吳雙

（樂(lè)陵市生態(tài)環(huán)境監(jiān)控中心，山東 樂(lè)陵 253600）

1 微生物快速測(cè)試板的基本原理

1.1 檢測(cè)原理

微生物快速測(cè)試板是預(yù)制的培養(yǎng)基，為一次性使用，主要成分是營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基、吸水凝膠（可溶性好）以及能反應(yīng)生物菌落顏色與特征的可觀察顯色信息[1]。快速測(cè)試板應(yīng)用較為廣泛，可以直接在自然環(huán)境中對(duì)微生物進(jìn)行檢測(cè)或鑒定，對(duì)混合的微生物也具有較好的檢測(cè)效果。

培養(yǎng)基是通過(guò)微生物新陳代謝的酶和對(duì)應(yīng)的顯色底物產(chǎn)生反應(yīng)，即顯色底物融合了產(chǎn)色基因和微生物的新陳代謝物質(zhì)，通過(guò)酶化作用顯示出顏色，以供觀察、鑒定。作為新型的培養(yǎng)基，其可以有效對(duì)微生物進(jìn)行篩選、分離，靈敏度更高、特異性更優(yōu)，而且能很快獲得檢測(cè)結(jié)果。

1.2 檢測(cè)步驟

快速檢測(cè)板使用便捷，不需要處理水樣、無(wú)需對(duì)設(shè)備消毒且無(wú)需準(zhǔn)備制作培養(yǎng)基。在檢測(cè)時(shí)，將采集的水樣靜置于無(wú)菌的器皿和環(huán)境中，將測(cè)試板放置到試驗(yàn)臺(tái)，打開(kāi)上層膜，吸取1 毫升的水樣，滴落到測(cè)試板紙片上，再將上層膜蓋好，靜候10 秒以上，待培養(yǎng)基凝固的同時(shí)，做一片空白陰性實(shí)驗(yàn)比對(duì)。將測(cè)試板整理疊加好，放置到密封袋中，做好封口處理，再放置到（透明部分向上）保持恒溫的培養(yǎng)箱中，根據(jù)需檢測(cè)的項(xiàng)目要求，調(diào)節(jié)溫濕度做好培養(yǎng)，最后按照測(cè)試板顯示的顏色、菌落情況對(duì)比分析，以獲得水樣檢測(cè)數(shù)據(jù)。如果水樣中菌落含量較少，可以直接測(cè)試原液，以提高檢測(cè)的準(zhǔn)確度。[2]

2 微生物快速測(cè)試板的具體應(yīng)用

2.1 菌落總數(shù)檢測(cè)

菌落總數(shù)是關(guān)系居民飲用水安全的重要指標(biāo)，也是飲用水監(jiān)測(cè)最常用的指標(biāo)。通常使用平皿計(jì)數(shù)法檢測(cè)菌落總數(shù)，采集的水樣使用營(yíng)養(yǎng)瓊脂在37℃有氧環(huán)境下培養(yǎng)48 小時(shí)，取1 毫升水樣，肉眼直接觀測(cè)菌落總數(shù)。菌落總數(shù)測(cè)試板檢測(cè)原理與國(guó)標(biāo)法相同，吸取1mL 水樣，在測(cè)試板上提前涂刷營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，添加TTC 溶劑，培養(yǎng)24 小時(shí)，菌落呈現(xiàn)紅色，該檢測(cè)方法可以有效節(jié)約計(jì)數(shù)時(shí)間、提升計(jì)數(shù)效果。

2.2 總大腸菌群檢測(cè)

