范華雨，李慧敏，朱旭東，王鵬凱，韋慶華

（蘇州農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇蘇州 215008）

鐵皮石斛又叫黑節(jié)草、鐵皮斗，是蘭科草本植物。莖直立，圓柱形，屬補(bǔ)益藥中的補(bǔ)陰藥，具有益胃生津、滋陰清熱、潤(rùn)肺益腎、明目強(qiáng)腰、降血糖、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等功效[1-2]。鐵皮石斛常見(jiàn)的繁殖方法主要有離體快繁和分株扦插。離體快繁是利用石斛生長(zhǎng)點(diǎn)組織，消毒之后將其接入提供生長(zhǎng)繁殖所需的培養(yǎng)基里，放入特定的溫光環(huán)境，進(jìn)行無(wú)菌培養(yǎng)的過(guò)程，實(shí)現(xiàn)植物組織快速繁殖，提高農(nóng)業(yè)生產(chǎn)力，增加經(jīng)濟(jì)收益[3-4]。近年來(lái)，關(guān)于鐵皮石斛組織培養(yǎng)及快速繁殖的研究頗多，用于外植體的有種子、無(wú)菌苗幼苗莖段、原球莖及人工種子等[5-6]。而增殖分化與培養(yǎng)基的選擇有不同的結(jié)論，需要作進(jìn)一步驗(yàn)證。

鐵皮石斛組培苗可在培養(yǎng)容器內(nèi)開(kāi)花。植物的瓶?jī)?nèi)開(kāi)花受許多因素控制，如植物激素含量、外植體大小和培養(yǎng)條件，如培養(yǎng)的溫度、光照、培養(yǎng)基的pH 值和糖含量等[7]。探究鐵皮石斛瓶?jī)?nèi)開(kāi)花，一可用作組培微景觀材料，二可提供研究所需的種子資源材料，三可用來(lái)進(jìn)行雜交選育新品種，四可探究影響瓶苗開(kāi)花的原因，提高快繁商品苗的生產(chǎn)效率。李茹等[8-9]研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中添加適量的外源腐胺和精胺，可提高開(kāi)花率，在培養(yǎng)基中添加不同濃度的多效唑后，鐵皮石斛組培苗開(kāi)花率均顯著提高。李茹等[7]發(fā)現(xiàn)，以LED 光質(zhì)中的紅+藍(lán)+綠光復(fù)合照射鐵皮石斛組培苗，有利于其在瓶?jī)?nèi)開(kāi)花，且花期早，開(kāi)花率高。王兆春等[10]發(fā)現(xiàn)低溫刺激和干旱脅迫可誘導(dǎo)石斛組培苗開(kāi)花?？梢?jiàn)，要想提高瓶?jī)?nèi)開(kāi)花數(shù)還需要從多方面考慮。

為此，本研究設(shè)置不同培養(yǎng)基的配方，采取單因素試驗(yàn)分析方法，研究不同培養(yǎng)基配方對(duì)鐵皮石斛瓶苗增殖生根和瓶?jī)?nèi)開(kāi)花進(jìn)程的影響，以期尋找適宜鐵皮石斛瓶苗快速生長(zhǎng)和瓶?jī)?nèi)開(kāi)花的最佳配方。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)設(shè)在江蘇省蘇州市蘇州農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院相城科技園綜合示范基地組培實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，鐵皮石斛瓶苗來(lái)源于本組培室自有保存種質(zhì)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 增殖培養(yǎng)。挑選無(wú)菌、長(zhǎng)勢(shì)一致的鐵皮石斛瓶苗待用。進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室前先進(jìn)行初步消毒，經(jīng)過(guò)風(fēng)淋室再次進(jìn)行全身消毒。然后進(jìn)入無(wú)菌操作實(shí)驗(yàn)室，換上無(wú)菌工作服，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。首先，用配置好的新潔爾滅溶液進(jìn)行手部消毒，然后用鑷子夾取酒精棉，擦拭超凈工作臺(tái)進(jìn)一步消毒。鐵皮石斛為叢生苗，為了更好觀察統(tǒng)計(jì)瓶苗增殖生根生長(zhǎng)狀態(tài)，接種時(shí)把叢生的鐵皮石斛苗分切成單株苗。將初代形成的叢生芽分別轉(zhuǎn)接到不同的繼代培養(yǎng)基（表1）內(nèi)進(jìn)行進(jìn)一步培養(yǎng)，每瓶接4 株苗，進(jìn)行增殖培養(yǎng)，每種培養(yǎng)基接種30 瓶。增殖系數(shù)（%）=增殖完成后植株數(shù)/接種植株總數(shù)。

