南安超 南建茹 劉亞東 劉向玲

鄭州大學第二附屬醫(yī)院眼科，鄭州 450014

糖尿病性白內(nèi)障(diabetic cataract，DC)是除糖尿病視網(wǎng)膜病變外，糖尿病患者致盲的又一重要因素。DC患者晶狀體混濁進展快，晶狀體體積較正常人明顯增大，目前臨床上主要通過手術(shù)治療DC，但并發(fā)癥發(fā)生率較高。因此，深入研究DC發(fā)病機制，尋找有效防治途徑至關重要。晶狀體上皮細胞(lens epithelial cells，LECs)的氧化應激損傷是高糖環(huán)境下晶狀體混濁的主要原因之一。氧化應激是指機體受到刺激后，產(chǎn)生大量活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)，超出機體對其的清除速度，導致ROS等氧自由基在體內(nèi)或細胞內(nèi)蓄積，從而引起組織損傷的過程。微小RNA(microRNA，miRNA)是非編碼RNA，能特異性識別靶基因的3'-非翻譯區(qū)(3'-untranslated region，3'-UTR)，通過與靶基因完全或部分互補結(jié)合，導致靶基因的降解或抑制其翻譯。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，多種miRNA在LECs的氧化應激損傷中發(fā)揮作用，參與白內(nèi)障的發(fā)生和發(fā)展。miR-15a是miRNA家族成員，其在白內(nèi)障患者LECs中呈異常高表達，且能誘導LECs凋亡。Cho等報道，miR-15a是糖尿病性黃斑水腫患者房水中差異表達的miRNA之一。但miR-15a與DC發(fā)生和發(fā)展的關系尚不明確。本研究擬檢測DC患者LECs中miR-15a的表達情況，并探討miR-15a對高糖環(huán)境下LECs抗氧化應激能力的影響及其可能的作用機制，為DC的發(fā)病機制及治療靶點研究提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1

組織標本及細胞來源 收集2018年5月至2019年10月于鄭州大學第二附屬醫(yī)院進行超聲乳化白內(nèi)障摘出術(shù)的DC患者共26例26眼晶狀體前囊膜組織標本作為DC組，其中男10例10眼，女16例16眼，年齡61～82歲，平均(70.35±4.56)歲；同時收集鄭州大學第二附屬醫(yī)院健康供體26例26眼透明晶狀體前囊膜組織作為正常對照組，其中男11例11眼，女15例15眼，年齡61～84歲，平均(69.73±4.49)歲。2個組晶狀體前囊膜組織來源人群年齡和性別比例比較差異均無統(tǒng)計學意義(均

P

>0.05)。永生型人LECs HLEC-B3細胞株(中科院上海細胞庫)。

1.1.2

主要試劑及儀器 DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、總抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)、還原型谷胱甘肽(glutathone，GSH)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)檢測試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；miR-15a抑制劑、miR-15a對照(上海吉瑪基因公司)；Lipofectamine2000、2',7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽(2,7-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA)熒光探針(美國Sigma公司)；Trizol總RNA抽提試劑盒、CCK-8試劑盒(杭州四季青公司)；兔抗人沉默信息調(diào)節(jié)蛋白1(silent information regulator 1，SIRT1)一抗(703368)、兔抗人叉頭轉(zhuǎn)錄因子3a(forkhead transcription factor 3a，F(xiàn)OXO3a)一抗(PA5-104701)、兔抗人p53一抗(MA5-12557)、山羊抗兔辣根過氧化物酶標記的IgG(H+L)二抗(A32731)(美國Invitrogen公司)；Annexin V FITC/PI凋亡試劑盒(美國BD公司)；熒光素酶報告基因檢測試劑盒(美國Abcam公司)。免疫熒光顯微鏡(日本Olympus公司)；酶標儀(美國Biorad公司)；實時熒光定量PCR儀(美國Applied Biosystems公司)；紫外分光光度計(德國Eppendorf公司)；流式細胞儀(美國BD公司)。

1.2 方法

1.2.1

晶狀體前囊膜的收集 (1)DC組晶狀體前囊膜 DC患者行超聲乳化白內(nèi)障摘出術(shù)過程中，常規(guī)連續(xù)環(huán)形撕囊后，取出直徑5.5～6.5 mm前囊膜，雙蒸水沖洗后，分成2份，置入凍存管中于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?2)正常對照組晶狀體前囊膜 無菌條件下環(huán)形剪下完整角膜，在手術(shù)顯微鏡下剪開眼球，清除晶狀體懸韌帶、房水、玻璃體及黏附血液等成分，完整取出透明晶狀體，從透明晶狀體前部旁中心環(huán)形撕取前囊膜中央及周邊5.5 mm×5.5 mm范圍的前囊膜，雙蒸水分離，清除晶狀體皮質(zhì)，PBS沖洗后，分成2份，置于凍存管中于-80 ℃保存?zhèn)溆?。本研究?jīng)鄭州大學第二附屬醫(yī)院倫理委員會審核批準(批文號：ZDEFY201803160023)，研究對象均簽署知情同意書。

