羅詩豪，周志軍，胡靜，曾憲晶

井岡山大學(xué)附屬醫(yī)院，江西 吉安 343000

牙周炎是由多種因素引起的牙周組織的慢性感染，以牙齦炎癥和牙槽骨破壞為主要表現(xiàn)，嚴(yán)重者可導(dǎo)致牙齒松動，甚至脫落。作為成年人失牙最主要的病因，一項調(diào)查報告指出：牙周炎在世界范圍內(nèi)高發(fā)，涉及各個年齡段，患者人口占比高達全球人口的10%［1］。當(dāng)前牙周炎以牙周基礎(chǔ)治療為主，配合局部或全身藥物治療。近年來研究發(fā)現(xiàn)，基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）基因的功能多態(tài)性與牙周炎風(fēng)險性的增加密切相關(guān)，在骨破壞及重塑中發(fā)揮重要作用［2］。炎性因子水平與牙周炎嚴(yán)重程度成正比,可用于預(yù)測慢性牙周炎的預(yù)后［3］。研究表明［3-4］：一些中藥及其提純的有效成分可通過抑制MMPs 活性，減輕炎性反應(yīng)而起到治療牙周炎的作用。本實驗以MMPs 相關(guān)蛋白及炎性因子為研究切入點，探討復(fù)方牙痛酊對實驗性牙周炎大鼠的影響，為臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 實驗試劑與儀器

牙齦卟啉單胞菌（北京北納生物技術(shù)研究院）；脂多糖溶液（武漢博士德生物科技有限公司，2021A125）；鹽酸米諾環(huán)素溶液（上海美優(yōu)制藥廠，H10950348）；復(fù)方牙痛酊（貴州同濟堂制藥公司，Z20025807）；水合氯醛（中國醫(yī)藥集團有限公司，20201206）；ELISA 檢測試劑盒（北京伊塔生物科技有限公司）；RIPA 裂解液（武漢博士德生物科技有限公司）；酶標(biāo)儀（TC1000-S，美國賽默飛）；體視顯微鏡（蘇州南光光學(xué)儀器公司）；移液器（德國eppendorf 公司），SD 大鼠（湖南斯萊克景達實驗動物有限公司）。

1.2 動物造模與分組

將35 只健康成年SPF 級SD 大鼠，體質(zhì)量（250±50）g，鼠齡范圍10～12 周，雄雌比為18∶17，實驗單位使用許可證編號為SYXK（贛）2012-0001，生產(chǎn)許可證號SCXK（湘）2016-0002，動物房內(nèi)適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后轉(zhuǎn)入實驗造模，本實驗通過動物倫理審查。將大鼠分為造模組（30 只）和空白組（5 只），其中空白組正常喂養(yǎng)，未行任何處理。造模組大鼠通過磨牙結(jié)扎和牙齦卟啉單胞菌感染誘導(dǎo)牙周炎，采用文獻［5-6］記錄的操作方法對大鼠進行造模：用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，取4-0 絲線結(jié)扎雙側(cè)上頜第1 磨牙的頸部區(qū)域，之后用移液器每隔2 天將含2 μL 牙齦卟啉單胞菌和15 μL 脂多糖溶液的生理鹽水均勻注入到大鼠齦溝內(nèi)絲線處，連續(xù)造模4 周，每日觀察牙齦情況。大鼠造模成功標(biāo)準(zhǔn)參考文獻［7］記錄方法：大鼠牙齦組織內(nèi)可見炎性細胞浸潤，結(jié)締組織中膠原纖維破壞，結(jié)合上皮向根部增生，牙周袋加深；牙槽骨結(jié)構(gòu)疏松，骨吸收陷窩形成，破骨細胞數(shù)量明顯增多。

本次實驗共篩選出符合模型要求大鼠24 只。將造模后的大鼠染色標(biāo)號，采用隨機數(shù)字表法分3 組：模型組、對照組、實驗組，每組各8 只。給藥方法：模型組灌胃等量的生理鹽水，對照組按45 mg/kg 灌服等量的鹽酸米諾環(huán)素溶液，實驗組按500 mg/kg 灌胃復(fù)方牙痛酊（貴州同濟堂制藥公司，國藥準(zhǔn)字Z20025807，規(guī)格：50 mL/瓶），給藥劑量參照人與動物體表面積折算的等效劑量系數(shù)折算法［8］。每日給藥2 次，連續(xù)灌胃給藥4 周，直至取樣節(jié)點。