1.2.2 生根培養(yǎng)。將繼代培養(yǎng)好的芽切出，分別轉(zhuǎn)接到不同的生根培養(yǎng)基內(nèi)（表1），進(jìn)行生根培養(yǎng)，計(jì)算生根率。生根率（%）=（生根苗數(shù)/接種總數(shù)）×100。

1.2.3 開(kāi)花培養(yǎng)。在前期研究的基礎(chǔ)上，探究不同激素含量的培養(yǎng)基對(duì)鐵皮石斛增殖生根和后續(xù)開(kāi)花的影響。統(tǒng)計(jì)了6 種不同的增殖和生根培養(yǎng)基接種后的開(kāi)花進(jìn)程（表1），進(jìn)行鐵皮石斛瓶?jī)?nèi)開(kāi)花的探究。30d 統(tǒng)計(jì)一次生長(zhǎng)開(kāi)花情況，60d 后測(cè)定開(kāi)花指標(biāo)。主要測(cè)定開(kāi)花株數(shù)、花期，計(jì)算開(kāi)花率，開(kāi)花率（%）=開(kāi)花株數(shù)（株）/接種有效株數(shù)（株）×100。

表1 組織培養(yǎng)研究使用培養(yǎng)基配方

保持溫度在24～26℃，濕度在55%～60%，光強(qiáng)設(shè)置為30μmol/m2·s，光周期為12h/d，培養(yǎng)周期為60d。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

采用office2019 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析，其中顯著性差異采用SPSS16.0 系統(tǒng)中的Duncan 法進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基對(duì)鐵皮石斛增殖的影響

由表2 可知，P6培養(yǎng)的瓶苗增殖率最高，其次為P5，再者為P1；三者均顯著高于其他3 個(gè)，分別較P3高43.64%、25.00%和12.94%，分別較P2高50.57%、31.03%和18.39%，分別較P4高65.82%、44.30%和30.37%?？梢钥闯?，在保持6-BA 和ABA 的含量相同的情況下，改變NAA 的含量，NAA 含量越低增殖系數(shù)越高；在保持6-BA 和NAA 的含量相同的情況下，改變ABA 的含量，ABA 含量越高增殖系數(shù)越高。可見(jiàn)，BA 1.0+NAA 0.1mg/L+ZT 0.5mg/L 為鐵皮石斛最佳增殖培養(yǎng)基配方。

表2 不同培養(yǎng)基對(duì)鐵皮石斛增殖的影響

2.2 不同培養(yǎng)基對(duì)鐵皮石斛生根的影響

由表3 可知，P10下瓶苗的生根率最高，其次為P9；二者顯著高于其他2 個(gè)，分別較P8高51.78%和43.01%，分別較P7高57.01%和47.94%，但是二者之間無(wú)顯著差別?？梢?jiàn)，P10為鐵皮石斛最佳生根率配方。

