華玲玲，韋慶華，李慧敏，朱旭東，王鵬凱*

（蘇州農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學院，江蘇蘇州 215008）

姬玉露的常規(guī)繁殖方式為種子繁殖和分株繁殖，這些繁殖方法的繁殖系數(shù)無法與組織培養(yǎng)繁育方法相比，生長周期長且育苗速度較慢，無法滿足實際種苗生產(chǎn)的需要[3]。因此，采用植物組織培養(yǎng)方法可以較好地解決這些問題。組織培養(yǎng)繁育技術(shù)進行種苗生產(chǎn)性擴繁，具有培養(yǎng)周期短、擴繁效率高的優(yōu)點，能夠為姬玉露優(yōu)質(zhì)種苗的快速繁育提供有效途徑。因此，建立高效的姬玉露組織培養(yǎng)繁育技術(shù)體系也越來越迫切。與姬玉露同屬的康平壽[4]、毛玉露[5]、克里克特壽[6]、和白銀壽[7]等多肉植物都已經(jīng)進行了組織培養(yǎng)繁育技術(shù)體系研發(fā)[8-9]，并有相關(guān)的報道。姬玉露作為新品種，也開發(fā)有相應(yīng)的組織培養(yǎng)技術(shù)體系。為此，通過組織培養(yǎng)這種無性繁殖的方式，研究建立適用于姬玉露組培與快速繁育方法的技術(shù)體系，快速繁育優(yōu)良姬玉露苗，以滿足市場上的大量需求。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

組織培養(yǎng)起始外植體取材于蘇州農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學院蘇州市相城校區(qū)科技園。選擇植株正常生長、葉片無病蟲害且健壯的姬玉露植株所結(jié)種子消毒后長成的無菌苗作為外植體供體，取其葉片和葉芽作為外植體進行組織培養(yǎng)擴繁試驗。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體消毒。將姬玉露種子用自來水沖洗1～2h，再用清水浸泡30min，將剩余種子放入2%NaClO 溶液中滅菌10min，無菌水沖洗至少5 次后，置于無菌濾紙上吸干放在MS 基本培養(yǎng)基上。經(jīng)過3 周的培養(yǎng)形成無菌苗作為外植體供體。

1.2.2 誘導培養(yǎng)。選用MS 為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加不同植物生長調(diào)節(jié)劑配制誘導培養(yǎng)基，將姬玉露無菌苗切除多余組織后，從基部切下葉片和芽作為外植體進行不定芽誘導培養(yǎng)。同時葉外植體采用平放、豎插以及去頂端平放的方式觀察不同接種形式對不定芽誘導培養(yǎng)的影響。每20d 更換1 次培養(yǎng)基，保證培養(yǎng)環(huán)境穩(wěn)定，養(yǎng)分充足。

1.2.3 增殖培養(yǎng)。將誘導培養(yǎng)過程中在愈傷組織上形成的不定芽，分別移植到不同的增殖培養(yǎng)基（表1）內(nèi)進行進一步的增殖培養(yǎng)。增殖培養(yǎng)效果統(tǒng)計后轉(zhuǎn)換為不定芽增殖率和增殖系數(shù)進行對比，以確定增殖培養(yǎng)基的效果。每20d 更換1 次培養(yǎng)基，保證培養(yǎng)環(huán)境穩(wěn)定，養(yǎng)分充足。不定芽增殖率（%）=（發(fā)生不定芽增殖苗數(shù)/接種總數(shù)）×100；增殖系數(shù)=增殖完成后獲得不定芽數(shù)/接種總數(shù)

表1 組織培養(yǎng)研究使用培養(yǎng)基配方

1.2.4 生根誘導。將增殖培養(yǎng)獲得的不定芽進行分離，分別轉(zhuǎn)接到不同的生根培養(yǎng)基內(nèi)（表1），進行生根培養(yǎng)，培養(yǎng)效果通過統(tǒng)計計算生根率。

1.2.5 馴化移栽。選擇根系生長健壯的幼苗放入溫室馴化1～2d，按60%濕度的標準拌土，將土平鋪到穴盤中。再將培養(yǎng)基瓶口打開，取出幼苗，捏住幼苗頂部將根系放入多菌靈溶液中蘸2～3s，取出移植到穴盤中。

