王巖璞，單守明，李 萍，韋 偉，金 悅

（寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，銀川 750021）

釀酒葡萄果實(shí)中主要酚類物質(zhì)按照化學(xué)結(jié)構(gòu)可以分為類黃酮和非類黃酮2 大類，類黃酮主要包括花色苷、黃烷醇、黃酮醇等，非類黃酮主要包括酚酸、白藜蘆醇等物質(zhì)[1]，這些酚類物質(zhì)廣泛分布于果皮、果肉和種子中，它們不但參與葡萄果實(shí)中各種代謝活動(dòng)，而且影響葡萄酒的口感、色澤和顏色穩(wěn)定性，對(duì)葡萄酒的許多感官品質(zhì)（色澤、風(fēng)味、澄清度）具有決定性作用，它還具有很強(qiáng)的抗氧化活性，是葡萄和葡萄酒中重要的保健功能成分[2-7]。葡萄果實(shí)中酚類物質(zhì)代謝是多基因控制的數(shù)量性狀，結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因共同參與酚類物質(zhì)的合成，品種、砧木、環(huán)境條件、脅迫、植物生長調(diào)節(jié)劑、成熟度和栽培措施等條件可在轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)葡萄果實(shí)中這些基因的表達(dá)和酶活性，最終影響酚類物質(zhì)的種類和含量[8-9]。研究發(fā)現(xiàn)[10]，苯丙氨酸解氨酶（PAL）、肉桂酸-4-羥化酶（C4H）、類黃酮3′-羥化酶（F3′H）、類黃酮3′,5′-羥化酶（F3′5′H）和類黃酮3-O-葡糖基轉(zhuǎn)移酶（UFGT）都是苯丙烷代謝途徑及類黃酮代謝途徑中酚類物質(zhì)合成的部分關(guān)鍵酶。寧夏賀蘭山東麓獨(dú)特的環(huán)境條件使其成為我國釀酒葡萄優(yōu)質(zhì)生態(tài)產(chǎn)區(qū)之一[11]，隨著賀蘭山東麓釀酒葡萄產(chǎn)業(yè)的發(fā)展、栽培的品種也出現(xiàn)區(qū)域化和多樣化的發(fā)展趨勢(shì)，在現(xiàn)有赤霞珠、梅鹿輒、蛇龍珠、西拉等品種的基礎(chǔ)上，已開始栽培馬瑟蘭、小味爾多等釀酒葡萄品種，以實(shí)現(xiàn)葡萄酒的多樣化發(fā)展和提高經(jīng)濟(jì)效益。

經(jīng)前人對(duì)成熟期釀酒葡萄果實(shí)類黃酮和香氣物質(zhì)組成和含量的測(cè)定發(fā)現(xiàn)[12]，馬瑟蘭中黃酮醇、黃烷醇和結(jié)合態(tài)萜烯含量較高，小味爾多游離態(tài)和結(jié)合態(tài)降異戊二烯類、游離態(tài)醛酮類香氣含量較高，2 個(gè)品種都具有種植潛力，但是并未比較2 個(gè)品種誰更突出。為此，筆者以馬瑟蘭、小味爾多為試材，通過對(duì)其果實(shí)中酚類物質(zhì)積累及其PAL、C4H、F3′H、F3′5′H和UFGT基因相對(duì)表達(dá)量的比較，為馬瑟蘭、小味爾多2 個(gè)葡萄品種提供種植理論依據(jù)和技術(shù)指導(dǎo)，旨在為寧夏賀蘭山東麓優(yōu)質(zhì)釀酒葡萄品種選擇提供更多的參考依據(jù)，以豐富寧夏產(chǎn)區(qū)釀酒葡萄種植品種。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)在寧夏賀蘭山東麓的“寧夏現(xiàn)代農(nóng)業(yè)綜合開發(fā)工程技術(shù)研究中心”釀酒葡萄試驗(yàn)園進(jìn)行。以5 年生紅色釀酒葡萄品種馬瑟蘭（Vitis viniferaL.cv.Marselan）和小味爾多（Vitis viniferaL.cv.Petit Verdot）為試材（自根苗），南北行向栽植，行株距3.0 m×0.8 m，“廠”字形樹形，葉幕高1.5 m，常規(guī)管理。試驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組重復(fù)3 次的設(shè)計(jì)方案，每個(gè)處理選擇生長勢(shì)相對(duì)一致且無病蟲害的葡萄樹30 株，負(fù)載量基本一致，分別于果實(shí)膨大期（花后45 d）、轉(zhuǎn)色前期（花后70 d）、完全轉(zhuǎn)色期（花后95 d）及采收期（花后120 d）采集各處理果實(shí)樣品，液氮速凍后貯于-84 ℃超低溫冰箱中用于生理指標(biāo)、酚類物質(zhì)含量及其合成關(guān)鍵酶基因的相對(duì)表達(dá)量的測(cè)定。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 酚類物質(zhì)的測(cè)定

