楊鑫 劉旭輝 孟佳 方夢(mèng)園 張鳳妍

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院眼科，鄭州450052

白內(nèi)障是老年人視力下降和致盲的首要原因，其發(fā)病機(jī)制尚不明確。人晶狀體上皮細(xì)胞(human lens epithelium cells，HLECs)位于晶狀體前表面，在維持晶狀體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定方面發(fā)揮重要作用。當(dāng)HLECs處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，可產(chǎn)生大量活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)，誘導(dǎo)HLECs發(fā)生焦亡，進(jìn)而誘發(fā)白內(nèi)障。由此可見(jiàn)，預(yù)防HLECs焦亡可以延緩白內(nèi)障的發(fā)生和發(fā)展。褪黑素是由松果體合成分泌的一種吲哚類(lèi)內(nèi)分泌激素。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，褪黑素具有抗氧化功效，對(duì)人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞具有保護(hù)作用。另有研究顯示，褪黑素通過(guò)減少ROS水平使小鼠角膜上皮細(xì)胞免受氧化損傷。近年來(lái)研究證實(shí)，褪黑素可通過(guò)抑制NLRP3炎性小體活化抑制大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)元焦亡。目前，尚未有褪黑素對(duì)HLECs焦亡作用機(jī)制的報(bào)道。本研究擬探討褪黑素對(duì)HO誘導(dǎo)HLECs焦亡的抑制作用及其抗氧化機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1

細(xì)胞來(lái)源 原代HLECs購(gòu)自上海中喬新舟生物科技有限公司。

1.1.2

主要試劑及儀器 內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基(endothelial cell medium，ECM)(上海中喬新舟生物科技有限公司)；Vitamin E(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2短發(fā)夾RNA(nuclear factor erythroid 2-related factor 2 short hairpin RNA，shNrf2)慢病毒包裝(沈陽(yáng)萬(wàn)類(lèi)生物科技有限公司)；褪黑素(美國(guó)Sigma公司)；ROS檢測(cè)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase，LDH)測(cè)定試劑盒(南京建成生物科技有限公司)；人白細(xì)胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒、IL-18 ELISA試劑盒(杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司)；全蛋白提取試劑盒、核蛋白和漿蛋白提取試劑盒、兔抗人Nrf2一抗(WL02135)、兔抗人核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體家族pyrin結(jié)構(gòu)域蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3)一抗(WL02635)、兔抗人凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a C-terminal caspase recruitment domain，ASC)一抗(WL02462)、兔抗人caspase-1 p20一抗(WL02996a)、山羊抗兔IgG-HRP二抗(WLA023)(沈陽(yáng)萬(wàn)類(lèi)生物科技有限公司)；兔抗人GSDMD-N一抗(ab215203)(英國(guó)Abcam公司)；CO培養(yǎng)箱(HF-90，上海力申科學(xué)儀器有限公司)；倒置相差顯微鏡(IX53，日本Olympus公司)；流式細(xì)胞儀(NovoCyte，美國(guó)ACEC公司)；酶標(biāo)儀(ELX-800，美國(guó)BioTek公司)。

