占麗琴，方磊，羅艷，孫輝，丁野

湖南省藥品檢驗檢測研究院,湖南省藥品質(zhì)量評價工程技術(shù)研究中心，湖南 長沙 410001

酒赤芍為毛茛科植物芍藥Paeonia lactifloraPall.或川赤芍Paeonia veitchiiLynch 的干燥根的炮制加工品，用于治療熱入營血、溫?zé)岚l(fā)斑、吐血、目赤、經(jīng)閉痛經(jīng)［1］。現(xiàn)代研究主要針對化學(xué)成分及藥理作用，不能全面反映藥材整體質(zhì)量［2-5］。因此，本研究進行薄層色譜、水分、總灰分、浸出物、含量測定及指紋圖譜研究，為其進一步開發(fā)利用提供參考。

1 材料

島津LC20-AT 高效液相色譜儀（檢測器DAD）；色譜柱 Capcell MG C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；色譜工作站Empower、Lecia DM2500。芍藥苷（批號110736-201842，純度：9.74%）對照品；沒食子酸（批號110831-201605，純度：90.8%）對照品；赤芍（批號121093-201804，純度：97.4%）對照藥材均購自中國食品藥品檢定研究院。實驗用樣品15 批次（批號19062619、19100723-1、19100723-2、19100723-3、Y20191001、Y20191002、Y20191003、201910007、201910008、201910009、16032302、2019060051、2019102101、2019102102、2019102103）來自不同的生產(chǎn)單位及使用單位，產(chǎn)地為安徽、四川、內(nèi)蒙古自治區(qū)，經(jīng)湖南省藥品檢驗研究院中藥所丁野主任中藥師鑒定為酒赤芍，部分樣品見圖1。

圖1 酒赤芍部分樣品性狀圖

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層鑒別

參照《中國藥典》2015 年版一部赤芍項下薄層鑒別方法，研究擬定展開劑為“二氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（40∶5∶10∶0.2）”，并增加赤芍對照藥材做對照［6］，結(jié)果在與對照品、對照藥材溶液的斑點相應(yīng)位置檢出供試品斑點。結(jié)果見圖2。

圖2 酒赤芍薄層色譜圖

2.2 檢查

水分、總灰分、水溶性浸出物均按《中國藥典》2015 年版相關(guān)規(guī)定測定，結(jié)果如表1。

表1 酒赤芍水分、總灰分、浸出物測定表（%）

2.3 含量測定

2.3.1溶液的制備對照品溶液：精密稱取芍藥苷對照品適量，加甲醇溶解，搖勻，得對照品儲備液（1.050 8 mg/mL）。精密吸取對照品儲備液適量，加甲醇稀釋成對照品溶液。

供試品溶液：取本品粗粉約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加甲醇25.0 mL，稱定重量，浸泡4 h，超聲（300 W，30 kHz）20 min，放冷，用甲醇補重，混勻，即得。

2.3.2色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性色譜柱：Capcell MG C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-0.05 mol/L 磷酸二氫鉀溶液（30∶70）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：230 nm；柱溫：30 ℃。理論板數(shù)按芍藥苷峰計，不低于3 000。見圖3，圖4。

圖3 芍藥苷對照品色譜圖

圖4 酒赤芍樣品色譜圖

2.3.3線性關(guān)系考察精密吸取濃度為0.042 0、0.105 1、0.420 3 mg/mL 的對照品溶液10 μL，1.050 8 mg/mL的對照品溶液10 μL 和20 μL，按“2.3.2”法測定，以峰面積及進樣量（ng）分別為縱坐標(biāo)、橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準曲線。其回歸方程為：y=1 402.5x-106 296，r=1。結(jié)果表明芍藥苷在420.3～21 015.0 ng 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.4精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性試驗取酒赤芍供試品溶液（批號2019102101），按“2.3.2”法測定，記錄色譜峰面積，計算RSD（n=6）分別為0.45%、0.55%、0.30%，表明儀器精密度、重復(fù)性及24 h穩(wěn)定性良好。

2.3.5加樣回收率試驗取同一酒赤芍供試品溶液（批號2019102101）約0.25 g（6 份），精密稱定，置錐形瓶中，精密加入適量的芍藥苷，按“2.3.1”制備供試品溶液，測定，結(jié)果平均加樣回收率為100.3%，RSD（n=6）為1.2%。見表2。

表2 加樣回收率試驗結(jié)果

2.4 指紋圖譜

2.4.1溶液的制備 對照品溶液的制備：分別精密稱取芍藥苷、沒食子酸對照品適量，置于25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，即得對照品溶液。供試品溶液的制備：同“2.3.1”中供試品溶液的制備。

