)適用性溶液配制：取替格瑞洛有關(guān)物質(zhì)方法項(xiàng)下控制的雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C、雜質(zhì)D、雜質(zhì)E、雜質(zhì)F、雜質(zhì)G、雜質(zhì)H、雜質(zhì)I、雜質(zhì)J、雜質(zhì)K、雜質(zhì)L、雜質(zhì)M對(duì)照品，替格瑞洛對(duì)照品各適量，精密稱定，加空白溶劑溶解并逐步定量稀釋制成每1 mL 含雜質(zhì)A至雜質(zhì)M 各0.75 μg，替格瑞洛0.5 mg 的溶液。

2.3 專屬性

分別進(jìn)樣空白輔料溶液、替格瑞洛對(duì)照品溶液、替格瑞洛原料藥供試品溶液、替格瑞洛片供試品溶液色譜圖及系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)考查，各溶液色譜圖見(jiàn)圖1～5。

圖1 空白輔料溶液色譜圖

從圖中可知，空白輔料溶液、有關(guān)物質(zhì)項(xiàng)下控制的雜質(zhì)A～雜質(zhì)M 不干擾替格瑞洛的測(cè)定，替格瑞洛的保留時(shí)間為6.232 min，最小分離度為3.4，系統(tǒng)適用性良好，專屬性強(qiáng)。

圖2 替格瑞洛對(duì)照品溶液色譜圖

圖3 原料藥供試品溶液色譜圖

圖4 片劑供試品溶液色譜圖

圖5 系統(tǒng)適用性溶液色譜圖

2.4 精密度試驗(yàn)

取對(duì)照品溶液，依法連續(xù)進(jìn)樣6 次，替格瑞洛的保留時(shí)間RSD 為0.04%，峰面積RSD 為0.11%。結(jié)果表明儀器進(jìn)樣精密度良好。

2.5 線性與范圍

取替格瑞洛對(duì)照品適量，精密稱定，加空白溶劑溶解并稀釋成系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果在101.417～811.334 μg/mL 濃度范圍內(nèi)，峰面積（A）與替格瑞洛濃度（C）有良好的線性關(guān)系，回歸方程為A=5 907.6C+28 789，r=0.999 9。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

2.6.1 原料藥的重復(fù)性試驗(yàn)由實(shí)驗(yàn)員A 配制6 份供試品溶液，依“2.1”項(xiàng)下色譜方法測(cè)定；由實(shí)驗(yàn)員B 在不同的時(shí)間配制6 份供試品溶液，采用不同的儀器，依“2.1”項(xiàng)下色譜方法測(cè)定，比較12 份樣品的檢測(cè)結(jié)果：實(shí)驗(yàn)人員A 測(cè)定6 份供試品溶液含量均值為100.2%，RSD 為0.48%；實(shí)驗(yàn)人員B 測(cè)定6 份供試品溶液含量均值為99.5%，RSD 為0.18%；12 份供試品溶液含量RSD 為0.44%。

2.6.2 片劑的重復(fù)性試驗(yàn)由實(shí)驗(yàn)員A 配制6 份供試品溶液，依“2.1”項(xiàng)下色譜方法測(cè)定；由實(shí)驗(yàn)員B 在不同的時(shí)間配制6 份供試品溶液，采用不同的儀器，依“2.3”項(xiàng)下色譜方法測(cè)定，比較12 份樣品的檢測(cè)結(jié)果：實(shí)驗(yàn)人員A 測(cè)定6 份供試品溶液含量均值為97.0%，RSD 為0.35%；實(shí)驗(yàn)人員B 測(cè)定6 份供試品溶液含量均值為97.6%，RSD 為0.42%；12 份供試品溶液含量RSD 為0.48%。

2.7 回收率試驗(yàn)

2.7.1 原料藥回收率取替格瑞洛對(duì)照品適量，精密稱定，配制成進(jìn)樣濃度80%、100%、120%的3 種濃度的樣品溶液，每個(gè)濃度平行3 份，依法進(jìn)樣檢測(cè)，9份供試品溶液的平均回收率為99.9%，RSD為0.89%。

2.7.2 片劑回收率取替格瑞洛對(duì)照品適量和處方量的輔料，精密稱定，配制成進(jìn)樣濃度80%、100%、120%的3 種濃度的樣品溶液，每個(gè)濃度各3 份，依法進(jìn)樣檢測(cè)，9 份供試品溶液的平均回收率為100.3%，RSD 為0.41%。

2.8 溶液穩(wěn)定性

依法配制原料藥供試品溶液、片劑供試品溶液與對(duì)照品溶液，分別于0 h、2 h、4 h、12 h、24 h、32 h、40 h、48 h 進(jìn)樣，考察穩(wěn)定性。對(duì)照品溶液在48 h 內(nèi)，主峰峰面積RSD 為1.10%，保留時(shí)間RSD 為0.68%；原料藥供試品溶液在48 h 內(nèi)，主峰峰面積RSD 為1.24%，保留時(shí)間RSD 為0.69%；片供試品溶液在48 h 內(nèi)，主峰峰面積RSD 為0.68%，保留時(shí)間RSD 為0.10%。結(jié)果表明原料藥供試品溶液、片劑供試品溶液及對(duì)照品溶液在室溫條件下放置，至少48 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 耐用性

依法配制空白溶劑、空白輔料溶液、原料藥供試品溶液、片劑供試品溶液、對(duì)照品溶液及系統(tǒng)適用性溶液，微小改變色譜條件，依法檢測(cè)，考察方法耐用性。各個(gè)測(cè)試條件下，空白溶劑、空白輔料及有關(guān)物質(zhì)項(xiàng)下控制的其他雜質(zhì)對(duì)替格瑞洛檢測(cè)均無(wú)干擾，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 耐用性考察結(jié)果

結(jié)果表明：微小改變流速、柱溫、流動(dòng)相水相pH 值及使用不同批次色譜柱，不會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果造成影響，方法的耐用性良好。

2.10 樣品測(cè)定

分別取替格瑞洛原料藥和替格瑞洛片，按“2.2”項(xiàng)下分別配制供試品溶液，依“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 樣品的測(cè)定結(jié)果

3 結(jié)論

本研究建立了同時(shí)適用于替格瑞洛原料藥與替格瑞洛片含量測(cè)定的方法，本法精密度好，準(zhǔn)確度高、分析時(shí)間短、穩(wěn)定性良好，能夠同時(shí)滿足替格瑞洛原料藥和替格瑞洛片商業(yè)化生產(chǎn)中替格瑞洛含量的檢測(cè)要求，以便更好地控制產(chǎn)品的質(zhì)量。