1.2 方法

1.2.1

細(xì)胞分組及處理 HLECs接種至ECM中，待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好后分為5個(gè)組，其中正常對(duì)照組細(xì)胞正常培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h；模型對(duì)照組細(xì)胞在正常培養(yǎng)基條件下培養(yǎng)24 h后，加入100 μmol/L HO繼續(xù)培養(yǎng)24 h；褪黑素組細(xì)胞于終濃度1×10mol/L褪黑素的培養(yǎng)基中預(yù)處理24 h后，加入終濃度100 μmol/L HO繼續(xù)培養(yǎng)24 h；維生素E組和維生素E溶劑組細(xì)胞于含終濃度100 μmol/L 維生素E或相應(yīng)體積溶劑(甲醇)培養(yǎng)基中預(yù)處理24 h后，加入終濃度100 μmol/L的HO繼續(xù)培養(yǎng)24 h。為進(jìn)一步探討褪黑素保護(hù)HLECs的作用機(jī)制，用shNrf2慢病毒轉(zhuǎn)染對(duì)數(shù)期HLECs，然后將細(xì)胞分為7個(gè)組：正常對(duì)照組細(xì)胞以正常培養(yǎng)基培養(yǎng)120 h；模型對(duì)照組細(xì)胞在正常培養(yǎng)基條件下培養(yǎng)96 h后，加入終濃度100 μmol/L HO培養(yǎng)24 h；shNrf2陰性對(duì)照組和shNrf2組細(xì)胞分別用shNrf2陰性對(duì)照和shNrf2慢病毒轉(zhuǎn)染24 h后，棄去培養(yǎng)基上清，更換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)72 h后，加入終濃度100 μmol/L HO培養(yǎng)24 h；褪黑素組細(xì)胞在正常培養(yǎng)基條件下培養(yǎng)72 h后，用終濃度1×10mol/L 褪黑素處理24 h，然后加入終濃度100 μmol/L HO繼續(xù)培養(yǎng)24 h；褪黑素+Nrf2陰性對(duì)照組和褪黑素+shNrf2組細(xì)胞分別用shNrf2陰性對(duì)照或shNrf2慢病毒轉(zhuǎn)染24 h后，棄去培養(yǎng)基上清，更換為完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，再用終濃度1×10mol/L褪黑素處理24 h，加入終濃度100 μmol/LHO繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.2.2

倒置相差顯微鏡觀察各組細(xì)胞焦亡情況 將細(xì)胞以5×10/孔接種在6孔板中，然后參照1.2.1方法用不同藥物處理細(xì)胞。藥物處理相應(yīng)時(shí)間后，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞的焦亡情況。

1.2.3

ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-1β及IL-18含量 收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，300×

g

離心10 min去除沉淀物，然后嚴(yán)格按照IL-1β和IL-18 ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)依次加入100 μl細(xì)胞培養(yǎng)上清液、50 μl IL-1β/IL-18抗體、室溫孵育2 h后，每孔加入300 μl洗滌液洗滌；每孔依次加入100 μl辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素、100 μl TMB、100 μl終止溶液后，測(cè)定450 nm最大吸收波長(zhǎng)和570 nm參考波長(zhǎng)下的吸光度(

A

)值，校準(zhǔn)后的

A

值為450 nm的測(cè)定值減去570 nm的測(cè)定值。分別將人IL-1β、IL-18標(biāo)準(zhǔn)品按試劑盒說(shuō)明書(shū)稀釋成相應(yīng)的濃度梯度，然后以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，校準(zhǔn)

A

值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。最后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-1β、IL-18相應(yīng)的濃度。

1.2.4

比色法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中LDH活性 收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)，600×

g

離心10 min去除沉淀物，參照LDH測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)在空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、測(cè)定孔、對(duì)照孔中分別加入相應(yīng)工作液，混勻，室溫靜置5 min，設(shè)定檢測(cè)波長(zhǎng)為450 nm，使用酶標(biāo)儀測(cè)定

A

值。計(jì)算LDH活性[μmol/(min·L)]=(樣本

A

值-對(duì)照

A

值)/(標(biāo)準(zhǔn)品

A

值-空白

A

值)×0.2×1 000；其中0.2為標(biāo)準(zhǔn)品濃度(μmol/ml)。

1.2.5

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞中ROS含量 將5×10個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)，分組處理后，棄去培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)洗滌細(xì)胞2次。分別加入1 ml的DCFH-DA稀釋液(用培養(yǎng)基1∶ 1 000稀釋)混勻，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min，每隔5 min顛倒混勻一次。用PBS洗滌細(xì)胞3次，充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。最后用500 μl PBS重懸細(xì)胞后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞中的熒光強(qiáng)度。