1.2.2

實時熒光定量PCR法檢測晶狀體前囊膜組織中miR-15a表達 取凍存的DC組和正常對照組晶狀體前囊膜組織各1份標本于液氮預冷的研缽中研磨成粉末，加1 ml Trizol試劑，參照Trizol總RNA抽提試劑盒說明書提取總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。取2 μl模板cDNA進行PCR擴增，U6引物：正向序列為5'-GCTTAGCTTCGATCGGCTAA-3'，反向序列為5'-GCTTAGCTAGGCCCTACCAC-3'；miR-15a引物：正向序列為5'-CGTTTCGATTGCCATTACGC-3'，反向序列為5'-GCTTTAGGCTAGCCATGCTT-3'。實驗所用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。擴增條件：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共35個循環(huán)；72 ℃總延伸6 min。以U6為內(nèi)參照，采用2相對定量法計算miR-15a的相對表達量。實驗獨立重復3次。

1.2.3

Western blot法檢測晶狀體前囊膜組織中SIRT1蛋白的表達 取剩余凍存的DC組和正常對照組晶狀體前囊膜組織各1份，剪切成小塊，稱質(zhì)量，裝入1 ml玻璃勻漿器中，按每20 mg組織100～200 μl的比例加入蛋白裂解液，在冰水中勻漿裂解1 min，14 000×

g

離心5 min，取上清，檢測蛋白濃度。取蛋白樣品加入SDS-PAGE凝膠加樣孔進行電泳，并轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用質(zhì)量分數(shù)5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，TBST溫和洗膜3 min，加入SIRT1(1∶ 500)或β-actin(1∶ 800)一抗，4 ℃孵育過夜，TBST洗滌3次，每次10 min，加入對應二抗(1∶ 1 000)，室溫下孵育1 h，TBST洗滌3次，每次10 min，加入配制好的ECL發(fā)光液，避光孵育5 min，化學發(fā)光凝膠成像儀中采集圖片信息。采用Image pro plus 6.0軟件進行條帶灰度分析，以β-actin為內(nèi)參照，計算SIRT1蛋白相對表達量。實驗獨立重復3次。

1.2.4

HLEB-3細胞氧化應激模型的制備 將凍存的HLEB-3細胞解凍、復蘇，使用含體積分數(shù)10%FBS的DMEM培養(yǎng)基重懸細胞并接種于96孔板中，將細胞置于37 ℃、體積分數(shù)5% CO培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每2天換液1次，細胞融合近80%時，更換為不含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)基并分別加入終濃度為0、10、20和50 mmol/L葡萄糖，每個濃度設置6個復孔，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。光學顯微鏡下觀察細胞形態(tài)學改變。

1.2.5

細胞轉(zhuǎn)染 取對數(shù)期HLEB-3細胞以2×10/孔的密度接種于6孔板，將細胞分為miR-15a對照組和miR-15a抑制劑組，按照轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000說明書分別轉(zhuǎn)染miR-15a對照和miR-15a抑制劑，每組設置6個復孔，轉(zhuǎn)染細胞8 h后，將各組細胞轉(zhuǎn)移至含50 mmol/L葡萄糖的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.6

流式細胞術(shù)檢測各組細胞凋亡率 取不同濃度葡萄糖以及各轉(zhuǎn)染組培養(yǎng)24 h的HLEB-3細胞，胰蛋白酶消化，預冷PBS洗滌2次，離心半徑10 cm，2 000 r/min離心并棄上清，將細胞重懸于200 μl結(jié)合緩沖液中，加入5 μl Annexin V-FITC混勻，室溫條件下避光反應15 min，繼續(xù)加入300 μl結(jié)合緩沖液，上樣前加入5 μl PI，于1 h內(nèi)采用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。左下象限為活細胞，左上象限為死亡細胞，右上象限為晚期凋亡細胞，右下象限為早期凋亡細胞，細胞凋亡率=早期凋亡率+晚期凋亡率。實驗獨立重復3次。將于50 mmol/L葡萄糖條件下培養(yǎng)24 h的各轉(zhuǎn)染組細胞，采用上述方法檢測細胞凋亡率。實驗獨立重復3次。

1.2.7

DCFH-DA熒光探針法檢測各組細胞內(nèi)源性ROS含量 將細胞以1×10/孔的密度接種于96孔板，用不同濃度葡萄糖培養(yǎng)24 h，吸去培養(yǎng)液，加入10 μmol/L DCFH-DA熒光探針溶液，培養(yǎng)箱中孵育20 min，預冷的PBS洗滌細胞，采用多功能酶標儀檢測熒光強度值，用激光掃描共聚焦顯微鏡拍照，設置激發(fā)光波長為485 nm，發(fā)射光波長為530 nm。實驗獨立重復3次。取50 mmol/L葡萄糖條件下培養(yǎng)24 h的各轉(zhuǎn)染組細胞，采用上述方法計算細胞內(nèi)ROS含量。實驗獨立重復3次。

