牛艷桃 張麗 謝文芳

山西省人民醫(yī)院眼科，太原030012

白內(nèi)障是臨床常見(jiàn)致盲眼病，以晶狀體進(jìn)行性混濁為主要特征，是導(dǎo)致老年人視力降低及盲的主要原因。動(dòng)物模型及體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)均證實(shí)，氧化應(yīng)激與白內(nèi)障發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。晶狀體上皮細(xì)胞(lens epithelial cells，LECs)凋亡是白內(nèi)障發(fā)生的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)，氧化應(yīng)激狀態(tài)下細(xì)胞代謝產(chǎn)生的活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)異常積累，誘發(fā)LECs凋亡，導(dǎo)致晶狀體混濁。目前白內(nèi)障主要通過(guò)手術(shù)進(jìn)行治療，尚缺乏預(yù)防或延緩白內(nèi)障進(jìn)展的有效手段。因此，尋找安全、有效的干預(yù)手段延緩白內(nèi)障進(jìn)展具有重要意義。微小RNA(microRNA，miRNA)能特異性調(diào)控靶基因，在眼部組織生長(zhǎng)、功能維持及蛋白表達(dá)方面具有重要調(diào)控作用。miR-155是一種多功能miRNA，在炎癥、腫瘤及免疫過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。既往研究顯示，miR-155參與視網(wǎng)膜變性、葡萄膜炎等多種眼部疾病的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程。抑制miR-155的表達(dá)可減輕腦缺血后海馬炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激損傷，改善神經(jīng)功能。但miR-155在LECs氧化應(yīng)激損傷中的作用尚不清楚。本研究擬探討miR-155在過(guò)氧化氫(hydrogen peroxide，HO)誘導(dǎo)人LECs HLE-B3氧化應(yīng)激損傷中的作用及其可能的機(jī)制，為臨床治療白內(nèi)障提供一定實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1

細(xì)胞來(lái)源 HLE-B3細(xì)胞株購(gòu)于美國(guó)ATCC公司。

1.1.2

主要試劑及儀器 體積分?jǐn)?shù)30% HO(10011218)(上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；miR-155擬似物(miR-155 mimics)及其對(duì)照(miR-155 mimics-NC)、miR-155抑制劑(miR-155 inhibitor)及其對(duì)照(miR-155 inhibitor-NC)(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)；二氯二氫熒光素-乙酰乙酸酯(2'，7'-dichlorofluorescein diacetate，DCFH-DA)ROS熒光探針(CA1410)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒(BC0170)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)ELISA試劑盒(BC0025)(北京索萊寶科技有限公司)；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒(GM-040502A，美國(guó)Genomeditech公司)；兔抗人沉默信息調(diào)節(jié)因子相關(guān)酶1(silment information regulator factor related enzymes 1，SIRT1)單抗(sc-74465，美國(guó)SantaCruz公司)；兔抗人B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2基因(B-cell lymphoma/leukemia-2 gene，bcl-2)單抗(ab32124)、bcl-2相關(guān)X蛋白(bcl-2 assaciated X protein，bax)單抗(ab104156)、活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cleaved-cysteine aspartase 3，cleaved-Caspase-3)多抗(ab2302)、αA晶狀體蛋白多抗(ab4632)、HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗(ab150077)(英國(guó)Abcam公司)。IX53倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司)；流式細(xì)胞儀(美國(guó)FALS CALIBAR BD公司)；ABI7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)(美國(guó)ABI公司)；電泳儀(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1

細(xì)胞復(fù)蘇、培養(yǎng)及鑒定 將液氮中凍存的HLE-B3細(xì)胞取出，37 ℃水浴解凍，離心半徑8 cm，1 000 r/min離心5 min，棄上清，重懸細(xì)胞，加入含有體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，于體積分?jǐn)?shù)5% CO培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)，待細(xì)胞融合達(dá)80%～90%時(shí)進(jìn)行傳代，2～3 d傳代1次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。取傳代后的細(xì)胞，提取總蛋白，BCA法蛋白定量，蛋白變性后上樣進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育αA晶狀體蛋白一抗(1∶ 1 000)、二抗(1∶ 5 000)，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(enhanced chemiluminescence，ECL)顯影，檢測(cè)αA晶狀體蛋白表達(dá)以鑒定LECs。

1.2.2

MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HLE-B3細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×10個(gè)/ml，接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后，分別加入不同濃度(50、100、200、400、800 μmol/L)的HO，培養(yǎng)24 h，每孔加入20 μl MTT(5%)溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，加入DMSO 150 μl/孔，充分振蕩10 min，使用酶標(biāo)儀在490 nm處檢測(cè)各孔吸光度(

A

)值，另設(shè)不含HO的空白組，計(jì)算細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率=不同濃度HO組

A

值/空白組

A

值×100%。根據(jù)細(xì)胞存活率篩選出最適HO濃度。每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。

1.2.3

細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)整濃度為1×10個(gè)/ml，接種于6孔板，將細(xì)胞分為6個(gè)組，其中空白對(duì)照組細(xì)胞不作處理，模型對(duì)照組細(xì)胞于100 μmol/L HO條件下培養(yǎng)，miR-155擬似物組、miR-155擬似物對(duì)照組、miR-155抑制劑組、miR-155抑制劑對(duì)照組細(xì)胞分別進(jìn)行相應(yīng)轉(zhuǎn)染后于100 μmol/L HO條件下培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染步驟為:分別將1 μg miR-155擬似物、miR-155擬似物對(duì)照、miR-155抑制劑或miR-155抑制劑對(duì)照與50 μl Opti-MEM混合；將2.5 μl Lipofectamine2000與50 μl Opti-MEM混合；再將2種混合物充分混合，室溫孵育20 min，加至6孔板中，轉(zhuǎn)染24 h后，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化并拍照。