1.2.6

Western blot法檢測(cè)細(xì)胞中Nrf2、NLRP3、ASC、caspase-1 p20、GSDMD-N蛋白的表達(dá) 收集各組細(xì)胞，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)，棄去培養(yǎng)基，預(yù)冷PBS漂洗3次，在6孔板中每孔加入核蛋白和漿蛋白提取試劑盒中的抽提試劑或蛋白裂解液(含1 % PMSF的RIPA裂解液)，4 ℃條件下離心半徑=10 cm，12 000 r/min離心10 min，收集上清分別提取細(xì)胞核蛋白和總蛋白物，BCA法測(cè)定蛋白濃度。以SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，并濕法轉(zhuǎn)印至PVDF膜；將轉(zhuǎn)印好的PVDF膜用質(zhì)量分?jǐn)?shù)5 %的脫脂奶粉室溫封閉1 h；分別加入Nrf2(1∶ 500)、NLRP3(1∶ 500)、ASC(1∶ 500)、caspase-1 p20(1∶ 500)、GSDMD-N(1∶ 1 000)一抗，在4 ℃條件下孵育過(guò)夜；TBST緩沖液洗膜4次，每次5 min；置于HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗(1∶ 5 000)中37 ℃孵育45 min，TBST緩沖液洗膜6次，每次5 min；ECL化學(xué)發(fā)光液顯色，用凝膠圖像處理系統(tǒng)(Gel-Pro-Analyzer)軟件分析目標(biāo)條帶的灰度值，以Histone H3作為核蛋白Nrf2內(nèi)參，β-actin作為NLRP3、ASC、caspase-1 p20、GSDMD-N內(nèi)參，計(jì)算各目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。繪圖時(shí)將正常對(duì)照組各蛋白表達(dá)量進(jìn)行歸一化處理，其他組的各蛋白數(shù)值為相對(duì)于正常對(duì)照組的比值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料經(jīng)Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)符合正態(tài)分布，以表示。組間數(shù)據(jù)經(jīng)Levene檢驗(yàn)證實(shí)方差齊(均

P

>0.05)。各組間計(jì)量資料總體差異比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-

t

檢驗(yàn)，

P

<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-18、IL-1β濃度及LDH的活性濃度比較

表1 各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液IL-18、IL-1β濃度及LDH活性比較(x±s)Table 1 Comparison of the expression level of IL-18,IL-1β and LDH activity amongfive groups (x±s)組別樣本量LDH[μmol/(min·L)]IL-1β (pg/ml)IL-18 (pg/ml)正常對(duì)照組392.34±13.82a18.37±2.60a185.00±28.31a模型對(duì)照組3340.47±49.6162.28±8.73687.18±115.40褪黑素組3151.99±23.95a30.72±4.96a313.11±32.60a維生素E溶劑組3328.27±64.1466.06±11.49701.32±129.82維生素E組3174.78±29.92a33.56±4.01a352.30±53.22aF值22.3925.6223.44P值<0.05<0.05<0.05 注:與模型對(duì)照組比較,aP<0.05(單因素方差分析,LSD-t檢驗(yàn)) LDH:乳酸鹽脫氫酶;IL:白細(xì)胞介素 Note:Compared with model control group,aP<0.05 (One-way ANOVA,LSD-t test) LDH:lac-tate dehydrogenase;IL:interleukin

圖2 各組蛋白Western blot表達(dá)電泳圖 1：正常對(duì)照組；2：模型對(duì)照組；3：維生素E溶劑組；4：維生素E組；5：褪黑素組 Nrf2：核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2；NLRP3：核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體家族pyrin結(jié)構(gòu)域蛋白3；ASC：凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白 Figure 2 Electrophoretogram of different proteins by Western blot 1:normal control group;2:model control group;3:vitamin E solvent group;4:vitamin E group;5:melatonin group Nrf2:nuclear factor erythroid 2-related factor 2;NLRP3:nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3;ASC:apoptosis-associated speck-like protein containing a C-terminal caspase recruitment domain