1.2.8

試劑盒檢測各組細胞T-AOC、SOD、GSH-Px、GSH活性及MDA濃度 取不同濃度葡萄糖培養(yǎng)24 h的細胞以及50 mmol/L葡萄糖條件下培養(yǎng)24 h的各轉(zhuǎn)染組細胞，采用相應試劑盒說明書中的步驟，以鐵還原法檢測細胞中T-AOC活性，以黃嘌呤氧化酶法檢測SOD活性，以二硫代二硝基苯甲酸法檢測GSH-Px和GSH活性，以硫代巴比妥法檢測MDA濃度。實驗獨立重復3次。

1.2.9

實時熒光定量PCR法檢測各組細胞內(nèi)miR-15a表達 取不同濃度葡萄糖培養(yǎng)24 h的細胞，采用1.2.2方法提取并計算miR-15a的相對表達量。實驗獨立重復3次。

1.2.10

Western blot法檢測各組細胞內(nèi)SIRT1、FOXO3a、p53蛋白表達 收集不同濃度葡萄糖培養(yǎng)24 h的細胞，RIPA裂解液提取總蛋白，按照1.2.3方法進行Western blot檢測，其中SIRT1(1∶ 500)、FOXO3a(1∶ 500)、p53(1∶ 1 000)、β-actin(1∶ 800)一抗4 ℃孵育過夜，二抗(1∶ 1 000)室溫下孵育1 h。以β-actin為內(nèi)參照，計算各目的蛋白相對表達量。實驗獨立重復3次。取50 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)24 h的各轉(zhuǎn)染組細胞，以上述方法檢測細胞內(nèi)SIRT1、FOXO3a、p53蛋白的相對表達量。實驗獨立重復3次。

1.2.11

miR-15a靶基因預測及雙熒光素酶報告基因分析 為了確定miR-15a在HLEB-3細胞中發(fā)揮生物學功能的靶向作用點，利用miRanda、TargetScan數(shù)據(jù)庫預測miR-15a的潛在靶基因，其中SIRT1在miR-15a的3'UTR上有結(jié)合位點。將對數(shù)期細胞以2×10/孔的密度接種于24孔板，以Renilla熒光素酶質(zhì)粒(100 ng/孔)轉(zhuǎn)染作為對照，用Lipofectamine2000將熒光素酶報告載體[SIRT1-3'-UTR-野生型(wild type，WT)或SIRT1-3'UTR-突變型(mutant type，MUT)]與miR-15a對照和抑制劑共轉(zhuǎn)染至細胞。細胞轉(zhuǎn)染24 h，用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒測定熒光素酶活性。實驗獨立重復3次。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料經(jīng)Shapiro-Wilk檢驗呈正態(tài)分布，以表示，組間數(shù)據(jù)經(jīng)Levene檢驗方差齊。不同濃度葡萄糖條件下細胞各檢測指標差異總體比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD-

t

檢驗。miR-15a對照組和miR-15a抑制劑組間各檢測指標差異比較采用獨立樣本

t

檢驗。

P

<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組晶狀體前囊膜組織中miR-15a和SIRT1的表達比較

正常對照組中miR-15a相對表達量明顯低于DC組，差異有統(tǒng)計學意義(

t

=12.231，

P

<0.001)。正常對照組SIRT1蛋白條帶灰度明顯強于DC組，2個組間SIRT1蛋白相對表達量比較，差異有統(tǒng)計學意義(

t

=8.964，

P

<0.001)(圖1，表1)。

圖1 各組晶狀體前囊膜組織中SIRT1蛋白表達電泳圖 DC組SIRT1蛋白條帶強度較正常對照組明顯減弱 DC:糖尿病性白內(nèi)障；SIRT1：沉默信息調(diào)節(jié)蛋白1Figure 1 Electropherogram of SIRT1 protein in the anterior lens capsule The SIRT1 protein band intensity was significantly weakened in DC group in comparison with normal control group DC:diabetic cataract;SIRT1:silent information regulator 1

表1 2個組miR-15a和SIRT1蛋白相對表達量比較(x±s)Table 1 Comparison of relative expression levels of miR-15a and SIRT1 protein between two groups (x±s)組別樣本量miR-15a相對表達量SIRT1蛋白相對表達量正常對照組30.21±0.020.89±0.09DC組30.96±0.100.31±0.05t值12.2318.964P值<0.001<0.001 注:(獨立樣本t檢驗) miR:微小RNA;SIRT1:沉默信息調(diào)節(jié)蛋白1;DC:糖尿病性白內(nèi)障 Note:(Independent samples t test) miR:microRNA;SIRT1:silent information regulator 1;DC:diabetic cataract