取2.0 g 樣品于三角瓶中，加入5 mL 蒸餾水和45 mL 乙酸乙酯，避光振蕩30 min，收集上清液，重提3 次，合并上清液于圓底燒瓶中，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干（33 ℃，避光），2 mL 色譜甲醇定容，0.45 μm 的濾膜過濾后備用。采用島津LC-20A 高效液相色譜儀（二極管陣列檢測(cè)器）進(jìn)行測(cè)定，C18色譜柱（250 mm×4.6 mm×5 mm），流動(dòng)相A：2%甲酸水溶液，流動(dòng)相B：乙腈，流速0.8 mL/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量5 μL，檢測(cè)波長280 nm。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣品的出峰時(shí)間來確定樣品中單體酚的成分，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線來定量[13]。

1.2.2 果實(shí)品質(zhì)的測(cè)定

采用蒽酮硫酸比色法測(cè)定采收期果實(shí)中可溶性糖含量，采用NaOH 滴定法測(cè)定可滴定酸含量，采用福林-肖卡法測(cè)定單寧含量，采用福林酚法測(cè)定總酚含量，采用比色法測(cè)定花色苷含量[14]。

1.2.3 總RNA 的提取及熒光定量PCR

用多糖多酚植物總 RNA 提取試劑盒（TIANGEN）提取果實(shí)的總RNA。以總RNA 為模板，用Takara PrimeScriptTMRT regent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。內(nèi)參基因?yàn)閂vEF，苯丙氨酸解氨酶（PAL）、肉桂酸-4-羥化酶（C4H）、類黃酮3′-羥化酶（F3′H）、類黃酮3′,5′-羥化酶（F3′5′H）、類黃酮3-O-葡糖基轉(zhuǎn)移酶（UFGT）的引物序列如表1。PCR 反應(yīng)體系為1 μL的cDNA（模板濃度200 ng/μL），上、下游引物各0.5 μL，12.5 μL 的2×UltraSYBR Mixture（CWBIO），10.5 μL 的ddH2O，試驗(yàn)結(jié)果采用2-△△CT進(jìn)行相對(duì)定量計(jì)算[15]。

表1 熒光定量PCR 引物序列

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

使用SPSS 23.0 和Excel 2010 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，用Origin 2018 進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 2 個(gè)品種果實(shí)中酚類物質(zhì)含量比較

從圖1 可以看出，馬瑟蘭與小味爾多果實(shí)中酚酸類物質(zhì)隨著果實(shí)的發(fā)育不斷下降，花后95 d 達(dá)到最小值，極顯著低于其他時(shí)期。在花后45 d 和70 d時(shí)，小味爾多果實(shí)中酚酸類物質(zhì)含量均極顯著高于馬瑟蘭；在花后95 d 和120 d 時(shí)，馬瑟蘭果實(shí)中酚酸類物質(zhì)含量均極顯著高于小味爾多。

圖1 不同發(fā)育期馬瑟蘭與小味爾多酚類物質(zhì)含量比較

隨著果實(shí)的發(fā)育，2 個(gè)品種果實(shí)中的黃烷醇與黃酮醇類物質(zhì)含量不斷升高，分別在花后70 d 和花后95 d 時(shí)達(dá)到最高值，之后開始下降。在花后45 d和70 d 時(shí)，小味爾多果實(shí)中黃烷醇類物質(zhì)含量均極顯著高于馬瑟蘭，在果實(shí)采收期，二者間黃烷醇含量無顯著差異（圖1）。