1.2.4

實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)細(xì)胞中miR-155和SIRT1 mRNA相對(duì)表達(dá)量 收集各組細(xì)胞，Trizol法提取細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度和純度，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。PCR反應(yīng)體系：cDNA 2.0 μl，正向、反向引物各0.5 μl，SYBR Select Master Mix 10 μl，加ddHO至總體積20.0 μl。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火20 s，70 ℃延伸5 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。miR-155正向引物序列為5'-AGCTAGCTAGCG ATCGCAG-3'，反向?yàn)?'-CGTAGCATCGATCGATATG-3'；U6正向引物序列為5'-ACGATCGATGCGATATGCATC G-3'，反向?yàn)?'-AAGCTAGCGCTACGACGTAGCG-3'；SIRT1正向引物序列為5'-ATCTATCGAGCTCGGATCG AC-3'，反向?yàn)?'-AGGCAGCAGCTGCAGATCGAT-3'；β-actin正向引物序列為5'-AAGCTAGCGATTATAG CTAGA-3'，反向?yàn)?'-ATCGATGCTAGGCAAGATTA-3'。引物序列由上海生工生物工程有限公司合成。miR-155以U6為內(nèi)參，SIRT1以β-actin為內(nèi)參，采用2法計(jì)算miR-155和SIRT1 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 取各組細(xì)胞，以1×10個(gè)/ml密度接種至6孔板，培養(yǎng)24 h，每孔加入500 μl質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%胰蛋白酶消化3 min，離心半徑8 cm，1 500 r/min離心10 min，棄上清，加入500 μl結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，加入5 μl Annexin和PI染色液，避光4 ℃染色15 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，計(jì)算凋亡率。細(xì)胞凋亡率(%)=凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。

1.2.6

DCFH-DA熒光探針?lè)z測(cè)細(xì)胞ROS含量 各組細(xì)胞于6孔板培養(yǎng)24 h，每孔加入200 μl DCFH-DA，培養(yǎng)箱中靜置30 min，使探針和細(xì)胞充分混勻，磷酸鹽緩沖液洗滌，收集各組細(xì)胞，酶標(biāo)儀檢測(cè)

A

值(激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm、發(fā)射波長(zhǎng)為525 nm)；倒置熒光顯微鏡下觀察二氯熒光素(dichlorofluorescein，DCF)熒光強(qiáng)度并拍照，熒光越強(qiáng)代表ROS含量越高。每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。

1.2.7

ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液SOD活性和MDA濃度 各組細(xì)胞于6孔板培養(yǎng)24 h，離心半徑8 cm，1 000 r/min離心5 min，收集上清，參照試劑盒說(shuō)明書步驟，加入SOD、MDA抗體及酶標(biāo)抗體，洗滌后加入底物顯色液避光染色10 min，終止反應(yīng)后，使用酶標(biāo)儀于450 nm處測(cè)量

A

值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中SOD活性和MDA濃度。每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。

1.2.8

雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)miR-155靶基因表達(dá) 采用PicTar以及TargetScan生物信息軟件預(yù)測(cè)分析miR-155與SIRT1序列之間結(jié)合位點(diǎn)，以SIRT1的3'非翻譯區(qū)(untranslated region，UTR)插入雙熒光素酶報(bào)告基因psiCHECK2中，構(gòu)建野生型(wild type，WT)psiCHECK2-SIRT1 WT和突變型(mutant type，MUT)psiCHECK2-SIRT1 MUT重組質(zhì)粒，分別將miR-155擬似物、miR-155擬似物對(duì)照、miR-155抑制劑及miR-155抑制劑對(duì)照與psiCHECK2-SIRT1 WT、psiCHECK2-SIRT1 MUT共轉(zhuǎn)染至HLE-B3細(xì)胞，檢測(cè)相對(duì)熒光素酶活性，以螢火蟲熒光素酶活性與內(nèi)參海腎熒光素酶活性的比值表示。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.9

Western blot法檢測(cè)細(xì)胞SIRT1、bcl-2、bax、cleaved-Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量 取各組細(xì)胞，加入RIPA裂解液裂解細(xì)胞，提取總蛋白，BCA法對(duì)蛋白進(jìn)行定量，100 ℃水浴變性，蛋白上樣進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳完畢后，將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜，質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%脫脂奶粉室溫條件下封閉2 h，加入SIRT1、bcl-2、bax、cleaved-Caspase-3及β-actin一抗(均1∶ 800稀釋)，4 ℃孵育過(guò)夜，TBST溶液洗膜，加入HRP標(biāo)記的相應(yīng)二抗(1∶ 2 000稀釋)，室溫孵育2 h，TBST溶液洗膜，加入ECL溶液，顯影、定影，采用ImageJ軟件分析蛋白條帶灰度值，以目的蛋白與內(nèi)參β-actin灰度比值表示目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。本研究中計(jì)量資料經(jīng)Shapiro-Wilk檢驗(yàn)證實(shí)符合正態(tài)分布，以表示，采用Levene進(jìn)行組間方差齊性檢驗(yàn)。采用均衡分組單因素干預(yù)多水平研究設(shè)計(jì)，空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、miR-155擬似物組、miR-155擬似物對(duì)照組、miR-155抑制劑組、miR-155抑制劑對(duì)照組組間各測(cè)量值差異比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD-