2.2 不同濃度葡萄糖處理細胞形態(tài)學改變

0 mmol/L葡萄糖處理的HLEB-3細胞大小均一，邊緣光滑，細胞貼壁緊密。隨著葡萄糖濃度的增加，細胞形態(tài)變得不規(guī)則，細胞皺縮，貼壁松弛，細胞邊緣呈毛刺樣突起(圖2)。

圖2 不同濃度葡萄糖處理細胞形態(tài)學觀察(×200，標尺=100 μm) 0 mmol/L葡萄糖處理的細胞形狀規(guī)則，數(shù)量較多，隨著濃度的增加，細胞形狀發(fā)生改變，數(shù)量減少 A：0 mmol/L B：10 mmol/L C：20 mmol/L D：50 mmol/LFigure 2 Morphological observation of HLEB-3 cells after treatment of different concentrations of glucose (×200,bar=100 μm) Cells treated with 0 mmol/L glucose were in regular shape and the number was large.With the increase of glucose concentration,the shape of cells changed and the number decreased A:0 mmol/L B:10 mmol/L C:20 mmol/L D:50 mmol/L

表2 不同濃度葡萄糖處理細胞中miR-15a、SIRT1、FOXO3a和p53蛋白相對表達量比較(x±s)Table 2 Comparison of relative expression levels of miR-15a,SIRT1,FOXO3a and p53 proteins in HLEB-3 cells after treatment of different concentrations of glucose (x±s)葡萄糖濃度樣本量miR-15a相對表達量SIRT1蛋白相對表達量FOXO3a蛋白相對表達量p53蛋白相對表達量0 mmol/L30.21±0.050.89±0.120.18±0.040.10±0.0210 mmol/L30.43±0.07a0.65±0.08a0.32±0.03a0.31±0.03a20 mmol/L30.62±0.04ab0.41±0.06ab0.51±0.08ab0.46±0.05ab50 mmol/L30.82±0.11abc0.17±0.03abc0.66±0.04abc0.57±0.06abcF值38.90445.53450.77167.135P值<0.001<0.001<0.001<0.001 注:與0 mmol/L葡萄糖比較,aP<0.05;與10 mmol/L葡萄糖比較,bP<0.05;與20 mmol/L葡萄糖比較,cP<0.05(單因素方差分析,LSD-t檢驗) miR:微小RNA;SIRT1:沉默信息調(diào)節(jié)蛋白1;FOXO3a:叉頭轉(zhuǎn)錄因子3a Note:Compared with 0 mmol/L glucose,aP<0.05;compared with 10 mmol/L glucose,bP<0.05;compared with 20 mmol/L glucose,cP<0.05 (One-way ANOVA,LSD-t test) miR:microRNA;SIRT1:silent information regulator 1;FOXO3a:forkhead transcription factor 3a

2.3 不同濃度葡萄糖處理細胞內(nèi)miR-15a及SIRT1、FOXO3a和p53蛋白表達比較

細胞中miR-15a相對表達量隨著葡萄糖濃度的增加而增加，總體比較差異有統(tǒng)計學意義(

F

=38.904，

P

<0.001)。細胞中FOXO3a和p53蛋白條帶相對灰度值隨著葡萄糖濃度的增加而增強，SIRT1蛋白條帶相對灰度值隨著葡萄糖濃度的增加而減弱；各不同濃度葡萄糖條件下細胞中FOXO3a、p53和SIRT1蛋白相對表達量總體比較差異均有統(tǒng)計學意義(

F

=50.771、67.135、45.534，均

P

<0.001)。各不同濃度葡萄糖條件下細胞中miR-15a、FOXO3a、p53和SIRT1相對表達量兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學意義(均

P

<0.05)(圖3，表2)。

2.4 不同濃度葡萄糖處理細胞凋亡率比較

0、10、20和50 mmol/L葡萄糖處理細胞的凋亡率分別為(3.02±0.47)%、(10.20±0.91)%、(13.32±2.01)%和(25.40±1.46)%，總體比較差異有統(tǒng)計學意義(

F

=13.311，

P

<0.001)；隨著葡萄糖濃度增加，細胞凋亡率升高，組間比較差異均有統(tǒng)計學意義(均

P

<0.05)(圖4)。

2.5 不同濃度葡萄糖處理細胞內(nèi)ROS表達比較

0、10、20和50 mmol/L葡萄糖處理細胞內(nèi)源性ROS熒光強度分別為42.12±10.32、92.43±15.65、153.65±17.43和218.65±24.83，總體比較差異有統(tǒng)計學意義(