白藜蘆醇含量隨著果實(shí)發(fā)育總體呈上升趨勢(shì)，花后70 d 時(shí)為第1 個(gè)積累高峰，馬瑟蘭增長速率最快，為98.35%?；ê?20 d 時(shí)，白藜蘆醇含量迅速積累，其含量在5.87～9.70 mg/kg 之間，極顯著高于其他時(shí)期。在花后70 d 和120 d，馬瑟蘭果實(shí)中白藜蘆醇含量均極顯著高于小味爾多（圖1）。

采收期馬瑟蘭與小味爾多果實(shí)中酚酸類物質(zhì)總含量無顯著差異（表2）。在6 種酚酸類物質(zhì)中，以沒食子酸含量最高，占酚酸總含量的35.6%～66.2%；綠原酸含量最低，占酚酸總含量的3.2%～5.1%。馬瑟蘭果實(shí)中咖啡酸、綠原酸、苯甲酸和水楊酸含量比小味爾多高70.3%～199.2%，差異達(dá)到極顯著水平；但是沒食子酸含量比小味爾多低43.1%，差異也達(dá)到極顯著水平。

表2 馬瑟蘭與小味爾多采收期果實(shí)中酚類物質(zhì)含量

黃烷醇類物質(zhì)是果實(shí)中含量比例最高的一類酚類物質(zhì)（表2）。在所測(cè)4 種黃烷醇類物質(zhì)中，以兒茶素含量最高，占黃烷醇類物質(zhì)總含量的62.2%～80.7%；表沒食子兒茶素沒食子酸酯含量最低，占馬瑟蘭果實(shí)中黃烷醇類物質(zhì)總含量的4.1%左右。馬瑟蘭果實(shí)中兒茶素和表兒茶素分別比小味爾多低19.0%和32.5%，差異達(dá)到極顯著水平。在小味爾多果實(shí)中兒茶素沒食子酸酯和表沒食子兒茶素沒食子酸酯含量均較低。

馬瑟蘭和小味爾多果實(shí)中黃酮醇類物質(zhì)總含量分別占總酚類物質(zhì)含量的5.8%和10.2%（表2）。在6 種黃酮醇類物質(zhì)中，以蘆丁含量最高，占黃酮醇類物質(zhì)總含量的76.2%～87.6%；馬瑟蘭果實(shí)中桑色素含量最低，占黃酮醇類總含量的0.1%，小味爾多果實(shí)中山奈酚含量最低，占黃酮醇類總含量的0.2%左右。馬瑟蘭果實(shí)中槲皮素、山奈酚、白藜蘆醇物質(zhì)含量分別比小味爾多高88.5%、232.1%和65.2%，而蘆丁、柚皮苷和桑色素分別比小味爾多低50.5%、45.5%和95.5%，差異均達(dá)到極顯著水平。

對(duì)采收期馬瑟蘭與小味爾多果實(shí)中17 種酚類物質(zhì)成分進(jìn)行主成分分析，結(jié)果如圖2、圖3 所示，第一主成分的貢獻(xiàn)率為95.7%，第二主成分的貢獻(xiàn)率為4.0%，累計(jì)貢獻(xiàn)率為99.7%。由載荷圖可知：咖啡酸（1）、苯甲酸（4）、水楊酸（6）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（9）、兒茶素沒食子酸酯（10）、山奈酚（16）、白藜蘆醇（17）位于第一象限，與PC1和PC2 呈正相關(guān)。而沒食子酸（5）、兒茶素（7）、表兒茶素（8）、蘆?。?1）、柚皮苷（12）、桑色素（14）與PC1 和PC2 呈負(fù)相關(guān)。綠原酸（2）、阿魏酸（3）、楊梅素（13）、槲皮素（15）位于第四象限，與PC1 呈正相關(guān)，與PC2 呈負(fù)相關(guān)。結(jié)合圖2 和圖3 可知，馬瑟蘭的特征酚類物質(zhì)為高含量的咖啡酸（1）、苯甲酸（4）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（9）、兒茶素沒食子酸酯（10）、白藜蘆醇（17），小味爾多果實(shí)中特征酚類物質(zhì)為高含量的沒食子酸（5）、兒茶素（7）、表兒茶素（8）和蘆?。?1）。