t

檢驗(yàn)。miR-155擬似物對(duì)照組與miR-155擬似物組、miR-155抑制劑對(duì)照組與miR-155抑制劑組相對(duì)熒光素酶活性比較均采用獨(dú)立樣本

t

檢驗(yàn)。

P

<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LECs的鑒定

培養(yǎng)的HLE-B3細(xì)胞高表達(dá)αA晶狀體蛋白(圖1)。

圖1 HLE-B3細(xì)胞中αA晶狀體蛋白表達(dá) 可見(jiàn)細(xì)胞中αA晶狀體蛋白高表達(dá) M：蛋白分子標(biāo)記Figure 1 Expression of αA-crystallin in HLE-B3 cells αA-crystallin was highly expressed in cells M:protein marker

2.2 不同濃度H2O2干預(yù)后細(xì)胞存活率比較

MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，不同濃度HO處理細(xì)胞存活率總體比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=289.475，

P

<0.05)。隨著HO濃度增加，細(xì)胞存活率逐漸降低，各不同濃度間細(xì)胞存活率比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均

P

<0.05)(表1)，其中100 μmol/L的HO處理細(xì)胞存活率接近50%，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)選取HO的濃度為100 μmol/L。

2.3 各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化比較

倒置顯微鏡下觀察結(jié)果顯示，空白對(duì)照組細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形或不規(guī)則橢圓形，貼壁生長(zhǎng)良好；模型對(duì)照組細(xì)胞數(shù)量減少，死亡細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)基中，呈圓形，存活細(xì)胞部分形態(tài)發(fā)生改變，細(xì)胞邊界模糊不清；miR-155擬似物組細(xì)胞數(shù)量少于模型對(duì)照組，細(xì)胞固有形態(tài)發(fā)生改變；miR-155抑制劑組細(xì)胞數(shù)量多于模型對(duì)照組，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，但仍可見(jiàn)少量死亡細(xì)胞；miR-155擬似物對(duì)照組和miR-155抑制劑對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)與模型對(duì)照組相似(圖2)。

圖2 各組細(xì)胞形態(tài)變化(×200，標(biāo)尺=100 μm) 空白對(duì)照組可見(jiàn)細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形或不規(guī)則橢圓形，貼壁生長(zhǎng)良好;模型對(duì)照組可見(jiàn)細(xì)胞數(shù)量減少，部分存活細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，邊界模糊不清;miR-155擬似物組可見(jiàn)細(xì)胞數(shù)量較模型對(duì)照組少，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變;miR-155抑制劑組可見(jiàn)中等數(shù)量細(xì)胞及少量死亡細(xì)胞;miR-155擬似物對(duì)照組和miR-155抑制劑對(duì)照組可見(jiàn)細(xì)胞形態(tài)與模型對(duì)照組相似 白箭頭示死亡細(xì)胞，黑箭頭示變形細(xì)胞 A：空白對(duì)照組 B：模型對(duì)照組 C:miR-155擬似物對(duì)照組 D：miR-155擬似物組 E：miR-155抑制劑對(duì)照組 F：miR-155抑制劑組 miR：微小RNAFigure 2 Cell morphology changes in various groups(×200,bar=100 μm) In blank control group,the cells showed long fusiform or irregular elliptical shape,and they grew well adherently.In model control group,the number of cells was reduced,and some surviving cells were deformed with unclear boundary.Fewer cells were seen in miR-155 mimics group compared with model control group and they were deformed.Medium number of cells and a few dead cells were seen in miR-155 inhibitor group.Cell morphology in miR-155 mimics negative control group and miR-155 inhibitor negative control group was similar to model control group White arrows indicated dead cells,and black arrows showed deformed cells A:blank control group B:model control group C:miR-155 mimics negative control group D:miR-155 mimics group E:miR-155 inhibitor negative control group F:miR-155 inhibitor group miR:microRNA

表1 不同濃度H2O2細(xì)胞存活率比較(x±s,%)Table 1 Comparison of cell survival rate at different concentrations of H2O2 (x±s,%)H2O2濃度樣本量細(xì)胞存活率0 μmol/L5100.00±1.0050 μmol/L566.15±3.56a100 μmol/L555.38±3.15ab200 μmol/L541.54±2.95abc400 μmol/L527.69±2.58abcd800 μmol/L520.00±2.37abcdeF值289.475P值<0.001 注:與0 μmol/L H2O2比較,aP<0.05;與50 μmol/L H2O2比較,bP<0.05;與100 μmol/L H2O2比較,cP<0.05;與200 μmol/L H2O2比較,dP<0.05;與400 μmol/L H2O2比較,eP<0.05(單因素方差分析,LSD-t檢驗(yàn)) H2O2:過(guò)氧化氫 Note:Compared with 0 μmol/L H2O2,aP<0.05;compared with 50 μmol/L H2O2,bP<0.05;compared with 100 μmol/L H2O2,cP<0.05;compared with 200 μmol/L H2O2,dP<0.05;compared with 400 μmol/L H2O2,eP<0.05 (One-way ANOVA,LSD-t test) H2O2:hy-drogen peroxide

2.4 各組細(xì)胞miR-155和SIRT1 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、miR-155擬似物組、miR-155抑制劑組、miR-155擬似物對(duì)照組和miR-155抑制劑對(duì)照組細(xì)胞miR-155和SIRT1 mRNA相對(duì)表達(dá)量總體比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=386.952、356.158，均