2.4.2色譜條件梯度洗脫（0～60 min，5%～45% B；60～61 min，45%～5% B；61～70 min，5% B），其他色譜條件同“2.3.2”測定，酒赤芍樣品的色譜峰分離較好。見圖5。

圖5 對照品（A、B）及酒赤芍樣品（C）的色譜圖

2.3.6樣品測定結(jié)果對收集的15 批酒赤芍進行了含量測定，結(jié)果見表3。

表3 樣品含量測定結(jié)果（%）

2.4.3精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性試驗取酒赤芍供試品（批號2019102101）適量，按照“2.4.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.4.2”項下色譜條件進樣，以5 號芍藥苷色譜峰為參照峰（S），計算得到各共有峰的相對峰面積RSD 范圍分別為0.24%～2.41%、0.01%～0.04%、0.01%～0.09%，表明儀器精密度、重復(fù)性、24 h 穩(wěn)定性良好。

2.4.4指紋圖譜的建立將15 批酒赤芍樣品色譜圖導(dǎo)入國家藥典委員會《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2009 年版），以S1 號樣品色譜圖為參照圖譜，平均值法生成對照指紋圖譜R，時間窗寬度為0.1，進行多點校正和色譜峰匹配，生成共有峰模式，進行相似度評價。酒赤芍樣品HPLC 疊加圖譜及對照圖譜見圖6，相似度評價結(jié)果見表4。共確定9 個共有峰，通過與對照品比對，指認其中2個成分。其中5 號芍藥苷峰的紫外吸收較強，峰面積較高，保留時間合適，設(shè)為參照峰。計算得到各共有峰的相對保留時間的RSD 為0.02%～0.05%，相對峰面積RSD 為29.96%～139.55%，說明不同來源樣品質(zhì)量存在差異。15 批酒赤芍樣品指紋圖譜與對照圖譜的相似度為0.875～0.995，表明不同來源酒赤芍質(zhì)量相對穩(wěn)定，但個別樣品間含量差異較大，這可能與產(chǎn)地、生長年限及炮制工藝等有關(guān)。

表4 相似度評價結(jié)果

圖6 樣品HPLC疊加圖譜（S1～S15）及對照指紋圖譜（R）

2.4.5聚類分析以9 個共有峰的峰面積為變量，導(dǎo)入SPSS 22.0 軟件，進行系統(tǒng)聚類分析［7-9］。當(dāng)分類距離為10 時，不同來源的15 批次酒赤芍樣品可分為4 大類，S1、S2、S3、S4 號樣品聚為一類，S13、S14、S15 號樣品聚為一類，S11 號單獨一類，其余樣品聚為一類，見圖7。

圖7 不同來源的15批次酒赤芍樣品聚類分析圖

2.4.6主成分分析采用SPSS 22.0 軟件，以15 批酒赤芍樣品指紋圖譜中的9 個共有峰為變量，進行因子分析，Bartlett 球形檢驗結(jié)果Sig.值為0，表明適合做因子分析［10-11］。以特征值大于1 為提取標(biāo)準，提取得到3 個主成分累計方差貢獻率為91.739%，可以代表指紋圖譜數(shù)據(jù)的大部分信息，見表5。

表5 特征值和方差貢獻率（%）

由表6 可知，特征峰1、2、3、6 在第1 主成分中有明顯正載荷值，特征峰7 號在第2 主成分中有明顯正載荷值，特征峰3、4、5、8、9 在第3 主成分中有明顯正載荷值，表明酒赤芍的質(zhì)量是多個成分作用的結(jié)果。

表6 初始因子載荷矩陣

由圖8 可知，所有樣品可分為4 類，與聚類分析結(jié)果一致。

圖8 主成分得分圖

3 討論

3.1 試驗條件考察

在指紋圖譜試驗中考察了水、甲醇、50%甲醇為提取溶劑，最后顯示甲醇提取后成分較多。考察了超聲提取、加熱提取兩種提取方法，結(jié)果顯示提取成分沒有差異，考慮試驗經(jīng)濟學(xué)最終選取超聲提取方法。

3.2 指紋圖譜分析

通過上述三種分析方式，對不同來源的酒赤芍樣品的9 個共有峰進行分析。通過對照品比對，指認出其中2 個峰為共有峰，分別為沒食子酸和芍藥苷。在相似度評價中，15批樣品相似度為0.875～0.995，表明不同來源酒赤芍的化學(xué)成分種類相似，質(zhì)量相對穩(wěn)定。聚類分析與主成分分析顯示S13、S14、S15與其他樣品存在差異，與相似度評價結(jié)果一致。

4 結(jié)論

本試驗對15 批酒赤芍薄層色譜、水分、總灰分、浸出物、含量測定、指紋圖譜進行研究，建立方法準確可靠，可用于酒赤芍飲片的質(zhì)量控制，為酒赤芍的質(zhì)量評價提供參考。