F

=11.320，

P

<0.001)；隨著葡萄糖濃度增加，ROS熒光強度隨之增強，組間比較差異均有統(tǒng)計學意義(均

P

<0.05)(圖5)。

2.6 不同濃度葡萄糖處理細胞T-AOC、SOD、GSH-Px活性和MDA濃度比較

不同濃度葡萄糖處理細胞T-AOC、SOD、GSH-Px活性和MDA濃度總體比較差異均有統(tǒng)計學意義(

F

=178.410、182.238、133.766、191.744，均

P

<0.001)；隨著葡萄糖濃度增加，細胞產(chǎn)生T-AOC、SOD、GSH-Px活性下降，MDA濃度升高，組間比較差異均有統(tǒng)計學意義(均

P

<0.05)(表3)。

圖3 各組不同濃度葡萄糖處理細胞中SIRT1、FOXO3a和p53表達電泳圖 隨著葡萄糖濃度升高，細胞中FOXO3a和p53蛋白條帶逐漸增強，SIRT1蛋白條帶逐漸減弱 SIRT1：沉默信息調(diào)節(jié)蛋白1；FOXO3a：叉頭轉(zhuǎn)錄因子3a 1：0 mmol/L葡萄糖;2：10 mmol/L葡萄糖;3：20 mmol/L葡萄糖;4：50 mmol/L葡萄糖Figure 3 Electropherogram of SIRT1,FOXO3a and p53 proteins in cells treated with different concentrations of glucose With the increase of glucose concentration,the intensity of FOXO3a and p53 protein bands increased,and the intensity of SIRT1 protein band decreased SIRT1:silent information regulator 1;FOXO3a:forkhead transcription factor 3a 1:0 mmol/L glucose;2:10 mmol/L glucose;3:20 mmol/L glucose;4:50 mmol/L glucose

圖4 不同濃度葡萄糖處理細胞凋亡率比較 A～D：0、10、20、50 mmol/L葡萄糖處理細胞流式細胞圖(FITC/PI) E：細胞凋亡率量化比較 細胞凋亡率隨著葡萄糖濃度的增加而升高 與0 mmol/L葡萄糖比較，a P<0.05；與10 mmol/L葡萄糖比較，b P<0.05；與20 mmol/L葡萄糖比較，c P<0.05(單因素方差分析，LSD-t檢驗，n=3) 1：0 mmol/L葡萄糖;2：10 mmol/L葡萄糖;3：20 mmol/L葡萄糖;4：50 mmol/L葡萄糖Figure 4 Comparison of apoptosis of HLEB-3 cells treated with different concentrations of glucose A-D:Flow cytometry of cells treated with 0，10，20，50 mmol/L glucose (FITC/PI) E:Quantitative comparison of apoptosis rates Apoptosis rate was enhanced with increasing glucose concentration Compared with 0 mmol/L glucose,a P<0.05;compared with 10 mmol/L glucose,b P<0.05;compared with 20 mmol/L glucose,c P<0.05 (One-way ANOVA,LSD-t test,n=3) 1:0 mmol/L glucose;2:10 mmol/L glucose;3:20 mmol/L glucose;4:50 mmol/L glucose

圖5 不同濃度葡萄糖處理細胞內(nèi)ROS表達比較 A～D：0、10、20、50 mmol/L葡萄糖處理細胞熒光染色圖(DCFH-DA ×400，標尺=200 μm) 隨著葡萄糖濃度的增加，ROS熒光強度隨之增強 E：不同濃度葡萄糖處理細胞ROS熒光強度量化比較 與0 mmol/L葡萄糖比較，a P<0.05；與10 mmol/L葡萄糖比較，b P<0.05；與20 mmol/L葡萄糖比較，c P<0.05(單因素方差分析，LSD-t檢驗，n=3) ROS：活性氧簇 1：0 mmol/L葡萄糖;2：10 mmol/L葡萄糖；3：20 mmol/L葡萄糖;4：50 mmol/L葡萄糖Figure 5 Comparison of ROS expression in HLEB-3 cells after treatment of different concentrations of glucose by DCFH-DA A-D:DCFH-DA staining of HLEB-3 cells treated with 0,10,20,50 mmol/L glucose (×400,bar=200 μm) The ROS fluorescence was enhanced as the glucose concentration increased E:Quantitative comparison of ROS fluorescence intensity Compared with 0 mmol/L glucose group,a P<0.05;compared with 10 mmol/L glucose group,b P<0.05;compared with 20 mmol/L glucose group,c P<0.05 (One-way ANOVA,LSD-t test,n=3) ROS:reactive oxygen species 1:0 mmol/L glucose；2:10 mmol/L glucose；3:20 mmol/L glucose；4:50 mmol/L glucose