P

<0.001)，其中與空白對(duì)照組相比，模型對(duì)照組、miR-155擬似物組、miR-155擬似物對(duì)照組、miR-155抑制劑對(duì)照組細(xì)胞miR-155 mRNA相對(duì)表達(dá)量升高，SIRT1 mRNA相對(duì)表達(dá)量表達(dá)降低，miR-155抑制劑組細(xì)胞miR-155和SIRT1 mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均

P

<0.05)；與模型對(duì)照組和miR-155擬似物對(duì)照組比較，miR-155擬似物組細(xì)胞miR-155 mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯升高，SIRT1 mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均

P

<0.05)；與模型對(duì)照組、miR-155抑制劑對(duì)照組和miR-155擬似物組比較，miR-155抑制劑組細(xì)胞miR-155 mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯降低，SIRT1 mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均

P

<0.05)；模型對(duì)照組、miR-155擬似物對(duì)照組和miR-155抑制劑對(duì)照組間細(xì)胞miR-155和SIRT1 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均

P

>0.05)(表2)。

2.5 各組細(xì)胞凋亡率比較

空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、miR-155擬似物組、miR-155擬似物對(duì)照組、miR-155抑制劑組和miR-155抑制劑對(duì)照組細(xì)胞凋亡率總體比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=263.158，

P

<0.001)，其中與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組、miR-155擬似物對(duì)照組、miR-155擬似物組、miR-155抑制劑對(duì)照組、miR-155抑制劑組細(xì)胞凋亡率均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均

P

<0.05)；與模型對(duì)照組和miR-155擬似物對(duì)照組比較，miR-155擬似物組細(xì)胞凋亡率升高(

P

<0.05)；與模型對(duì)照組、miR-155抑制劑對(duì)照組和miR-155擬似物組比較，miR-155抑制劑組細(xì)胞凋亡率降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均

P

<0.05)。模型對(duì)照組、miR-155擬似物對(duì)照組及miR-155抑制劑對(duì)照組間細(xì)胞凋亡率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均

P

>0.05)(圖3，表3)。

圖3 各組流式細(xì)胞分析圖 A：空白對(duì)照組 B：模型對(duì)照組 C：miR-155擬似物對(duì)照組 D：miR-155擬似物組 E：miR-155抑制劑對(duì)照組 F：miR-155抑制劑組 PI：碘化丙啶；FITC：異硫氰酸熒光素Figure 3 Flow cytometry analysis of cells in various groups A:blank control group B:model control group C:miR-155 mimics negative control group D:miR-155 mimics group E:miR-155 inhibitor negative control group F:miR-155 inhibitor group PI:propidium iodide;FITC:fluorescein isothiocyanate

表3 各組細(xì)胞凋亡率比較(x±s,%)Table 3 Comparison of cell apoptosis rate among various groups (x±s,%)組別樣本量凋亡率空白對(duì)照組53.16±1.01模型對(duì)照組521.57±1.47amiR-155擬似物對(duì)照組523.35±1.65amiR-155擬似物組534.57±2.02abcmiR-155抑制劑對(duì)照組521.96±1.58amiR-155抑制劑組511.84±1.24abdeF值263.158P值<0.001 注:與空白對(duì)照組比較,aP<0.05;與模型對(duì)照組比較,bP<0.05;與miR-155擬似物對(duì)照組比較,cP<0.05;與miR-155擬似物組比較,dP<0.05;與miR-155抑制劑對(duì)照組比較,eP<0.05(單因素方差分析,LSD-t檢驗(yàn)) miR:微小RNA Note:Compared with blank control group,aP<0.05;compared with model control group,bP<0.05;compared with miR-155 mimics nega-tive control group,cP<0.05;compared with miR-155 mimics group,dP<0.05;compared with miR-155 inhibitor negative control group,eP<0.05 (One-way ANOVA,LSD-t test) miR:microRNA

表2 各組細(xì)胞miR-155、SIRT1 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較(x±s)Table 2 Comparison of the relative expression levels of miR-155 and SIRT1 mRNA among various groups (x±s)組別樣本量miR-155SIRT1 mRNA空白對(duì)照組51.00±0.111.00±0.10模型對(duì)照組51.66±0.13a0.65±0.07amiR-155擬似物對(duì)照組51.63±0.12a0.61±0.08amiR-155擬似物組52.75±0.15abc0.43±0.06abcmiR-155抑制劑對(duì)照組51.65±0.14a0.66±0.07amiR-155抑制劑組50.61±0.07abde0.84±0.08abdeF值386.952356.158P值<0.001<0.001 注:與空白對(duì)照組比較,aP<0.05;與模型對(duì)照組比較,bP<0.05;與miR-155擬似物對(duì)照組比較,cP<0.05;與miR-155擬似物組比較,dP<0.05;與miR-155抑制劑對(duì)照組比較,eP<0.05(單因素方差分析,LSD-t檢驗(yàn)) miR:微小RNA;SIRT1:沉默信息調(diào)節(jié)因子相關(guān)酶1 Note:Compared with blank control group,aP<0.05;compared with model control group,bP<0.05;compared with miR-155 mimics nega-tive control group,cP<0.05;compared with miR-155 mimics group,dP<0.05;compared with miR-155 inhibitor negative control group,eP<0.05 (One-way ANOVA,LSD-t test) miR:microRNA;SIRT1:silent information regulator factor related enzymes 1