1.3 培養(yǎng)條件

組織培養(yǎng)溫度[8-9]22℃（±2℃），濕度50%～60%，室內(nèi)培養(yǎng)階段光照強度為2000Lx；煉苗移栽階段應(yīng)選擇空氣流通、有散射光的培養(yǎng)環(huán)境，培養(yǎng)溫度在15～28℃，空氣濕度70%～90%，需要嚴格監(jiān)控土壤水分，防止水分過多造成生長不良。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同植物生長調(diào)節(jié)劑、濃度及接種方式對姬玉露不定芽誘導的影響

誘導培養(yǎng)10d 后，部分接種外植體的基部切割面邊緣處開始分化，出現(xiàn)黃綠色的顆粒狀疏松愈傷；此愈傷經(jīng)過10d 的培養(yǎng)，繼續(xù)膨大形成透明顆粒狀愈傷組織（圖4-A）；更換1 次培養(yǎng)基后經(jīng)過10d 的培養(yǎng)，愈傷組織繼續(xù)生長，在其頂部出現(xiàn)圓形的隆起，隨后在隆起部位的愈傷組織開始分化成不定芽（圖4-B）。

試驗結(jié)果顯示，外植體擺放方式和外植體種類對不定芽形成存在影響。經(jīng)過比較發(fā)現(xiàn)，以葉片作為外植體豎直插入培養(yǎng)基的培養(yǎng)效果最好，但是芽作為外植體的不定芽誘導效果明顯優(yōu)于豎直插入培養(yǎng)基的葉。因此，在外植體充足的情況下，可以直接選用芽作為外植體進行初代培養(yǎng)，如果材料較少，可以使用葉片作為外植體先擴大材料基數(shù)，再進行培養(yǎng)。但在培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)，葉片平放在培養(yǎng)基上雖然萌動較快，但是玻璃化現(xiàn)象[10]較為嚴重，可以用增加初代培養(yǎng)、繼代培養(yǎng)次數(shù)來解決此問題。

圖1 不同激素組合、濃度及接種方式對姬玉露不定芽形成的影響

本研究中使用的4 種誘導培養(yǎng)基（P1-P4，表1）中，除P4培養(yǎng)基（6-BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L）外，其他3種培養(yǎng)基在以芽為外植體的誘導試驗中均可以達到100%的誘導率。以葉片為外植體的誘導試驗中，4 種培養(yǎng)基中P1（6-BA 0.5mg/L+NAA 0.2mg/L）的誘導率最高，在葉片豎直插入培養(yǎng)基的情況下可以達到76.5%。

2.2 不同植物生長調(diào)節(jié)劑添加量對姬玉露不定芽增殖的影響

將誘導培養(yǎng)基中得到的不定芽直接接種于增殖培養(yǎng)基中進行增殖培養(yǎng)，經(jīng)過10d 的培養(yǎng)后芽基部繼續(xù)膨大，形成葉片形態(tài)；再經(jīng)過10d 的培養(yǎng)，會在葉片內(nèi)部繼續(xù)形成新的不定芽，并長出新葉片（圖4-C）。試驗結(jié)果顯示，以誘導培養(yǎng)中形成的不定芽為外植體在P6培養(yǎng)基（6-BA 0.8mg/L+NAA 0.1mg/L）中的增殖率和增殖系數(shù)最高，可以達到90.5%和6.27，（圖2）。試驗過程中也嘗試使用增殖培養(yǎng)基（P5-P7）直接對無菌芽進行誘導，發(fā)現(xiàn)玻璃化情況嚴重，無法形成正常的不定芽。

圖2 不同植物生長調(diào)節(jié)劑添加量對姬玉露不定芽增殖效率的影響

2.3 姬玉露生根誘導培養(yǎng)中IBA 效果

將生長健壯的不定芽從增殖培養(yǎng)基接種到生根培養(yǎng)基中，經(jīng)過10d 的生根培養(yǎng)，芽的基部生長出白色細長的根，長度約1.8cm。同時，在基部莖段位置也可以持續(xù)長出新的芽（圖4-D）。經(jīng)過20d 的生根培養(yǎng)，根系生長粗壯，可以形成正常完整的植株結(jié)構(gòu)。經(jīng)過MS（生根率72.4%）和1/2MS（生根率81.0%）對比試驗結(jié)果可以看出，對于姬玉露而言，基本培養(yǎng)基選用1/2MS 更為適合生根誘導，附加的活性炭可使生根率在原有基礎(chǔ)上增加10%。IBA 在0～0.1mg/L 的范圍內(nèi)，隨著IBA 用量的增加，出現(xiàn)了生根率降低的結(jié)果（圖3）。因此，姬玉露誘導生根可以不添加激素。