表3 不同培養(yǎng)基對(duì)鐵皮石斛生根的影響

2.3 不同培養(yǎng)基配方對(duì)瓶?jī)?nèi)開(kāi)花的影響

由表4 可知，P1下鐵皮石斛的開(kāi)花株數(shù)在接種30d 和60d 都是最高，其次為P10，二者顯著高于其他處理。從接種30d 和60d 后，看到在接種前期開(kāi)花進(jìn)程較慢，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，開(kāi)花數(shù)目增加較快?？梢?jiàn)，P1顯著促進(jìn)了鐵皮石斛的開(kāi)花進(jìn)程。

表4 不同培養(yǎng)基接種后的開(kāi)花進(jìn)程

圖1 不同培養(yǎng)時(shí)間下鐵皮石斛開(kāi)花情況

由表5 可知，P1下鐵皮石斛的每株開(kāi)花數(shù)最高，顯著高于其他處理，其次為P10，P9下最低；花期也是在P1下最大，顯著高于其他處理，其次為P10，P5下最小；開(kāi)花率在P1下達(dá)到最高，其次為P10，二者顯著高于其他處理，P8下最小?？梢?jiàn)，P1為鐵皮石斛最佳開(kāi)花培養(yǎng)基配方。

表5 不同培養(yǎng)基對(duì)開(kāi)花的影響

3 結(jié)論與討論

本研究設(shè)置不同的激素配比，探究不同培養(yǎng)基配方對(duì)鐵皮石斛瓶苗的增殖生根和瓶?jī)?nèi)開(kāi)花的影響。結(jié)果表明：較適合鐵皮石斛瓶苗的增殖培養(yǎng)基配方為6-BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L+ZT 0.5mg/L，適合的生根培養(yǎng)基配方為1/2 MS+NAA 1.0mg/L+IBA 1.0mg/L，適合瓶苗瓶?jī)?nèi)開(kāi)花的培養(yǎng)基配方為6-BA 2.0mg/L+NAA 0.1mg/L+ABA 1.0mg/L。研究也發(fā)現(xiàn)，1/2MS 的培養(yǎng)基以及添加了IBA 的培養(yǎng)基容易導(dǎo)致瓶苗產(chǎn)生玻璃化現(xiàn)象，苗體普遍發(fā)黃，但能夠促使瓶苗生根。

通過(guò)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，鐵皮石斛大部分開(kāi)花在接種2 個(gè)月后，可能此時(shí)培養(yǎng)基中的成分大部分被消耗，瓶苗可能出于自我保護(hù)進(jìn)行開(kāi)花。因此，可以判斷營(yíng)養(yǎng)元素的含量是導(dǎo)致鐵皮石斛開(kāi)花的原因之一。

本研究還發(fā)現(xiàn)，用于增殖的6-B 2.0mg/L+NAA 0.1mg/L 培養(yǎng)基，鐵皮石斛瓶苗也會(huì)開(kāi)花，但開(kāi)花周期至少得2 個(gè)月及以上，且花芽分化速度比較慢。此外，根據(jù)上述結(jié)果可以初步看出，第1 個(gè)月增殖效果好的培養(yǎng)基，開(kāi)花效果不太明顯，而開(kāi)花效果暫時(shí)明顯的，增殖效果不明顯。鐵皮石斛開(kāi)花趨勢(shì)呈曲線，以1 個(gè)月為分界，第1 個(gè)月呈現(xiàn)緩慢上升，到第2 個(gè)月呈現(xiàn)急速上升趨勢(shì)；2 個(gè)月之后，開(kāi)花趨勢(shì)會(huì)隨瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分消耗而下降，但其開(kāi)花植株普遍較矮小，未開(kāi)花植株比開(kāi)花的植株要更高大、壯碩一些。可能是植物的開(kāi)花消耗了植株體內(nèi)的一些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，所以開(kāi)花的植株長(zhǎng)勢(shì)較為矮小，而未開(kāi)花的植株長(zhǎng)勢(shì)更為健壯。研究結(jié)果為以后的實(shí)際生產(chǎn)提供了可靠的科學(xué)依據(jù)與技術(shù)參考。