各組間IL-18、IL-1β濃度及LDH活性總體比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=23.44、25.62、22.39，均

P

<0.05)。與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-18及IL-1β濃度及LDH的活性均顯著升高(

P

<0.05)；與模型對(duì)照組相比，褪黑素組和維生素E組IL-18、IL-1β濃度及LDH的活性均降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05)(表1)。

2.2 各組細(xì)胞ROS含量比較

正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、褪黑素組、維生素E溶劑組、維生素E組細(xì)胞ROS熒光強(qiáng)度分別為8 292.33±653.03、18 310.33±1 248.01、13 040.67±1 550.66、19 546.67±1 288.84、12 593.67±1 677.06，總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=35.62，

P

<0.05)。正常對(duì)照組、褪黑素組和維生素E組中ROS熒光強(qiáng)度明顯低于模型對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均

P

<0.05)(圖1)。

圖1 各組細(xì)胞中ROS熒光強(qiáng)度比較 F=35.62，P<0.05.與模型對(duì)照組比較，a P<0.05(單因素方差分析，LSD-t檢驗(yàn)，n=3) 1：正常對(duì)照組；2：模型對(duì)照組；3：褪黑素組；4：維生素E溶劑組；5：維生素E組Figure 1 Comparison of ROS level among various groups F=35.62，P<0.05.Compared with model control group,a P<0.05 (One-way ANOVA,LSD-t test,n=3) 1:normal control group;2:model control group;3:melatonin group;4:vitamin E solvent group;5:vitamin E group

2.3 各組細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白表達(dá)量比較

各組細(xì)胞中Nrf2、NLRP3、ASC、caspase-1 p20、GSDMD-N蛋白相對(duì)表達(dá)量總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=42.64、54.17、71.45、91.26、55.34，均

P

<0.05)。模型對(duì)照組細(xì)胞中Nrf2、NLRP3、ASC、caspase-1 p20、GSDMD-N蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著高于正常對(duì)照組，與模型對(duì)照組相比，褪黑素組和維生素E組細(xì)胞中Nrf2蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著升高，NLRP3、ASC、caspase-1 p20、GSDMD-N蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均

P

<0.05)(圖2、表2)。

2.4 各細(xì)胞轉(zhuǎn)染組焦亡形態(tài)

正常對(duì)照組細(xì)胞大小均勻，連接緊密，呈長(zhǎng)梭形，無(wú)焦亡細(xì)胞。模型對(duì)照組及shNrf2陰性對(duì)照組多數(shù)細(xì)胞腫脹膨大，有氣泡狀突出物狀典型細(xì)胞焦亡特征。與模型對(duì)照組相比，褪黑素組焦亡細(xì)胞數(shù)量減少，shNrf2組細(xì)胞焦亡數(shù)量增多。褪黑素+shNrf2組焦亡細(xì)胞數(shù)較shNrf2組減少(圖3)。

表2 各組細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)量比較(x±s)Table 2 Comparison of relative expression levels of pyroptosis-related protein amongvarious groups (x±s)組別樣本量Nrf2NLRP3ASCCaspase-1 p20GSDMD-N正常對(duì)照組31.00±0.00a1.00±0.00a1.00±0.00a1.00±0.00a1.00±0.00a模型對(duì)照組32.28±0.345.26±0.565.60±0.647.32±0.734.47±0.48褪黑素組34.24±0.44a2.63±0.29a1.67±0.27a2.17±0.29a1.66±0.21a維生素E溶劑組32.20±0.375.17±0.585.57±0.586.84±0.724.37±0.50維生素E組33.73±0.38a3.82±0.40a3.04±0.39a3.74±0.40a2.50±0.38aF值42.6454.1771.4591.2655.34P值<0.05<0.05<0.05<0.05<0.05 注:與模型對(duì)照組比較,aP<0.05(單因素方差分析,LSD-t檢驗(yàn)) Nrf2:核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2;NLRP3:核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體家族pyrin結(jié)構(gòu)域蛋白3;ASC:凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白 Note:Compared with model control group,aP<0.05(One-way ANOVA,LSD-t test) Nrf2:nu-clear factor erythroid 2-related factor 2;NLRP3:nucleotide-binding oligomerization domain-like recep-tor protein 3;ASC:apoptosis-associated speck-like protein containing a C-terminal caspase recruit-ment domain