大腸菌群是食品衛(wèi)生安全檢驗(yàn)的重要指標(biāo)，主要存在于人類和動(dòng)物糞便等有污染的場(chǎng)所，具有較強(qiáng)的傳染性。大腸菌群指標(biāo)高，則意味著食品和食品加工時(shí)受到污染程度高。總大腸菌群是在37℃環(huán)境下培養(yǎng)24 小時(shí)，能夠發(fā)酵產(chǎn)生乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性的無(wú)芽孢桿菌。[3]在居民飲用水安全檢測(cè)中，檢測(cè)總大腸菌群可以采用多管發(fā)酵法、濾膜法和酶底物法等三種方式，其中，供水行業(yè)中較為常用的兩種檢測(cè)方式分別為濾膜法、大腸菌群測(cè)試板（基于酶底物法原理），這兩種檢測(cè)方式有一定的區(qū)別與聯(lián)系，具體如下：

2.2.1 濾膜法

將水樣通過(guò)0.45 微米孔徑的微孔濾膜過(guò)濾后，再將含有菌群的濾膜貼在已含有乳糖的培養(yǎng)基上，在37℃環(huán)境下培養(yǎng)24 小時(shí)，即可以形成有一定特征性菌落的革蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌。這種檢測(cè)方式較為簡(jiǎn)單，但檢測(cè)結(jié)果比較復(fù)雜，對(duì)這些特征性菌落還要進(jìn)一步進(jìn)行染色、鏡檢，再對(duì)呈現(xiàn)陰性的染色菌接種LPB 培養(yǎng)液，繼續(xù)在37℃環(huán)境下培養(yǎng)24 小時(shí)，直到出現(xiàn)產(chǎn)酸產(chǎn)氣，這時(shí)可以判斷總大腸菌群為陽(yáng)性。

2.2.2 大腸菌群測(cè)試板

其主要成分是選擇性培養(yǎng)基、腸菌群特異性顯色指示劑和吸水凝膠，檢測(cè)技術(shù)專業(yè)、速度較快，將以前的幾步檢測(cè)變成一步檢測(cè)，將3 天的檢測(cè)時(shí)間減少至24 小時(shí)，同時(shí)還減去提前制作培養(yǎng)基、清洗器材器皿的費(fèi)時(shí)環(huán)節(jié)，在自來(lái)水的安全檢測(cè)中有著較好的適用性。具體檢測(cè)步驟為：首先，檢測(cè)時(shí)將制備好的飲用水樣品加入無(wú)菌稀釋液，按照1～2 個(gè)稀釋度進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)于飲用純凈水或礦泉水等含菌量較低的水樣樣品，可直接吸收水樣原液進(jìn)行檢測(cè)。其次，將大腸菌群測(cè)試板放置于平整的實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，輕輕揭開(kāi)上層薄膜，用無(wú)菌吸管吸取均勻混合的水樣樣品約1mL，然后垂直滴至測(cè)試板中央，然后緩慢將上層膜蓋好，覆蓋時(shí)應(yīng)防止產(chǎn)生氣泡。然后，使用平面壓板在上層膜中央輕輕壓下，使樣品液體均勻覆蓋在圓形測(cè)試版的培養(yǎng)面積上，切忌覆蓋時(shí)不得扭轉(zhuǎn)壓板，靜置至少1min 至培養(yǎng)基凝固。最后，將大腸菌群測(cè)試板的透明面朝上，放置于36℃±1℃恒溫的培養(yǎng)箱中，堆疊放置片數(shù)應(yīng)≤20 片，培養(yǎng)24±2h。培養(yǎng)完成后觀察測(cè)試板顏色，大腸菌群呈紅色（如圖1），可通過(guò)目視、放大鏡或菌落計(jì)數(shù)器判斷大腸菌群的污染情況。

圖1 大腸菌群測(cè)試板圖樣

2.3 耐熱大腸菌群檢測(cè)

耐熱大腸菌群，顧名思義，就是具有一定的抗熱性。一般大腸菌群在超過(guò)44.5℃時(shí)就不能繼續(xù)生長(zhǎng)，但耐熱大腸菌群則是不然。在居民飲用水檢測(cè)中，耐熱大腸菌群檢測(cè)可采用下列方式：