2.6 各組細(xì)胞ROS含量比較

倒置顯微鏡下觀察結(jié)果顯示，空白對(duì)照組DCF熒光較弱；模型對(duì)照組可見(jiàn)強(qiáng)DCF熒光；miR-155擬似物組DCF熒光較模型對(duì)照組明顯增強(qiáng)；miR-155抑制劑組DCF熒光較模型對(duì)照組和miR-155擬似物組明顯減弱；miR-155擬似物對(duì)照組和miR-155抑制劑對(duì)照組ROS含量與模型對(duì)照組相似(圖4)?？瞻讓?duì)照組、模型對(duì)照組、miR-155擬似物組、miR-155擬似物對(duì)照組、miR-155抑制劑組和miR-155抑制劑對(duì)照組細(xì)胞ROS含量總體比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=163.236，

P

<0.001)。與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組、miR-155擬似物組、miR-155擬似物對(duì)照組、miR-155抑制劑組和miR-155抑制劑對(duì)照組細(xì)胞ROS含量均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均

P

<0.05)；與模型對(duì)照組和miR-155擬似物對(duì)照組比較，miR-155擬似物組細(xì)胞ROS含量升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均

P

<0.05)；與模型對(duì)照組、miR-155抑制劑對(duì)照組和miR-155擬似物組比較，miR-155抑制劑組細(xì)胞ROS含量降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均

P

<0.05)。模型對(duì)照組、miR-155擬似物對(duì)照組及miR-155抑制劑對(duì)照組間細(xì)胞ROS含量比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均

P

>0.05)(表4)。

2.7 各組細(xì)胞SOD活性和MDA濃度比較

空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、miR-155擬似物組、miR-155擬似物對(duì)照組、miR-155抑制劑組、miR-155抑制劑對(duì)照組細(xì)胞SOD活性和MDA濃度總體比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=62.361、73.325，均

P

<0.001)，其中與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組、miR-155擬似物組、miR-155擬似物對(duì)照組、miR-155抑制劑組、miR-155抑制劑對(duì)照組細(xì)胞SOD活性均降低，MDA濃度均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均

P

<0.05)；與模型對(duì)照組和miR-155擬似物對(duì)照組比較，miR-155擬似物組細(xì)胞SOD活性降低，MDA濃度升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均

P

<0.05)；與模型對(duì)照組、miR-155抑制劑對(duì)照組和miR-155擬似物組比較，miR-155抑制劑組細(xì)胞SOD活性升高，MDA濃度降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均

P

<0.05)。模型對(duì)照組、miR-155擬似物對(duì)照組及miR-155抑制劑對(duì)照組間細(xì)胞SOD活性和MDA濃度比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均

P

>0.05)(表5)。

圖4 各組細(xì)胞ROS熒光圖(×200，標(biāo)尺=100 μm) 空白對(duì)照組細(xì)胞熒光強(qiáng)度較弱，模型對(duì)照組細(xì)胞熒光增強(qiáng)，miR-155擬似物對(duì)照組和miR-155抑制劑對(duì)照組熒光強(qiáng)度與模型對(duì)照組相似，miR-155擬似物組熒光強(qiáng)度較模型對(duì)照組增強(qiáng)，miR-155抑制劑組熒光強(qiáng)度較模型對(duì)照組和miR-155擬似物組減弱 A：空白對(duì)照組 B：模型對(duì)照組 C:miR-155擬似物對(duì)照組 D：miR-155擬似物組 E：miR-155抑制劑對(duì)照組 F：miR-155抑制劑組Figure 4 ROS fluorescence image of cells in various groups (×200,bar=100 μm) Fluorescence intensity of cells in blank control group was weak;fluorescence intensity of cells in model control group was increased;fluorescence intensity of cells in miR-155 mimics negative control group and miR-155 inhibitor negative control group was similar to model control group;fluorescence intensity of cells in miR-155 mimics group was enhanced compared with model control group;fluorescence intensity of cells in miR-155 inhibitor group was attenuated in comparison with model control group and miR-155 mimics group A:blank control group B:model control group C:miR-155 mimics negative control group D:miR-155 mimics group E:miR-155 inhibitor negative control group F:miR-155 inhibitor group

表4 各組細(xì)胞ROS含量比較(x±s)Table 4 Comparison of ROS content among various groups (x±s)組別樣本量ROS熒光A值空白對(duì)照組520.68±3.21模型對(duì)照組563.52±5.47amiR-155擬似物對(duì)照組562.59±5.18amiR-155擬似物組584.57±6.39abcmiR-155抑制劑對(duì)照組561.96±5.26amiR-155抑制劑組541.84±4.97abdeF值163.236P值<0.001 注:與空白對(duì)照組比較,aP<0.05;與模型對(duì)照組比較,bP<0.05;與miR-155擬似物對(duì)照組比較,cP<0.05;與miR-155擬似物組比較,dP<0.05;與miR-155抑制劑對(duì)照組比較,eP<0.05(單因素方差分析,LSD-t檢驗(yàn)) ROS:活性氧簇 miR:微小RNA Note:Compared with blank control group,aP<0.05;compared with model control group,bP<0.05;compared with miR-155 mimics nega-tive control group,cP<0.05;compared with miR-155 mimics group,dP<0.05;compared with miR-155 inhibitor negative control group,eP<0.05 (One-way ANOVA,LSD-t test) ROS:reactive oxy-gen species miR:microRNA