表3 不同濃度葡萄糖處理細胞T-AOC、SOD、GSH-Px活性和MDA濃度比較(x±s)Table 3 Comparison of T-AOC,SOD,GSH-Px activities and MDA concentration in HLEB-3 cells after treatment of different concentrations of glucose (x±s)葡萄糖濃度樣本量T-AOC活性值[mol/(min·L)]SOD活性值[mol/(min·L)]GSH-Px活性值[mol/(min·L)]MDA濃度(μmol/L)0 mmol/L38.01±0.5287.32±4.21173.10±7.9232.13±1.0310 mmol/L35.32±0.39a65.34±3.11a128.34±8.03a44.92±2.01a20 mmol/L33.22±0.41ab53.02±2.97ab102.31±4.22ab58.31±3.10ab50 mmol/L31.03±0.08abc24.66±2.96abc73.66±3.86abc75.65±2.65abcF值178.410182.238133.766191.744P值<0.001<0.001<0.001<0.001 注:與0 mmol/L葡萄糖比較,aP<0.05;與10 mmol/L葡萄糖比較,bP<0.05;與20 mmol/L葡萄糖比較,cP<0.05(單因素方差分析,LSD-t檢驗) T-AOC:總抗氧化能力;SOD:超氧化物歧化酶;GSH-Px:谷胱甘肽過氧化物酶;MDA:丙二醛 Note:Compared with 0 mmol/L glucose,aP<0.05;compared with 10 mmol/L glucose,bP<0.05;compared with 20 mmol/L glucose,cP<0.05 (One-way ANOVA,LSD-t test) T-AOC:total-antioxidative capability;SOD:superoxide dismutase;GSH-Px:glutathione peroxidase;MDA:malon-dialdehyde

2.7 各轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染效率比較

細胞熒光圖顯示，miR-15a抑制物組和miR-15a對照組細胞均呈明顯綠色熒光，轉(zhuǎn)染成功，轉(zhuǎn)染率分別為90.7%和93.5%(圖6)。

2.8 不同轉(zhuǎn)染組細胞凋亡率比較

miR-15a對照組細胞凋亡率為(35.22±2.04)%，明顯低于miR-15a抑制劑組的(17.3±1.05)%，差異有統(tǒng)計學意義(

t

=10.320，

P

<0.001)(圖7)。

2.9 不同轉(zhuǎn)染組細胞ROS表達比較

miR-15a抑制劑組細胞ROS熒光強度為63.22±7.31，低于miR-15a對照組的135.31±12.33，差異有統(tǒng)計學意義(

t

=14.422，

P

<0.001)(圖8)。

2.10

不同轉(zhuǎn)染組細胞T-AOC、SOD、GSH-Px活性和MDA濃度比較miR-15a對照組細胞T-AOC、SOD、GSH-Px活性顯著低于miR-15a抑制劑組，差異有統(tǒng)計學意義(

t

=10.155、12.616、12.874，均

P

<0.001)，MDA濃度顯著高于miR-15a抑制劑組，差異有統(tǒng)計學意義(

t

=14.631，

P

<0.001)(表4)。

圖6 miR-15a抑制劑組和miR-15a對照組細胞轉(zhuǎn)染熒光圖(×200，標尺=50 μm) 各組細胞均呈明顯綠色熒光，轉(zhuǎn)染成功率高 A：miR-15a對照組 B：miR-15a抑制劑組Figure 6 Transfection fluorescence of miR-15a inhibitor group and miR-15a NC transfection group (×200,bar=50 μm) Cells in both groups showed green fluorescence with high transfection rate A:miR-15a control group B:miR-15a inhibitor group

圖7 不同轉(zhuǎn)染組流式細胞圖(FITC/PI) miR-15a對照組細胞凋亡率較miR-15a抑制劑組明顯降低 A：miR-15a對照組 B：miR-15a抑制劑組Figure 7 Flow cytometry of HLEB-3 cells in two transfection groups (FITC/PI) The apoptosis rate of miR-15a control group was significantly lower than that of miR-15a inhibitor group A:miR-15a control group B:miR-15a inhibitor group

圖8 不同轉(zhuǎn)染組細胞內(nèi)ROS熒光染色圖(DCFH-DA ×400，標尺=200 μm) miR-15a抑制劑組細胞ROS熒光微弱，miR-15a對照組細胞ROS熒光較強。DCFH-DA染色呈綠色熒光，細胞核染色呈藍色熒光(DAPI) A：miR-15a對照組 B：miR-15a抑制劑組Figure 8 Fluorescence staining of ROS expression in cells of two transfection groups (DCFH-DA ×400,bar=200 μm) The ROS fluorescence was weak in miR-15a inhibitor group and strong in miR-15a control group.DCFH-DA staining showed green fluorescence,and nuclei were in blue fluorescence (DAPI) A:miR-15a control group B:miR-15a inhibitor group