2.3.1 濾膜法

耐熱大腸菌群濾膜法和上文的總大腸菌群濾膜法一樣，將水樣通過(guò)0.45 微米孔徑的微孔濾膜過(guò)濾后，將菌群阻留到濾膜上，再將濾膜貼在已含有乳糖的培養(yǎng)基上，在44.5℃環(huán)境下培養(yǎng)24 小時(shí)，就能形成一定的特征性菌落。選擇MFC 作為耐熱大腸菌群的培養(yǎng)基，耐熱菌群的菌落呈現(xiàn)藍(lán)色，不耐熱菌群的菌落呈現(xiàn)灰白或奶油色。在檢測(cè)中，有時(shí)因顏色特征性不明顯，可能會(huì)出現(xiàn)結(jié)果偏差，如假陽(yáng)性。這時(shí)還需要對(duì)可疑的菌落采用EC 培養(yǎng)基二次培養(yǎng)，如果出現(xiàn)氣體則為耐熱大腸菌群。

2.3.2 耐熱大腸菌群測(cè)試板

其主要成分是一定量的乳糖、溴甲酚紫和TTC 指示劑以及其他營(yíng)養(yǎng)成分，共同吸附在無(wú)菌濾紙上。當(dāng)具備一定的條件，細(xì)菌能迅速生長(zhǎng)和繁殖后，會(huì)產(chǎn)生一定的酸度，使pH 值降低，溴甲酚紫就會(huì)由紫變黃。在產(chǎn)氣過(guò)程中，還有一定的脫氫酶會(huì)催化底物還原TTC，進(jìn)而產(chǎn)生難溶的TTF，在黃色背景下，會(huì)呈現(xiàn)紅色點(diǎn)狀或者塊狀現(xiàn)象。觀察指示劑的顏色，就可以判斷耐熱大腸菌群是否產(chǎn)酸產(chǎn)氣，進(jìn)而確定其存在的情況，根據(jù)菌落分布，可以確定其特性和數(shù)量。

2.4 大腸埃希氏菌檢測(cè)

大腸埃希氏菌通常是指大腸桿菌，其是一種較為常見(jiàn)的菌體，具有一定的傳染性、病原性，在一定環(huán)境下，對(duì)人類、動(dòng)物的腸胃等消化器官、尿道等泌尿系統(tǒng)造成感染，對(duì)嬰幼兒和幼年的家禽、牲畜影響更為直接，常常導(dǎo)致腹瀉、敗血癥，嚴(yán)重時(shí)會(huì)危及生命安全[4]。根據(jù)要求，當(dāng)居民飲用水中檢測(cè)出總大腸菌群后，要深入檢測(cè)耐熱大腸菌群和大腸埃希氏菌，如沒(méi)有檢測(cè)出大腸埃希氏菌，則不需要做進(jìn)一步檢測(cè)。大腸埃希氏菌檢測(cè)方式有：

2.4.1 濾膜法

在無(wú)菌的環(huán)境下，將檢測(cè)出總大腸菌群呈陽(yáng)性的菌落樣本由濾膜轉(zhuǎn)到NA-MUC 培養(yǎng)基板上，細(xì)菌面向上，在36℃環(huán)境下培養(yǎng)4 小時(shí)，再使用366 納米波長(zhǎng)、6 瓦功率的紫外線直接照射樣本，如果菌落邊緣、背部呈現(xiàn)藍(lán)光物質(zhì)，則表示水樣中有大腸桿菌（如圖2所示）。

圖2 大腸埃希氏菌檢測(cè)

2.4.2 大腸埃希氏菌測(cè)試板

大腸埃希氏菌能產(chǎn)生β-半乳糖苷酶和β-葡萄糖醛酸酶，其中β-半乳糖苷酶在培養(yǎng)基中，能催化底物，釋放一定的色原體；β-葡萄糖醛酸酶在培養(yǎng)基中，能分解底物，釋放一定的熒光物，兩者經(jīng)過(guò)44.5℃培養(yǎng)后，能使培養(yǎng)基的顏色出現(xiàn)變化，在紫外線燈照射下，菌落呈現(xiàn)熒光特征。通過(guò)這種方式，可以很快檢測(cè)出大腸埃希氏菌是否存在。其中，大腸埃希氏菌呈藍(lán)色，耐熱大腸菌群呈紫紅色或藍(lán)色菌斑（如圖3）。