2.8 雙熒光素酶報(bào)告結(jié)果

生物信息軟件預(yù)測(cè)顯示，SIRT1的3'UTR區(qū)存在miR-155連續(xù)結(jié)合位點(diǎn)，靶向序列為5'-AGCAUUA-3'。轉(zhuǎn)染miR-155擬似物細(xì)胞野生型SIRT1相對(duì)熒光素酶活性為0.41±0.07，明顯弱于轉(zhuǎn)染miR-155擬似物對(duì)照細(xì)胞的1.00±0.11，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

t

=7.838，

P

<0.05)；轉(zhuǎn)染miR-155抑制劑細(xì)胞野生型SIRT1相對(duì)熒光素酶活性為1.98±0.17，明顯強(qiáng)于轉(zhuǎn)染miR-155抑制劑對(duì)照細(xì)胞的1.00±0.12，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

t

=8.157，

P

<0.05)。轉(zhuǎn)染miR-155擬似物與轉(zhuǎn)染miR-155擬似物對(duì)照及轉(zhuǎn)染miR-155抑制劑與轉(zhuǎn)染miR-155抑制劑對(duì)照細(xì)胞突變型SIRT1相對(duì)熒光素酶活性比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

t

=0.776、0.350，均

P

>0.05)(圖5)。

表5 各組細(xì)胞SOD活性和MDA濃度比較(x±s)Table 5 Comparison of SOD activity and MDA concentration in cells among various groups (x±s)組別樣本量SOD[mmol/(min·L) ]MDA (μmol/L)空白對(duì)照組552.26±5.231.86±0.39模型對(duì)照組523.15±3.45a5.89±0.57amiR-155擬似物對(duì)照組522.85±3.62a5.93±0.52amiR-155擬似物組511.75±3.18abc7.12±0.61abcmiR-155抑制劑對(duì)照組524.43±3.71a5.85±0.48amiR-155抑制劑組541.09±4.57abde2.94±0.46abdeF值62.36173.325P值<0.001<0.001 注:與空白對(duì)照組比較,aP<0.05;與模型對(duì)照組比較,bP<0.05;與miR-155擬似物對(duì)照組比較,cP<0.05;與miR-155擬似物組比較,dP<0.05;與miR-155抑制劑對(duì)照組比較,eP<0.05(單因素方差分析,LSD-t檢驗(yàn)) SOD:超氧化物歧化酶;MDA:丙二醛;miR:微小RNA Note:Compared with blank control group,aP<0.05;compared with model control group,bP<0.05;compared with miR-155 mimics nega-tive control group,cP<0.05;compared with miR-155 mimics group,dP<0.05;compared with miR-155 inhibitor negative control group,eP<0.05 (One-way ANOVA,LSD-t test) SOD:superoxide dismutase;MDA:malondialdehyde;miR:microRNA

圖5 miR-155靶向調(diào)控SIRT1 A：miR-155與SIRT1存在連續(xù)結(jié)合位點(diǎn) B：miR-155擬似物和miR-155擬似物對(duì)照轉(zhuǎn)染細(xì)胞SIRT1相對(duì)熒光素酶活性比較 與miR-155擬似物對(duì)照組比較，a P<0.05(獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，n=3) C：miR-155抑制劑和miR-155抑制劑對(duì)照轉(zhuǎn)染細(xì)胞SIRT1相對(duì)熒光素酶活性比較 與miR-155抑制劑對(duì)照組比較，a P<0.05(獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，n=3) SIRT1：沉默信息調(diào)節(jié)因子相關(guān)酶1；UTR：非翻譯區(qū)；WT：野生型；miR：微小RNA；MUT：突變型Figure 5 Targeted regulation of SIRT1 by miR-155 A:There were continuous binding sites between miR-155 and SIRT1 B:Comparison of the relative luciferase activity of SIRT1 between cells transfected with miR-155 mimics and miR-155 mimics negative control Compared with miR-155 mimics negative control group,a P<0.05 (Independent samples t test,n=3) C:Comparison of the relative luciferase activity of SIRT1 between cells transfected with miR-155 inhibitor and miR-155 inhibitor negative control Compared with miR-155 inhibitor negative control group,a P<0.05 (Independent samples t test,n=3) SIRT1:silent information regulator factor related enzymes 1;UTR:untranslated area;WT:wild type;miR:microRNA;MUT:mutant type

2.9 各組細(xì)胞SIRT1、bcl-2、bax、cleaved-Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量及bcl-2/bax比較

空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、miR-155擬似物組、miR-155擬似物對(duì)照組、miR-155抑制劑組、miR-155抑制劑對(duì)照組細(xì)胞SIRT1、bcl-2、bax、cleaved-Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量及bcl-2/bax總體比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=48.596、55.489、15.632、63.281、113.259，均

P

<0.001)。與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組、miR-155擬似物組、miR-155擬似物對(duì)照組、miR-155抑制劑組、miR-155抑制劑對(duì)照組細(xì)胞SIRT1、bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量及bcl-2/bax降低，bax和cleaved-Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均

P

<0.05)；與模型對(duì)照組和miR-155擬似物對(duì)照組比較，miR-155擬似物組細(xì)胞SIRT1、bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量及bcl-2/bax降低，bax和cleaved-Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均

P

<0.05)；與模型對(duì)照組、miR-155抑制劑對(duì)照組和miR-155擬似物比較，miR-155抑制劑組細(xì)胞SIRT1、bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量及bcl-2/bax升高，bax、cleaved-Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均

P

<0.05)。模型對(duì)照組、miR-155擬似物對(duì)照組及miR-155抑制劑對(duì)照組間細(xì)胞SIRT1、bcl-2、bax、cleaved-Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量及bcl-2/bax比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均