圖3 各細(xì)胞轉(zhuǎn)染組倒置相差顯微鏡圖(×100，標(biāo)尺=200 μm) 紅色箭頭示焦亡細(xì)胞 A：正常對(duì)照組 B：模型對(duì)照組 C：shNrf2陰性對(duì)照組 D:shNrf2組 E：褪黑素組 F：褪黑素+shNrf2陰性對(duì)照組 G：褪黑素+shNrf2組Figure 3 Observation of cells by phase-contrast microscopy (×100,bar=200 μm) Red arrows indicated pyroptotic cells A:normal control group B:model control group C:shNrf2 negative control group D:shNrf2 group E:melatonin group F:melatonin+Nrf2 negative control group G:melatonin+shNrf2 group

2.5 各細(xì)胞轉(zhuǎn)染組培養(yǎng)上清液中IL-18、IL-1β質(zhì)量濃度及LDH活性比較

各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-18、IL-1β質(zhì)量濃度及LDH活性總體比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=63.28、65.40、58.55，均

P

<0.05)；與模型對(duì)照組及shNrf2陰性對(duì)照組比較，shNrf2組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-18、IL-1β質(zhì)量濃度及LDH活性升高，褪黑素+Nrf2陰性對(duì)照組IL-18、IL-1β質(zhì)量濃度及LDH活性下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均

P

<0.05)；與褪黑素+shNrf2陰性對(duì)照組比較，褪黑素+shNrf2組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-18、IL-1β質(zhì)量濃度及LDH活性均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均

P

<0.05)(表3)。

2.6 各細(xì)胞轉(zhuǎn)染組ROS含量比較

shNrf2組ROS熒光強(qiáng)度為24 100.67±1 298.17，顯著高于模型對(duì)照組的19 120.00±1 867.73及shNrf2陰性對(duì)照組的19 077.00±2 031.08，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=32.93，均

P

<0.05)；褪黑素+shNrf2組細(xì)胞中ROS的熒光強(qiáng)度為17 651.33±1 850.69，顯著高于褪黑素+Nrf2陰性對(duì)照組的12 803±1 561.60，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05)(圖4)。

2.7 各細(xì)胞轉(zhuǎn)染組焦亡相關(guān)蛋白表達(dá)比較

各細(xì)胞轉(zhuǎn)染組Nrf2、NLRP3、ASC、caspase-1 p20、GSDMD-N蛋白相對(duì)表達(dá)量總體比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=94.80、65.69、70.56、77.88、39.29，均

P

<0.05)。與模型對(duì)照組和shNrf2陰性對(duì)照組比較，shNrf2組Nrf2蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯降低，NLRP3、ASC、caspase-1 p20、GSDMD-N蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均

P

<0.05)；與褪黑素+shNrf2陰性對(duì)照組相比，褪黑素+shNrf2組NLRP3、ASC、caspase-1 p20、GSDMD-N蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均