圖2 馬瑟蘭與小味爾多成熟期果實(shí)單體酚組分主成分得分圖

圖3 馬瑟蘭與小味爾多采收期果實(shí)單體酚組分主成分載荷圖

2.2 2 個(gè)品種酚類物質(zhì)合成關(guān)鍵酶基因相對(duì)表達(dá)量的比較

對(duì)苯丙烷代謝途徑及類黃酮代謝途徑中酚類物質(zhì)合成的部分關(guān)鍵基因表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖4 所示。在整個(gè)轉(zhuǎn)色期小味爾多的VvPAL保持較高表達(dá)水平，轉(zhuǎn)色前期馬瑟蘭的VvPAL表達(dá)極顯著低于小味爾多；隨著果實(shí)轉(zhuǎn)色，VvPAL上調(diào)表達(dá)，完全轉(zhuǎn)色期（花后95 d）二者無顯著差異。隨后VvPAL基因表達(dá)量下降，采收期馬瑟蘭VvPAL相對(duì)表達(dá)量極顯著高于小味爾多。

由圖4 可知，隨著果實(shí)轉(zhuǎn)色，馬瑟蘭和小味爾多果實(shí)中VvC4H基因表達(dá)量不斷升高，完全轉(zhuǎn)色期小味爾多果實(shí)中VvC4H相對(duì)表達(dá)量極顯著高于其他時(shí)期，采收期馬瑟蘭VvC4H表達(dá)量極顯著高于其他時(shí)期。在果實(shí)發(fā)育各個(gè)時(shí)期，小味爾多果實(shí)中VvF3′H基因保持較高表達(dá)水平，除完全轉(zhuǎn)色期外均極顯著高于相同時(shí)期的馬瑟蘭。完全轉(zhuǎn)色期馬瑟蘭果實(shí)中VvF3′H的相對(duì)表達(dá)量最高，極顯著高于轉(zhuǎn)色前期。

圖4 不同發(fā)育期馬瑟蘭與小味爾多酚類物質(zhì)合成關(guān)鍵酶基因相對(duì)表達(dá)量比較

馬瑟蘭果實(shí)中VvF3′5′H的相對(duì)表達(dá)量在轉(zhuǎn)色前期和完全轉(zhuǎn)色期很高，均極顯著高于采收期；在轉(zhuǎn)色前期和完全轉(zhuǎn)色期也均極顯著高于小味爾多。在果實(shí)采收期，小味爾多果實(shí)中VvF3′5′H的相對(duì)表達(dá)量極顯著高于馬瑟蘭，也極顯著高于小味爾多其他時(shí)期（圖4）。

馬瑟蘭與小味爾多果實(shí)中VvUFGT基因相對(duì)表達(dá)量的變化規(guī)律一致，在完全轉(zhuǎn)色期其相對(duì)表達(dá)量最高，此時(shí)小味爾多果實(shí)中VvUFGT相對(duì)表達(dá)量極顯著高于其他時(shí)期，也極顯著高于馬瑟蘭。馬瑟蘭果實(shí)中VvUFGT相對(duì)表達(dá)量在轉(zhuǎn)色前期和完全轉(zhuǎn)色期無顯著差異，均極顯著高于采收期（圖4）。

2.3 2 個(gè)品種果實(shí)品質(zhì)的比較

在果實(shí)采收期，馬瑟蘭果實(shí)的平均單果重比小味爾多低20.1%，差異達(dá)到極顯著水平；其果實(shí)中可溶性糖、可滴定酸含量分別比小味爾多高4.8%和3.2%，但差異不顯著。馬瑟蘭果實(shí)中花色苷含量比小味爾多高19.6%，差異顯著；但是其果實(shí)中單寧、總酚含量分別比小味爾多低75.0%和24.3%，差異均達(dá)到極顯著水平（表3）。

表3 馬瑟蘭與小味爾多的果實(shí)品質(zhì)

3 討論與結(jié)論

果實(shí)中酚類物質(zhì)是葡萄酒中酚類物質(zhì)的主要來源，酚類物質(zhì)的組成和含量影響葡萄酒的口感、色澤和穩(wěn)定性，對(duì)葡萄酒的保健品質(zhì)指標(biāo)也具有決定性作用[2-6]。王瑜等[7]研究發(fā)現(xiàn)，馬瑟蘭果皮中單寧和總酚含量低于蛇龍珠，但是五大類花色苷總含量顯著高于蛇龍珠。本研究結(jié)果表明，在采收期馬瑟蘭和小味爾多果實(shí)中酚酸類和黃烷醇類物質(zhì)總含量無顯著差異，但是馬瑟蘭果實(shí)中白藜蘆醇含量極顯著高于小味爾多，其黃酮醇類物質(zhì)總含量極顯著低于小味爾多。這表明，品種間基因型不同是果實(shí)中各種酚類物質(zhì)積累差異產(chǎn)生的主要原因[16]。