P

>0.05)(圖6，表6)。

圖6 各組細(xì)胞蛋白表達(dá)電泳圖 與空白對(duì)照組相比，模型對(duì)照組、miR-155擬似物對(duì)照組、miR-155抑制劑對(duì)照組SIRT1、bcl-2蛋白條帶灰度減弱，bax、cleaved-Caspase-3蛋白條帶灰度增強(qiáng)；miR-155擬似物組SIRT1、bcl-2蛋白條帶灰度較模型對(duì)照組和miR-155擬似物對(duì)照組弱，bax、cleaved-Caspase-3蛋白條帶灰度較模型對(duì)照組和miR-155擬似物對(duì)照組強(qiáng)；miR-155抑制劑組SIRT1、bcl-2蛋白條帶灰度較模型對(duì)照組和miR-155抑制劑對(duì)照組強(qiáng)，bax、cleaved-Caspase-3蛋白條帶灰度較模型對(duì)照組和miR-155抑制劑對(duì)照組弱 1：空白對(duì)照組；2：模型對(duì)照組；3：miR-155擬似物對(duì)照組；4：miR-155擬似物組；5：miR-155抑制劑對(duì)照組；6：miR-155抑制劑組 cleaved-Caspase-3：活化的半胱氨酸天冬氨酸酶3；bax：bcl-2相關(guān)X蛋白；bcl-2：B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2基因；SIRT1：沉默信息調(diào)節(jié)因子相關(guān)酶1Figure 6 Electrophoretogram of proteins in various groups Compared with blank control group,the band intensity of SIRT1 and bcl-2 proteins was weaker,and the band intensity of bax and cleaved-Caspase-3 proteins was stronger in model control group,miR-155 mimics negative control group and miR-155 inhibitor negative control group.The band intensity of SIRT1 and bcl-2 proteins was weaker and the band intensity of bax and cleaved-Caspase-3 proteins was stronger in miR-155 mimics group than model control group and miR-155 mimics negative control group.The band intensity of SIRT1 and bcl-2 proteins was stronger and the band intensity of bax and cleaved-Caspase-3 proteins was weaker in miR-155 inhibitor group than model control group and miR-155 inhibitor negative control group 1:blank control group;2:model control group;3:miR-155 mimics negative control group;4:miR-155 mimics group;5:miR-155 inhibitor negative control group;6:miR-155 inhibitor group cleaved-Caspase-3:cleaved-cysteine aspartase 3;bax:bcl-2 associated X protein;bcl-2:B-cell lymphoma/leukemia-2 gene;SIRT1:silent information regulator factor related enzymes 1

表6 各組細(xì)胞SIRT1、bcl-2、bax、cleaved-Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量及bcl-2/bax比較(x±s)Table 6 Comparison of relative expression levels of SIRT1,bcl-2,bax,cleaved-Caspase-3 proteins and bcl-2/bax among various groups (x±s)組別SIRT1bcl-2baxbcl-2/baxcleaved-Caspase-3空白對(duì)照組1.06±0.110.87±0.090.71±0.061.14±0.100.36±0.05模型對(duì)照組0.65±0.07a0.45±0.07a0.96±0.10a0.46±0.06a0.89±0.09amiR-155擬似物對(duì)照組0.63±0.10a0.43±0.06a0.94±0.09a0.44±0.07a0.85±0.08amiR-155擬似物組0.35±0.07abc0.26±0.05abc1.13±0.11abc0.23±0.05abc1.03±0.10abcmiR-155抑制劑對(duì)照組0.62±0.09a0.42±0.06a0.93±0.09a0.45±0.06a0.82±0.09amiR-155抑制劑組0.82±0.09abde0.63±0.08abde0.81±0.07abde0.78±0.09abde0.63±0.07abdeF值48.59655.48915.632113.25963.281P值<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001 注:與空白對(duì)照組比較,aP<0.05;與模型對(duì)照組比較,bP<0.05;與miR-155擬似物對(duì)照組比較,cP<0.05;與miR-155擬似物組比較,dP<0.05;與miR-155抑制劑對(duì)照組比較,eP<0.05(單因素方差分析,LSD-t檢驗(yàn)) SIRT1:沉默信息調(diào)節(jié)因子相關(guān)酶1;bcl-2:B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2基因;bax:bcl-2相關(guān)X蛋白;cleaved-Caspase-3:活化的半胱氨酸天冬氨酸酶3;miR:微小RNA Note:Compared with blank control group,aP<0.05;compared with model control group,bP<0.05;com-pared with miR-155 mimics negative control group,cP<0.05;compared with miR-155 mimics group,dP<0.05;compared with miR-155 inhibitor negative control group,eP<0.05 (One-way ANOVA,LSD-t test) SIRT1:silent information regulator factor related enzymes 1;bcl-2:B-cell lymphoma/leukemia-2 gene;bax:bcl-2 associated X protein;cleaved-Caspase-3:cleaved-cysteine aspartase 3;miR:microRNA