P

<0.05)(圖5，表4)。

表3 各細(xì)胞轉(zhuǎn)染組IL-1β、IL-18濃度及LDH活性比較(x±s)Table 3 Comparison of the expression level of IL-1β,IL-18 and LDH activity amongvarious groups (x±s)組別樣本量LDH[μmol/(min·L)]IL-1β(pg/ml)IL-18(pg/ml)正常對(duì)照組382.13±13.40a16.19±2.35a172.12±18.19a模型對(duì)照組3317.30±37.1770.86±7.40716.78±84.29shNrf2陰性對(duì)照組3321.760±43.1367.70±9.37710.40±103.39shNrf2組3556.01±53.36ab119.02±11.99ab1 339.14±148.04ab褪黑素組3158.08±23.06a35.92±4.95a332.67±59.30a褪黑素+shNrf2陰性對(duì)照組3162.43±26.95ab30.89±3.84ab329.31±40.18ab褪黑素+shNrf2組3279.04±29.70c59.03±6.40c658.74±69.07cF值58.5565.4063.28P值<0.05<0.05<0.05 注:與模型對(duì)照組比較,aP<0.05;與shNrf2陰性對(duì)照組比較,bP<0.05;與褪黑素+shNrf2陰性對(duì)照組比較,cP<0.05(單因素方差分析,LSD-t檢驗(yàn)) LDH:乳酸鹽脫氫酶;IL:白細(xì)胞介素;shNrf2:Nrf2短發(fā)夾RNA Note:Compared with model control group,aP<0.05;compared with shNrf2 negative control group,cP<0.05;compared with melatonin+shNrf2 negative control group,cP<0.05(One-way ANOVA,LSD-t test) LDH:lactate dehydrogenase;IL:interleukin;shNrf2:Nrf2 short hairpin RNA

圖5 各組蛋白電泳圖 1：正常對(duì)照組；2：模型對(duì)照組；3：shNrf2陰性對(duì)照組；4:shNrf2組；5：褪黑素組；6：褪黑素+shNrf2陰性對(duì)照組；7：褪黑素+shNrf2組 Nrf2：核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2；NLRP3：核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體家族pyrin結(jié)構(gòu)域蛋白3；ASC：凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白Figure 5 Electrophoretogram of different proteins 1：normal control group;2：model control group;3：shNrf2 negative control group;4:shNrf2 group；5:melatonin group;6:melatonin+shNrf2 negative control group;7:melatonin+shNrf2 group Nrf2:nuclear factor erythroid 2-related factor 2;NLRP3:nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3;ASC:apoptosis-associated speck-like protein containing a C-terminal caspase recruitment domain

圖4 各細(xì)胞轉(zhuǎn)染組ROS熒光強(qiáng)度的比較 F=32.93,P<0.05.與模型對(duì)照組比較，a P<0.05；與shNrf2陰性對(duì)照組比較，b P<0.05；與褪黑素+shNrf2陰性對(duì)照組比較，c P<0.05 (單因素方差分析，LSD-t檢驗(yàn)，n=3) 1：正常對(duì)照組；2：模型對(duì)照組；3：shNrf2陰性對(duì)照組；4:shNrf2組；5：褪黑素組；6：褪黑素+shNrf2陰性對(duì)照組；7：褪黑素+shNrf2組Figure 4 Comparison of ROS fluorescence intensity among various groups F=32.93,P<0.05.Compared with model control group,a P<0.05;compared with shNrf2 negative control group,b P<0.05;compared with melatonin+shNrf2 negative control group,c P<0.05 (One-way ANOVA,LSD-t test,n=3) 1:normal control group;2:model control group;3:shNrf2 negative control group;4:shNrf2 group;5:melatonin group;6:melatonin+shNrf2 negative control group;7:melatonin+shNrf2 group

3 討論

多項(xiàng)研究表明，HLECs的氧化損傷對(duì)年齡相關(guān)性白內(nèi)障的發(fā)病起著重要的作用，細(xì)胞內(nèi)氧化代謝產(chǎn)物增加會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，引起細(xì)胞焦亡。有研究發(fā)現(xiàn)，HO誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激會(huì)促進(jìn)HLECs焦亡從而導(dǎo)致白內(nèi)障的形成。