圖3 大腸埃希氏菌耐熱大腸菌群測(cè)試板

3 效果對(duì)比

3.1 檢測(cè)結(jié)果

在實(shí)驗(yàn)室中，對(duì)居民飲用水的500 份水樣，隨機(jī)抽取30 份水樣，對(duì)菌落總數(shù)、總大腸菌群、耐熱大腸菌群、大腸桿菌這四類指標(biāo)，分別采用國(guó)標(biāo)法和測(cè)試板兩種方式進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)比有關(guān)試驗(yàn)數(shù)據(jù)。其中，采用測(cè)試板方式檢測(cè)的水樣，都進(jìn)行了5 次平行試驗(yàn)。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，兩種檢測(cè)方式中陰性結(jié)果完全一致；測(cè)試板方式的陽(yáng)性結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差很小，不超過(guò)1%。取5 次平行試驗(yàn)結(jié)果的平均值和國(guó)標(biāo)法試驗(yàn)結(jié)果的平行雙樣值進(jìn)行對(duì)比分析，結(jié)果都不超過(guò)2.5%，計(jì)算公式如下：

式中：η 為相對(duì)偏差；X1為測(cè)試板方法的5 次平行試驗(yàn)結(jié)果的平均值；X2為國(guó)標(biāo)方法試驗(yàn)結(jié)果[5-6]。

3.2 檢測(cè)成本

對(duì)居民飲用水微生物檢測(cè)采用國(guó)標(biāo)法方式，其耗材不多、較為低廉，成本主要包括培養(yǎng)基、濾膜和其他輔助性能的藥品，在每份水樣測(cè)試時(shí)，四個(gè)微生物指標(biāo)耗費(fèi)約5～10 元。而采用快速測(cè)試板方式，因其是一次性消耗產(chǎn)品，不能回收利用，在每份水樣測(cè)試時(shí)，四個(gè)微生物指標(biāo)耗費(fèi)25～40 元。因此，相比國(guó)標(biāo)法，快速測(cè)試板的成本較高。[7]

3.3 檢測(cè)效率

快速測(cè)試板使用非常簡(jiǎn)單，程序不復(fù)雜，準(zhǔn)確度較高，測(cè)試較為靈敏，對(duì)操作人員專業(yè)要求不高。在檢測(cè)時(shí)不用增加菌量，可以隨時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，甚至可以在普通環(huán)境下直接測(cè)試，并且能夠直接反映樣品的污染情況、具體程度。在幾組對(duì)比測(cè)試中，測(cè)試板的效率比國(guó)標(biāo)法效率高一倍以上。[8]

綜合以上對(duì)比分析，在對(duì)成本關(guān)注不高時(shí)，可多應(yīng)用快速測(cè)試板開(kāi)展相應(yīng)檢測(cè)。

4 結(jié)語(yǔ)

水乃生命之源，故居民飲用水的安全檢測(cè)至關(guān)重要。經(jīng)大量實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證與實(shí)際應(yīng)用檢驗(yàn)，微生物快速測(cè)試板能夠有效改善傳統(tǒng)檢測(cè)方式的不足與弊端、優(yōu)化檢測(cè)程序、節(jié)約檢測(cè)時(shí)間，還可提高檢測(cè)的有效性與精準(zhǔn)性，特別適用于檢測(cè)水樣較多、專業(yè)檢測(cè)人員不足的情況。因此，快速測(cè)試板必將在居民飲用水的微生物檢測(cè)中得到愈發(fā)廣泛的實(shí)踐應(yīng)用。