2.11

miR-15a靶基因預測miR-15a靶基因預測發(fā)現(xiàn)，miR-15a與SIRT1保守位點有高分數(shù)結(jié)合，SIRT1為miR-15a的一個潛在作用靶點(圖9)。雙熒光素酶報告系統(tǒng)結(jié)果顯示，miR-15a對照組SIRT1-3'-UTR-WT報告基因的熒光素酶活性明顯低于miR-15a抑制劑組，差異有統(tǒng)計學意義(

t

=5.978，

P

=0.004)，2個組SIRT1-3'-UTR-MUT報告基因的熒光素酶活性差異無統(tǒng)計學意義(

t

=0.432，

P

=0.688)(表5)。

表4 各轉(zhuǎn)染組細胞T-AOC、SOD、GSH-Px活性和MDA濃度比較(x±s)Table 4 Comparison of T-AOC,SOD,GSH-Px activities and MDA concentration of cells between two transfection groups (x±s)組別樣本量T-AOC活性值[mol/(min·L)]SOD活性值[mol/(min·L)]GSH-Px活性值[mol/(min·L)]MDA濃度(μmol/L)miR-15a對照組34.04±0.4851.32±2.6694.44±3.5364.76±3.66miR-15a抑制劑組38.32±0.5586.43±4.02158.96±7.9332.17±1.22t值10.15512.61612.87414.631P值0.001<0.001<0.001<0.001 注:(獨立樣本t檢驗) T-AOC:總抗氧化能力;SOD:超氧化物歧化酶;GSH-Px:谷胱甘肽過氧化物酶;MDA:丙二醛;miR:微小RNA Note:(Independent samples t test) T-AOC:total-antioxidative capabili-ty;SOD:superoxide dismutase;GSH-Px:glutathione peroxidase;MDA:malondialdehyde;miR:microRNA

圖9 miR-15a靶基因預測 生物信息軟件檢測miR-15a與SIRT1存在潛在結(jié)合位點 miR：微小RNA；SIRT1：沉默信息調(diào)節(jié)蛋白1；UTR：非翻譯區(qū)；WT：野生型；MT：突變型Figure 9 miR-15a target gene prediction Bioinformatics software detects potential binding sites of miR-15a and SIRT1 miR:microRNA;SIRT1:silent information regulator 1;UTR:untranslated region;WT:wild type;MT:mutant type

表5 miR-15a靶基因預測結(jié)果比較(x±s)Table 5 Comparison of target gene prediction of miR-15a (x±s)組別樣本量SIRT1-3'-UTR-WT報告基因的熒光素酶活性比值SIRT1-3'-UTR-MUT報告基因的熒光素酶活性比值miR-15a對照組30.52±0.071.38±0.09miR-15a抑制劑組30.97±0.111.41±0.07t值5.9780.432P值0.0040.688 注:(獨立樣本t檢驗) miR:微小RNA;SIRT1:沉默信息調(diào)節(jié)蛋白1;UTR:非翻譯區(qū);WT:野生型;MUT:突變型 Note:(Independent samples t test) miR:microRNA;SIRT1:silent information regulator 1;UTR:untranslated region;WT:wild type;MUT:mutant type

2.12

不同轉(zhuǎn)染組HLEB-3細胞SIRT1、FOXO3a和p53蛋白表達比較miR-15a對照組細胞內(nèi)SIRT1蛋白條帶相對灰度弱于miR-15a抑制劑組，F(xiàn)OXO3a和p53蛋白條帶相對灰度值均強于miR-15a抑制劑組，各組間SIRT1、FOXO3a、p53蛋白相對表達量比較，差異均有統(tǒng)計學意義(

t

=17.134、4.193、6.792，均

P

<0.001)(表6，圖10)。

表6 各轉(zhuǎn)染組細胞SIRT1、FOXO3a、p53蛋白相對表達量比較(x±s)Table 6 Comparison of relative expression levels of SIRT1,FOXO3a and p53 proteins between two transfection groups (x±s)組別樣本量SIRT1蛋白FOXO3a蛋白p53蛋白miR-15a對照組30.31±0.060.62±0.080.83±0.15miR-15a抑制劑組30.74±0.110.31±0.100.21±0.05t值17.1344.1936.792P值<0.0010.0140.001 注:(獨立樣本t檢驗) SIRT1:沉默信息調(diào)節(jié)蛋白1;FOXO3a:叉頭轉(zhuǎn)錄因子3a;miR:微小RNA Note:(Independent samples t test) SIRT1:silent information regulator 1;FOXO3a:forkhead transcription factor 3a;miR:microRNA

圖10 各轉(zhuǎn)染組細胞SIRT1、FOXO3a、p53蛋白表達電泳圖 miR-15a對照組細胞內(nèi)SIRT1蛋白條帶強度較miR-15a抑制劑組弱，F(xiàn)OXO3a和p53蛋白條帶強度較miR-15a抑制劑組強 miR：微小RNA；SIRT1：沉默信息調(diào)節(jié)蛋白1；FOXO3a：叉頭轉(zhuǎn)錄因子3aFigure 10 Electrophoretogram of SIRT1,FOXO3a and p53 proteins in cells The SIRT1 protein band intensity was weaker,and the intensity of FOXO3a and p53 protein bands was stronger in miR-15a control group than miR-15a inhibitor group miR:microRNA;SIRT1:silent information regulator 1;FOXO3a:forkhead transcription factor 3a