褪黑素是經(jīng)典的抗氧化藥物，對(duì)角膜炎、白內(nèi)障、青光眼等眼部疾病具有一定的防治作用。但其抑制HLECs焦亡的作用尚不明確。維生素E是高效的抗氧化劑和自由基清除劑，常作為抗氧化劑的陽(yáng)性對(duì)照。本研究采用HO誘導(dǎo)的HLECs氧化損傷模型模擬白內(nèi)障發(fā)病機(jī)制，以維生素E為陽(yáng)性對(duì)照，系統(tǒng)評(píng)價(jià)褪黑素抗氧化損傷和焦亡的功效，并研究其可能的作用機(jī)制。

ROS是氧化還原反應(yīng)的產(chǎn)物，由其引起的氧化應(yīng)激被認(rèn)為是細(xì)胞損傷和白內(nèi)障形成的主要機(jī)制。褪黑素可以降低視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中ROS含量，緩解氧化應(yīng)激引起的病理?yè)p傷。本研究結(jié)果也顯示，與模型對(duì)照組相比，褪黑素組和維生素E組細(xì)胞中ROS水平明顯下降，提示褪黑素能抵抗HO誘導(dǎo)的HLECs氧化損傷，對(duì)HLECs具有保護(hù)作用。

表4 各細(xì)胞轉(zhuǎn)染組焦亡相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較(x±s)Table 4 Comparison of the relative expression level of pyroptosis-related proteins among different cell transfection groups (x±s)組別樣本量Nrf2NLRP3ASCCaspase-1 p20GSDMD-N正常對(duì)照組31.00±0.00a1.00±0.00a1.00±0.00a1.00±0.00a1.00±0.00a模型組32.61±0.382.83±0.396.12±0.605.74±0.663.65±0.42shNrf2陰性對(duì)照組32.42±0.273.07±0.376.14±0.685.66±0.713.71±0.47shNrf2組30.72±0.09ab6.44±0.65ab8.72±0.84ab7.44±0.72ab5.02±0.52ab褪黑素組35.52±0.53a2.03±0.31a2.64±0.33a1.87±0.26a1.99±0.31a褪黑素+shNrf2陰性對(duì)照組35.56±0.55ab1.83±0.22ab2.53±0.36ab1.88±0.19ab2.01±0.31ab褪黑素+shNrf2組31.87±0.27c2.93±0.34c4.43±0.44c2.60±0.31c2.64±0.35cF值94.8065.6970.5677.8839.29P值<0.05<0.05<0.05<0.05<0.05 注:與模型對(duì)照組比較,aP<0.05;與shNrf2陰性對(duì)照組比較,bP<0.05;與褪黑素+shNrf2陰性對(duì)照組比較,cP<0.05(單因素方差分析,LSD-t檢驗(yàn)) Nrf2:核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2;NLRP3:核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體家族pyrin結(jié)構(gòu)域蛋白3;ASC:凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白;shNrf2:Nrf2短發(fā)夾RNA Note:Compared with model control group,aP<0.05;compared with shNrf2 negative control group,bP<0.05;compared with melatonin+shNrf2 negative control group,cP<0.05 (One-way ANOVA,LSD-t test) Nrf2:nuclear factor erythroid 2-related factor 2;NLRP3:nucleotide-binding oli-gomerization domain-like receptor protein 3;ASC:apoptosis-associated speck-like protein containing a C-terminal caspase recruitment domain;shNrf2:Nrf2 short hairpin RNA