1.3 檢測方法

（1）ELISA 法檢測血清MMPs 及炎性因子水平，各組大鼠尾靜脈采集血液樣本，采用蛋白裂解液提取總蛋白，置入酶標(biāo)板孔中，滴入生物素標(biāo)記抗體，加入ABC 工作液，TMB 顯色，酶標(biāo)儀在波長450 nm 測定各孔的OD 值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。（2）大鼠牙槽骨吸收測定，大鼠麻醉后處死，逐步分離上頜骨組織，接著放入亞甲藍染液中染色2 min，用體視顯微鏡觀察上頜骨形態(tài)變化，測量第一至第三磨牙處釉牙骨質(zhì)界到牙槽嵴頂?shù)木嚯x，把其平均值作為該牙牙槽骨吸收值。（3）熒光染色：首先配制膠原纖維染色苦味酸天狼猩紅染液，切片脫蠟，乙醇梯度脫水，漂洗，苦味酸天狼猩紅染液染色后漂洗，脫水，透明，封固，偏振光熒光顯微鏡下觀察切片。（4）HE 染色：切片制作與染色，收集各大鼠上頜第1 磨牙的牙齦組織，置于4%多聚甲醛的BS 中固定，常規(guī)脫鈣，接著脫水透明，浸蠟包埋，制作切片，常規(guī)HE 染色后，使用電子顯微鏡在10×20的視野下觀察細胞形態(tài)病理變化。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 大鼠造模后體質(zhì)量比較

造模前，各組大鼠的體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。造模4 周后空白組大鼠體質(zhì)量為（274.1±24.1）g，造模組體質(zhì)量為（269.9±23.7）g，兩組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 大鼠造模前后牙齦對比

圖1 為實驗性牙周炎大鼠造模前后對比圖，其中圖1A 造模前大鼠牙齦未見明顯紅腫；圖1B 造模成功后大鼠牙齦可見明顯紅腫，并出現(xiàn)較深的牙周袋，食物殘渣堆積；圖1C 造模前大鼠牙周組織膠原纖維分布均勻、致密、方向較一致，邊界較完整；圖1D 造模成功后大鼠膠原纖分布不均勻、疏松，排列紊亂，并可見黑色吸收空洞；圖1E 造模前大鼠牙齦上皮結(jié)構(gòu)完整，結(jié)合上皮、溝內(nèi)上皮結(jié)構(gòu)正常；圖1F 造模后牙周組織中炎癥破壞明顯，結(jié)合上皮向根部增生。

圖1 實驗性牙周炎大鼠造模前后對比圖

2.3 各組大鼠牙槽骨吸收測定

空白組釉牙骨質(zhì)界到牙槽靖頂之間的距離未見異常，與空白組相比，模型組、對照組、實驗組大鼠釉牙骨質(zhì)界到牙槽嵴頂距離顯著增加（P＜0.05）；與模型組相比，對照組、實驗組大鼠釉牙骨質(zhì)界到牙槽嵴頂距離減少（P＜0.05）；與對照組比較，實驗組大鼠釉牙骨質(zhì)界到牙槽嵴頂距離減少（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠釉牙骨質(zhì)界到牙槽嵴頂距離（mm，）

表1 各組大鼠釉牙骨質(zhì)界到牙槽嵴頂距離（mm，）

注：與空白組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與對照組比較，cP＜0.05。

2.4 各組大鼠血清MMPs 及炎性因子水平結(jié)果

與空白組相比，模型組大鼠血清MMPs 及炎性因子（TNF-α，IL-6，IL-8）明顯升高（P＜0.05）；與模型組相比，對照組、實驗組血清MMPs 及炎性因子降低（P＜0.05）；與對照組比較，實驗組大鼠血清MMPs 及炎性因子降低（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠血清MMPs及炎性因子水平結(jié)果（ng/mL，）

表2 各組大鼠血清MMPs及炎性因子水平結(jié)果（ng/mL，）

注：與空白組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與對照組比較，cP＜0.05。

2.5 HE 染色結(jié)果

空白組牙齦組織中細胞形態(tài)正常、結(jié)構(gòu)完整，可見復(fù)層鱗狀上皮細胞，牙周膜內(nèi)膠原纖維形態(tài)結(jié)構(gòu)規(guī)整，排列有序，見圖2A。模型組牙齦組織中細胞結(jié)構(gòu)破壞，排列不齊，牙周膜內(nèi)膠原纖維變性、破壞，伴大量炎性細胞浸潤分布，并有微小膿腫形成，骨內(nèi)見大量的破骨細胞，深牙周袋形成，見圖2B。對照組（圖2C）及實驗組（圖2D）均可見細胞結(jié)構(gòu)稍完整，排列較齊，膠原纖維結(jié)構(gòu)破壞減輕，仍伴炎性細胞浸潤，破骨細胞數(shù)目減少；較對照組而言，實驗組整體病理損傷減輕。