圖3 IBA 使用對姬玉露誘導生根的影響

圖4 姬玉露組織培養(yǎng)生長過程

2.4 多芽和單芽組培苗煉苗移栽的影響

將生根的組培苗按多芽和單芽分別進行煉苗移栽培養(yǎng)1 周后，2 種組培苗都能適應(yīng)新環(huán)境并生長，但1 周后多芽組培苗的生長狀態(tài)明顯好于單芽組培苗，2 周后單芽組培苗約30%出現(xiàn)萎縮發(fā)黃現(xiàn)象。

3 結(jié)論與討論

誘導培養(yǎng)過程中姬玉露葉片不同的接種方式（包括平放、豎放、去端平放）結(jié)果顯示出豎放最佳，其次平放，去端平放為最差。而以芽作為外植體誘導成功率明顯好于葉片。因此，在姬玉露組織培養(yǎng)擴繁過程中，外植體充足的情況下可以直接選用芽作為外植體進行初代培養(yǎng)，如果材料較少，可以使用葉片作為外植體先擴大材料基數(shù)，再進行培養(yǎng)。通過觀察植物生長調(diào)節(jié)素的不同濃度發(fā)現(xiàn)，以芽作為外植體對激素濃度變化并不敏感，但以葉為外植體，則對激素濃度和激素種類變化會在誘導率上形成差別。因此，姬玉露葉片初代培養(yǎng)基以MS+0.5mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+5g/L 瓊脂+30g/L蔗糖為宜。

姬玉露不定芽增殖過程中，6-BA 在0.6～1.0mg/L范圍內(nèi)都可以使不定芽進行增殖，最終結(jié)果顯示，在添加0.8mg/L 6-BA 和0.1mg/L NAA 的增殖培養(yǎng)基中，叢生芽數(shù)量較多，增殖系數(shù)可達6 以上。同時，培養(yǎng)結(jié)束時，在6-BA 濃度最高的培養(yǎng)基中增殖效率最低，且出現(xiàn)了明顯的玻璃化現(xiàn)象。同時，試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，增殖培養(yǎng)基無法直接用于不定芽誘導，玻璃化情況嚴重，無法形成正常的不定芽。這說明姬玉露對細胞分裂素濃度比較敏感，后期可以在細胞分裂素種類和用量上進行進一步的優(yōu)化，爭取將不定芽誘導和增殖培養(yǎng)步驟合并，簡化培養(yǎng)步驟。

生根誘導培養(yǎng)基為1/2MS+2g/L 活性炭，不添加任何植物生長調(diào)節(jié)劑。培養(yǎng)材料接種后經(jīng)20d 培養(yǎng)后可以形成根系，生根率為81.0%。比較培養(yǎng)結(jié)果后還發(fā)現(xiàn)，活性炭用量的增加雖然不會影響生根率，但會增加根系形成的時間，如在只添加5g/L 活性炭的培養(yǎng)基中，葉片外植體經(jīng)過30d 的培養(yǎng)才能形成根系。值得注意的是，培養(yǎng)材料在不加IBA 的培養(yǎng)基中生根率最高，相比于原有加激素的情況，可進一步降低生產(chǎn)成本。

姬玉露煉苗移栽過程中，應(yīng)選用疏松透氣、排水良好、不易結(jié)塊的基質(zhì)，試驗中以草炭土︰蛭石︰珍珠巖為3︰2︰1 的基質(zhì)作為培養(yǎng)基質(zhì)。光照過強、濕度過大、大棚內(nèi)溫度過高等多種因素，都會導致馴化移栽后組培苗出現(xiàn)萎縮發(fā)黃現(xiàn)象。移栽試驗結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，單芽較多芽組胚苗更為脆弱，可作為后期工廠化生產(chǎn)的質(zhì)控依據(jù)。多肉植物栽培本身就要求嚴格控制環(huán)境條件[11]，必須在通風良好、有散射光，溫度在15～28℃的環(huán)境下生長，不可曝曬，也不可沒有光照。同時，不宜過分澆水，無光和過度濕潤的環(huán)境下都會導致姬玉露徒長；若是徒長，可通過砍頭等方式進行處理。剛移栽或者生長情況較差的植株不用施肥，等植株生長較為健壯之后，每月可對其施肥1 次，從而確保姬玉露的健康生長。姬玉露組織培養(yǎng)研究有利于其市場推廣，也為后期品種選育提供技術(shù)支撐。