細(xì)胞焦亡是一種新的細(xì)胞程序性、伴有炎性因子參與的死亡方式。Caspase-1是介導(dǎo)細(xì)胞焦亡的關(guān)鍵蛋白，活化的Caspase-1切割GSDMD，誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡，使LDH、IL-1β、IL-18分泌到胞外，加重炎癥反應(yīng)。NLRP3炎癥小體由Caspase-1前體與NLRP3通過(guò)接頭蛋白ASC組成，參與糖尿病性視網(wǎng)膜病變、葡萄膜炎等眼科疾病的發(fā)病過(guò)程，與白內(nèi)障的進(jìn)展也存在一定關(guān)聯(lián)。正常生理狀態(tài)下，細(xì)胞質(zhì)中的Nrf2與Keap1結(jié)合并處于相對(duì)抑制狀態(tài)。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激時(shí)，Nrf2轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)與抗氧化反應(yīng)原件(ARE)結(jié)合，激活下游抗氧化基因的轉(zhuǎn)錄，發(fā)揮抗氧化功效。此外，Nrf2可減少NLRP3炎性小體的激活，是抑制細(xì)胞焦亡的關(guān)鍵分子之一。HO會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激，使Nrf2移位至細(xì)胞核，導(dǎo)致細(xì)胞核中Nrf2的表達(dá)應(yīng)激性上調(diào)。本研究發(fā)現(xiàn)，HO處理使細(xì)胞中Nrf2應(yīng)激性上調(diào)，同時(shí)NLRP3炎性小體的釋放增加。褪黑素處理進(jìn)一步增加細(xì)胞核中Nrf2的表達(dá)，抑制NLRP3炎性小體的激活。氧化應(yīng)激狀態(tài)下沉默Nrf2顯著促進(jìn)細(xì)胞中NLRP3炎癥小體的激活，說(shuō)明Nrf2負(fù)調(diào)控HLECs細(xì)胞中NLRP3的表達(dá)，可能在調(diào)控細(xì)胞焦亡中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

大量研究表明，褪黑素能通過(guò)激活Nrf2通路抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，緩解細(xì)胞氧化應(yīng)激水平。本研究發(fā)現(xiàn)用褪黑素預(yù)處理可顯著上調(diào)HO誘導(dǎo)細(xì)胞核中Nrf2的表達(dá)，抑制NLRP3、ASC、caspase-1 p20、GSDMD-N蛋白表達(dá)，降低LDH活性，減少I(mǎi)L-1β、IL-18炎性因子的釋放，表明褪黑素對(duì)HO誘導(dǎo)HLECs細(xì)胞氧化應(yīng)激及焦亡具有抑制作用。為進(jìn)一步驗(yàn)證褪黑素是否通過(guò)激活Nrf2參與調(diào)控HLECs的氧化應(yīng)激及焦亡水平，本研究設(shè)計(jì)挽救實(shí)驗(yàn)，采用shNrf2慢病毒轉(zhuǎn)染下調(diào)Nrf2表達(dá)，發(fā)現(xiàn)沉默Nrf2顯著減弱了褪黑素的抗氧化及抗焦亡作用。Ma等研究也發(fā)現(xiàn)，褪黑素處理可逆轉(zhuǎn)因Nrf2沉默而導(dǎo)致的成骨細(xì)胞死亡，提出褪黑素可通過(guò)激活Nrf2通路改善骨質(zhì)疏松癥。以上研究結(jié)果均提示，Nrf2參與了褪黑素對(duì)氧化應(yīng)激狀態(tài)下抗HLECs焦亡作用。

本研究表明，褪黑素抑制HO誘導(dǎo)的HLECs氧化應(yīng)激損傷及細(xì)胞焦亡，其作用機(jī)制可能是通過(guò)激活Nrf2抑制ROS的產(chǎn)生及NLRP3炎性小體的活化，減少LDH活性以及IL-1β、IL-18炎癥因子的釋放，抑制caspase-1依賴(lài)的HLECs焦亡，進(jìn)而發(fā)揮對(duì)HLECs的保護(hù)作用，為基于HLECs的白內(nèi)障防治提供了新的思路。

利益沖突

所有作者均聲明不存在任何利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

楊鑫：醞釀和設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、實(shí)施研究、采集數(shù)據(jù)、分析和解釋數(shù)據(jù)、撰寫(xiě)文章；劉旭輝、孟佳：實(shí)施研究、采集數(shù)據(jù)、分析和解釋數(shù)據(jù)；方夢(mèng)園：實(shí)施研究、采集數(shù)據(jù)、數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析；張鳳妍：醞釀和設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、對(duì)文章進(jìn)行指導(dǎo)及定稿