3 討論

ROS過(guò)度堆積對(duì)LECs的損傷是引起白內(nèi)障的主要因素，可損傷細(xì)胞蛋白質(zhì)、核酸及脂質(zhì)等成分，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，引起組織損傷，降低細(xì)胞中ROS水平可有效防止晶狀體混濁。HO是晶狀體內(nèi)主要ROS之一，SOD等抗氧化劑可有效清除堆積的ROS，正常情況下，晶狀體中氧化與抗氧化系統(tǒng)處于平衡狀態(tài)，隨著年齡增長(zhǎng)，房水及晶狀體HO增加，氧化應(yīng)激損傷超過(guò)抗氧化系統(tǒng)，引起晶狀體氧化損傷。MDA濃度與細(xì)胞受ROS攻擊程度有關(guān)，白內(nèi)障患者晶狀體中MDA濃度明顯升高。HO處理的LECs可產(chǎn)生明顯氧化應(yīng)激損傷，同時(shí)實(shí)驗(yàn)性白內(nèi)障大鼠晶狀體中SOD活性明顯低于正常大鼠。以上研究均提示氧化應(yīng)激損傷參與白內(nèi)障發(fā)生和發(fā)展過(guò)程。本研究結(jié)果顯示，模型對(duì)照組細(xì)胞ROS熒光

A

值、MDA濃度及凋亡率均較空白對(duì)照組明顯升高，而SOD活性較空白對(duì)照組明顯降低，證實(shí)HO可誘導(dǎo)HLE-B3細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

研究證實(shí)，miRNA在白內(nèi)障發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用，有望作為診斷標(biāo)志物或新的治療靶點(diǎn)。miR-155在眼部組織生長(zhǎng)發(fā)育以及功能調(diào)節(jié)方面具有重要作用，Bian等研究顯示，miR-155參與視網(wǎng)膜損傷，與光感受器變性有關(guān)。Woeller等報(bào)道，miR-155在甲狀腺相關(guān)眼病患者眼眶成纖維細(xì)胞中的表達(dá)高于健康人群。以上研究均表明miR-155與眼部疾病密切相關(guān)。本研究結(jié)果也顯示，miR-155在HO誘導(dǎo)的HLE-B3細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型中異常高表達(dá)，miR-155抑制劑組細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，且凋亡率較模型對(duì)照組和miR-155擬似物組明顯降低，提示沉默miR-155對(duì)細(xì)胞具有保護(hù)作用，有利于細(xì)胞正常生長(zhǎng)發(fā)育。Qiu等研究表明，miR-155可通過(guò)結(jié)合環(huán)氧合酶2促進(jìn)蟑螂過(guò)敏原誘導(dǎo)的哮喘小鼠模型中的氧化應(yīng)激反應(yīng)。在膿毒癥小鼠模型中，沉默miR-155表達(dá)可抑制氧化應(yīng)激，減輕肝損傷。本研究結(jié)果顯示，miR-155抑制劑組細(xì)胞ROS含量、MDA濃度較模型對(duì)照組和miR-155擬似物組明顯降低，SOD活性明顯增強(qiáng)，提示沉默miR-155可減輕HLE-B3細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。

SIRT1具有調(diào)控細(xì)胞周期、抗氧化、抗凋亡等作用。Caspase-3可裂解多種功能蛋白，是細(xì)胞凋亡的執(zhí)行者，在HO誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激細(xì)胞模型中表達(dá)升高。bcl-2可抵抗細(xì)胞凋亡，bax可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，二者表達(dá)水平與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。SIRT1在眼部角膜、視網(wǎng)膜、晶狀體等組織中表達(dá)，與氧化損傷引起的細(xì)胞凋亡有關(guān)，參與葡萄膜炎、視網(wǎng)膜退行性疾病等眼部疾病的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程。臨床研究表明，SIRT1在年齡相關(guān)性白內(nèi)障患者LECs中低表達(dá)，促使細(xì)胞凋亡，加速疾病發(fā)展。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，糖尿病白內(nèi)障小鼠LECs中SIRT1表達(dá)明顯低于正常小鼠，可抑制細(xì)胞增生，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。促進(jìn)SIRT1表達(dá)或使用SIRT1激動(dòng)劑可減少氧化應(yīng)激導(dǎo)致的LECs損傷，預(yù)防白內(nèi)障發(fā)生。本研究結(jié)果表明，HO誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷細(xì)胞中SIRT1、bcl-2蛋白表達(dá)水平及bcl-2/bax降低，bax、cleaved-Caspase-3蛋白升高，均提示SIRT1參與細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷及凋亡過(guò)程，與劉金泉等研究SIRT1參與帕金森模型細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激損傷的結(jié)果一致。同時(shí)本研究經(jīng)雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-155與SIRT1存在靶向性，與李世勛等研究miR-155靶向SIRT1調(diào)控缺血性心肌細(xì)胞的結(jié)果相似，提示miR-155可靶向調(diào)控SIRT1表達(dá)，且沉默miR-155可減輕細(xì)胞氧化損傷，減少凋亡。

綜上所述，本研究結(jié)果表明miR-155在HO誘導(dǎo)的HLE-B3細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型中高表達(dá)，沉默miR-155可減少細(xì)胞凋亡，減輕氧化應(yīng)激損傷，其可能是通過(guò)靶向調(diào)控SIRT1表達(dá)水平發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用，為臨床治療白內(nèi)障提供新的靶點(diǎn)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。但本研究?jī)H針對(duì)細(xì)胞氧化損傷模型進(jìn)行探討，未建立動(dòng)物模型，未來(lái)需進(jìn)一步探討miR-155在體內(nèi)對(duì)晶狀體混濁的作用及可能機(jī)制。

利益沖突

所有作者均聲明不存在任何利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

牛艷桃：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和實(shí)施、文章撰寫；張麗：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、文章修改及定稿；謝文芳：實(shí)驗(yàn)實(shí)施、數(shù)據(jù)采集及分析