主成分分析法廣泛應(yīng)用在果實(shí)品質(zhì)評(píng)價(jià)和新品種引選等方面[17]，本研究通過將采收期馬瑟蘭和小味爾多果實(shí)中17 種酚類物質(zhì)進(jìn)行主成分分析，結(jié)果表明，馬瑟蘭果實(shí)中特征的酚類物質(zhì)是高含量的咖啡酸、苯甲酸、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、兒茶素沒食子酸酯和白藜蘆醇，小味爾多果實(shí)中特征酚類物質(zhì)是高含量的沒食子酸、兒茶素和表兒茶素以及蘆丁。小味爾多果實(shí)的單寧和總酚含量均極顯著高于馬瑟蘭，這說明，馬瑟蘭果實(shí)中酚類物質(zhì)均衡，花色苷含量高，小味爾多果實(shí)中酚類物質(zhì)特征更突出，單寧高，收斂性更強(qiáng)。

PAL 是葡萄果實(shí)中酚類物質(zhì)合成的第一個(gè)關(guān)鍵酶，調(diào)節(jié)釀酒葡萄果實(shí)中VvPAL、VvC4H等基因的表達(dá)和酶活性，可顯著提高采收時(shí)果實(shí)中酚類物質(zhì)的含量和組成[18-21]。本研究結(jié)果表明，在果實(shí)采收期，馬瑟蘭果實(shí)中這些基因的相對(duì)表達(dá)量均極顯著高于小味爾多，果實(shí)中咖啡酸、白藜蘆醇含量也均極顯著高于小味爾多，阿魏酸和總花色苷含量均顯著高于小味爾多，這表明這些基因的相對(duì)表達(dá)量與相關(guān)酚類物質(zhì)的積累基本一致。劉思凡等對(duì)6 個(gè)歐山種紅色釀酒葡萄品種果實(shí)成熟期進(jìn)行單體酚含量和基因相對(duì)表達(dá)量測(cè)定，發(fā)現(xiàn)酚類物質(zhì)的種類和含量在不同葡萄品種間呈顯著差異，這主要與葡萄果實(shí)中酚類合成基因的調(diào)控有關(guān)，且花色苷和酚類物質(zhì)受VvPAL、VvC4H、VvF3′H、VvF3′5′H等基因調(diào)控[10]。

葡萄中柚皮素等上游酚類物質(zhì)在F3′H、F3′5′H等酶的作用下逐步合成二氫黃酮醇類物質(zhì)，隨后在UFGT 等酶的作用下形成穩(wěn)定的花色苷，環(huán)境、栽培條件、植物生長調(diào)節(jié)劑等調(diào)節(jié)這些基因的表達(dá)，也能提高沒食子酸等酚酸類和表兒茶素、蘆丁、桑色素等黃酮類物質(zhì)的含量[22-24]。本研究結(jié)果表明，在轉(zhuǎn)色前期，小味爾多果實(shí)中VvPAL、VvF3′H基因的相對(duì)表達(dá)量均一直處于高水平，且顯著高于馬瑟蘭，在采收期小味爾多VvF3′H、VvF3′5′H、VvUFGT表達(dá)量均極顯著高于馬瑟蘭，在采收期，小味爾多果實(shí)中單寧、總酚、沒食子酸、兒茶素和蘆丁均極顯著高于馬瑟蘭，這表明調(diào)節(jié)VvF3′H、VvF3′5′H、VvUFGT等基因表達(dá)也可顯著影響小味爾多果實(shí)中單寧、總酚和花色苷的含量。這與喬子純等[25]的研究結(jié)果相似。因此，酚類物質(zhì)合成關(guān)鍵酶基因的時(shí)空差異表達(dá)可造成馬瑟蘭與小味爾多果實(shí)中酚類物質(zhì)組成和含量的顯著差異。2 個(gè)葡萄品種都適合寧夏產(chǎn)區(qū)栽培，在果實(shí)采收期，酚類物質(zhì)的積累小味爾多優(yōu)于馬瑟蘭。