圖2 各組大鼠牙齦組織HE染色結(jié)果（×200）：A為空白組；B為模型組；C為對照組；D為實驗組

3 討論

目前關(guān)于牙周病的病因和發(fā)病機制尚未完全闡明，研究顯示MMPs 及免疫炎性反應(yīng)與牙周病的發(fā)病密切相關(guān)，MMPs 被認(rèn)為是牙周炎過程的重要調(diào)控因子，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)過程［9］。MMPs 共有28 個成員，作為鋅和鈣依賴性細胞外蛋白水解酶中的一種分泌酶，能夠降解大部分細胞外基質(zhì)［7］。MMPs通常分成五類不同的酶（明膠酶、膠原酶、膜型MMPs、基質(zhì)蛋白酶、其他蛋白酶），研究已經(jīng)證明［10］在牙本質(zhì)中含有明膠酶（MMP-2、MMP-9），它們由成牙本質(zhì)細胞產(chǎn)生并分泌到細胞外基質(zhì)中，不僅參與牙胚時期牙本質(zhì)有機質(zhì)形成和礦化的調(diào)控，還參與牙齒增齡性變化、牙本質(zhì)修復(fù)等生理過程，并參與了某些病理過程如齲病、牙周病等的發(fā)展過程［11］。MMPs 不僅在健康牙本質(zhì)有特異性表達，在齲壞的牙本質(zhì)中也呈現(xiàn)出不同的表達狀態(tài)，甚至表現(xiàn)出更高的活性［12］。本實驗結(jié)果模型組MMPs 表達明顯升高，印證了上述結(jié)論。MMPs與牙周病損傷密切相關(guān)。究其作用途徑，其一是細菌產(chǎn)酸使口腔內(nèi)環(huán)境pH 值降低，繼而激活MMP-2和MMP-9。當(dāng)pH 值為4.5 時，其活性可提高4 倍，在一定范圍內(nèi)，其分解膠原蛋白的能力與pH 值成正比，齲壞牙齒暴露于口腔中時，唾液的緩沖作用使得MMPs 處于接近中性的環(huán)境中，MMPs 才能較大程度地促進齲病發(fā)展［13］。其二，口腔中含有膠原結(jié)合黏附素的變異鏈球菌能夠直接激活MMP-9，導(dǎo)致牙周損傷。同時，牙周局部炎癥會破壞上皮的完整性，使牙周袋內(nèi)的炎癥遞質(zhì)如白細胞介素等細胞因子從牙周袋進入血液循環(huán)系統(tǒng)和外周免疫器官，引起系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)［14］。TNF 是牙周組織破壞中重要的致炎細胞因子，從牙周炎微環(huán)境炎性細胞的遷移到組織的破壞它都參與，刺激參與趨化因子細胞遷移到感染和炎癥部位增強免疫反應(yīng)，通過上調(diào)IL-1β 和IL-6 的表達促進MMPs 的表達，從而增加破骨細胞活性和降低成骨細胞活性導(dǎo)致牙周炎組織破壞［15-16］。IL-6 是病原體刺激促炎細胞因子誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的放大因子，能夠促進淋巴B 細胞分化和促進炎癥的發(fā)生，在免疫反應(yīng)中起到促炎作用［17］。IL-8 通過激活中性粒細胞，釋放一系列的活性產(chǎn)物，最終導(dǎo)致機體局部的炎癥反應(yīng)［18］。本實驗在切片上觀察模型組損傷最明顯，實驗組和對照組均可抑制造模劑所致的牙齦損傷，且實驗組在減輕大鼠牙齦癥狀方面優(yōu)于對照組，MMPs 和炎性因子水平更低，提示復(fù)方牙痛酊通過抑制MMPs 和炎性因子釋放而發(fā)揮作用。

鹽酸米諾環(huán)素具有高效抗菌作用，且易滲透，在臨床上常采用米諾環(huán)素治療牙齦炎，該藥屬于四環(huán)素衍生物類抗生素，具有強效抑菌作用，且藥效持久，對革蘭陰性菌、放線菌等多類病原菌具有良好抑制作用，還可干擾膠原酶活性，降低牙齦組織破壞程度［19］。牙周病屬中醫(yī)“牙宣、齒槁”等病范疇，最早在《黃帝內(nèi)經(jīng)》中記載:“足少陰氣絕則骨枯……肉軟卻故齒長而垢”，描述了牙周炎牙齦萎縮、牙根外露、牙垢附著等表現(xiàn)。究其病因，或飲食偏嗜，或酒煙不節(jié)，勞傷脾胃，致內(nèi)濕蓄積，阻滯氣機，漸至壅盛，蓄久化熱，濕熱上蘊口竅致牙周炎，其治療方法當(dāng)以祛風(fēng)除濕、泄熱解毒、散瘀止痛為主［4］。復(fù)方牙痛酊中寬葉纈草祛風(fēng)除濕，行氣活血止痛；鳳仙花祛風(fēng)通絡(luò)、清熱解毒，活血止痛；紅花活血散瘀止痛；樟木清熱殺蟲，理氣通絡(luò)止痛，諸藥合用，共奏活血散瘀、消腫止痛之功效。楊家龍等［20］研究顯示復(fù)方牙痛酊對口腔常見致病菌標(biāo)準(zhǔn)株有殺菌作用，對牙齦卟啉單胞菌的抑制作用最強，臨床研究亦證實復(fù)方牙痛酊有較好的消炎、鎮(zhèn)痛效果。本研究結(jié)果顯示，復(fù)方牙痛酊治療牙周炎的綜合療效優(yōu)于鹽酸米諾環(huán)素，具有較好地治療效果。

綜上研究表明，復(fù)方牙痛酊通過抑制MMPs 和炎性因子釋放，這可能是復(fù)方牙痛酊發(fā)揮作用的機制之一。