3 討論

近年來，miRNA在白內(nèi)障發(fā)生和發(fā)展中的作用越來越受到關注。miR-15a是近年來廣泛研究的miRNA，對視網(wǎng)膜病變和白內(nèi)障的發(fā)生有調(diào)控作用。石佳等研究發(fā)現(xiàn)，miR-15a通過炎癥反應和血管生成雙重調(diào)節(jié)作用參與糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生。Li等研究發(fā)現(xiàn)，hsa-miR-15a在正常LECs中的表達低于年齡相關性白內(nèi)障患者LECs。Liu等研究發(fā)現(xiàn)，miR-15a能影響LECs的增生、凋亡和遷移能力。本研究也發(fā)現(xiàn)，miR-15a在DC患者晶狀體前囊膜內(nèi)的表達高于正常晶狀體前囊膜，HLEB-3細胞內(nèi)miR-15a表達量隨著葡萄糖濃度的升高而增加，結(jié)合文獻推測miR-15a可能參與了白內(nèi)障的發(fā)病過程。

高糖環(huán)境誘導的LECs發(fā)生氧化應激反應是DC患者晶狀體混濁的原因之一。LECs內(nèi)產(chǎn)生大量ROS，同時抗氧化物酶失活，細胞內(nèi)氧化代謝產(chǎn)物堆積導致細胞毒性損傷，造成細胞凋亡。本研究采用不同濃度的葡萄糖處理HLEB-3細胞，結(jié)果顯示隨著葡萄糖濃度增加，細胞凋亡率升高，同時ROS活性、MDA濃度增加，而SOD、CAT、GSH-Px活性下降。

miR-15a被證實在不同疾病的氧化應激過程中發(fā)揮作用。Kamalden等研究發(fā)現(xiàn)，miR-15a通過誘導氧化應激損傷加重糖尿病病情；Cao等研究證實，miR-15a可能對高氧誘導的肺氧化應激損傷有調(diào)節(jié)作用。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-15a抑制劑組HLEB-3細胞的凋亡率明顯低于miR-15a對照組，細胞ROS活性、MDA濃度明顯低于miR-15a對照組，而SOD、CAT、GSH-Px的活性明顯高于miR-15a對照組，以上結(jié)果提示，miR-15a可能是通過抑制HLEB-3細胞的抗氧化應激能力誘導細胞凋亡，繼而加重DC患者的病情。

SIRT1能通過組蛋白脫乙?；饔谜{(diào)節(jié)下游p53、FOXO等轉(zhuǎn)錄因子的活性，減輕內(nèi)皮細胞線粒體損傷，減緩內(nèi)皮細胞氧化應激損傷。Zeng等研究證實，SIRT1在DC小鼠LECs中表達下調(diào)；劉鶴楠等研究發(fā)現(xiàn)SIRT1在糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中表達下調(diào)，且隨著糖尿病病程延長，其表達量逐漸減少。FOXO3a是FOX家族成員，是SIRT1的非組蛋白底物，SIRT1可使FOXO3a去乙酰化，激活FOXO3a的轉(zhuǎn)錄活性并增加其下游靶標的表達，從而調(diào)節(jié)細胞增生、凋亡和抗氧化能力，最終保護細胞免受氧化應激損傷。有研究證實，高糖處理的LECs中FOXO3a蛋白表達量以劑量和時間依賴性方式升高，F(xiàn)OXO3a可以作為高血糖條件下人LECs氧化應激的生物標志物。p53是SIRT1另一個重要的下游底物，正常情況下，p53處于休眠狀態(tài)，當細胞處于氧化應激損傷狀態(tài)，p53被激活，刺激下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，進而誘導細胞凋亡；而SIRT1能通過p53去乙?；瘻p少其介導的轉(zhuǎn)錄激活，從而抑制細胞凋亡。本研究也發(fā)現(xiàn)，隨著氧化應激模型中SIRT1表達降低，F(xiàn)OXO3a和p53表達升高。為了進一步探討miR-15a調(diào)控LECs氧化應激損傷的作用機制，本研究采用miRanda、TargetScan數(shù)據(jù)庫篩選SIRT1下游靶向蛋白，發(fā)現(xiàn)SIRT1為miR-15a的一個潛在作用靶點；miR-15a抑制劑組HLEB-3細胞的SIRT1蛋白表達明顯強于miR-15a對照組，F(xiàn)OXO3a和p53的表達明顯弱于miR-15a對照組。以上結(jié)果說明在HLEB-3細胞中，miR-15a通過靶向抑制SIRT1的轉(zhuǎn)錄，繼而上調(diào)其下游FOXO3a和p53的表達，導致HLEB-3細胞抗氧化能力的減弱。

綜上所述，本研究結(jié)果表明miR-15a能抑制高糖誘導下LECs的抗氧化應激損傷能力，這種作用可能是通過抑制SIRT1表達，從而上調(diào)下游底物FOXO3a和p53活性，加重細胞凋亡而實現(xiàn)的。

利益沖突

所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻聲明

南安超：實驗設計和實施、文章撰寫；南建茹、劉亞東：采集和分析數(shù)據(jù)；劉向玲：文章校對及修改