金 翠，曹永梅，尚嘉偉，李穎川

(上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，上海 200233)

膿毒癥(sepsis)是全身感染性危重疾病，易并發(fā)急性腎損傷(acute kidney injury,AKI)。一旦膿毒癥相關(guān)急性腎損傷(sepsis-induced acute kidney injury,SAKI)形成，患者預(yù)后差、病死率高。一項(xiàng)研究表明，臨床中SAKI病死率高達(dá)70%，死亡率明顯高于其他原因所致的AKI[1]。膿毒癥誘發(fā)的臟器損傷并非由感染病原體直接引起，而是體內(nèi)非特異性炎癥反應(yīng)系統(tǒng)紊亂，炎癥因子調(diào)控和表達(dá)失常，進(jìn)而引起臟器細(xì)胞病理性死亡[2]。

SAKI的形成與血液中內(nèi)毒素和炎癥介質(zhì)增多直接損傷腎臟組織，或觸發(fā)凝血和纖溶系統(tǒng)反應(yīng)，使腎小球內(nèi)形成血栓，阻塞腎臟微血管有關(guān)[3-4]。此外，發(fā)生膿毒癥時(shí)，腎臟血管收縮反應(yīng)增強(qiáng)使腎血流和腎小球?yàn)V過率下降[5]。同時(shí)，炎癥刺激、缺血等因素使腎臟細(xì)胞代謝障礙，細(xì)胞死亡增加。樊恒等[6]研究結(jié)果表明，SAKI發(fā)生時(shí)，腎小管上皮細(xì)胞凋亡上調(diào)。

近年來，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源外泌體(exoso-mes derived from bone mesenchymal stem cells,BMSCs-Exo)在延緩關(guān)節(jié)炎、調(diào)控軟骨細(xì)胞再生、心肌細(xì)胞修復(fù)等方面進(jìn)行了較為廣泛的研究，且其修復(fù)作用的機(jī)制與抗細(xì)胞凋亡相關(guān)[7-10]。目前尚無研究探索BMSCs-Exo在SAKI中的作用及機(jī)制。本研究應(yīng)用LPS處理HK-2細(xì)胞建立SAKI體外細(xì)胞模型，擬探究BMSCs-Exo對SAKI的作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)及處理

大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞BMSCs和人近端腎小管上皮細(xì)胞株HK-2(中國科學(xué)院細(xì)胞庫)，分別使用含10%胎牛血清(Gibco公司,10270-106)、1%青霉素/鏈霉素(Gibco公司,15140-122)的α-MEM(Servicebio公司,G4554)培養(yǎng)基和DMEM/F12(Servicebio公司,G4610)培養(yǎng)基，在37 ℃、5%的CO2中培養(yǎng)。2～3 d換液。將HK-2細(xì)胞分為3組：對照組(CON組)、脂多糖組(LPS組)和脂多糖+ 外泌體組(LPS+EXO組)。LPS和LPS+EXO組：待HK-2細(xì)胞融合至80%左右時(shí)，以100 μg/mL的LPS處理細(xì)胞24 h。其中LPS+EXO組在LPS處理后加入100 μg/mL外泌體處理24 h。本研究使用的BMSCs為P3～P5。

1.2 外泌體提取和鑒定

1.2.1 BMSCs-Exo提取 BMSCs融合至90%左右，收集條件培養(yǎng)基，按照以下方式依次進(jìn)行離心：(1) 4 ℃，300×g，離心10 min，取上清液；(2) 4 ℃，3 000×g，離心10 min，取上清液；(3) 4 ℃，10 000×g，離心30 min，再次取上清液；(4) 將收集的上清液在0.22 μm濾器過濾后，收集過濾液；(5) 4 ℃，110 000×g，離心70 min后棄上清液，用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)重懸沉淀，即為外泌體，-80 ℃儲存。利用BCA蛋白濃度測定試劑盒(Beyotime公司,P0012)對外泌體中蛋白濃度進(jìn)行定量。

1.2.2 BMSCs-Exo鑒定 (1) 透射電子顯微鏡檢測：取BMSCs-Exo滴入銅網(wǎng)表面，室溫靜置2～3 min，濾紙吸干，磷鎢酸室溫復(fù)染5 min，濾紙吸干復(fù)染液，置于透射電子顯微鏡下觀察外泌體的大小和形態(tài)并照相。(2) 外泌體粒徑檢測：利用納米顆粒跟蹤分析系統(tǒng)和納米顆粒跟蹤分析軟件來跟蹤納米顆粒的運(yùn)動速率。(3) Western印跡法檢測：分析外泌體CD9(Bioss公司,bs-2489R)、CD63(Affinity公司,AF5117)、CD81(Affinity公司,DF2306)和Calnexin(Affinity公司,AF5362)的表達(dá)情況。

1.3 HK-2細(xì)胞對BMSCs-Exo攝取情況觀察

參照DiI(Beyotime公司,C1036)、DAPI(Servicebio公司,G1012)和phalloidin(Servicebio公司,G1028)染色試劑盒說明書，分別標(biāo)記BMSCs-Exo、HK-2細(xì)胞核和細(xì)胞微絲骨架，在熒光顯微鏡下觀察HK-2細(xì)胞對BMSCs-Exo的攝取情況。首先，將10 μmol/L DiI標(biāo)記的BMSCs-Exo加入HK-2細(xì)胞孵育4 h。然后，加入phalloidin染色試劑，室溫染色2 h，用PBS洗滌3次。最后，加入DAPI染色試劑，室溫染色5 min，用PBS洗滌3次。染色結(jié)束后，在熒光顯微鏡下觀察HK-2細(xì)胞對外泌體的攝取情況。

1.4 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和檢測

1.4.1 CCK-8檢測LPS處理后的HK-2細(xì)胞活力 細(xì)胞接種于96孔板，不同濃度(0、1、10、100、500 μg/mL)LPS(Sigma-Aldrich公司,L2880,EscherichiacoliO55：B5)，每孔100 μL處理24 h后，每孔加入10 μL CCK-8(Dojindo公司,CK04)溶液，37 ℃孵育1～4 h，使用酶標(biāo)儀檢測450 nm處吸光度值(A450)。

1.4.2 Western印跡法 按照1∶1∶1∶100的比例混合蛋白酶抑制劑、蛋白磷酸酶抑制劑、PMSF和RIPA細(xì)胞裂解液(Solarbio公司,BC3710)，提取HK-2細(xì)胞總蛋白。用BCA蛋白濃度測定試劑盒(Beyotime公司,P0012)測定蛋白濃度，取20 μg總蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上?？焖俜忾]液室溫封閉10 min，TBST清洗3次后，一抗(1∶1 000)4 ℃孵育過夜。TBST清洗3次后，二抗(1∶1 000)室溫孵育2 h。TBST清洗3次后，使用ECL發(fā)光液(Epizyme公司,SQ202)進(jìn)行曝光。

1.4.3 qRT-PCR PBS洗滌細(xì)胞3次，用EZ-press RNA Purification Kit(EZBioscience公司,B0004D)試劑盒提取總RNA。利用Color Reverse Trans-cription Kit(EZBioscience公司，A0010GQ)試劑盒將RNA樣品反轉(zhuǎn)錄成cDNA。利用Light Cycler 480Ⅱ(Roche)實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)，以cDNA為模版進(jìn)行擴(kuò)增。引物序列如下。TNF-α-F：5′-TGGCGT-GGAGCTGAGAGATAACC-3′，TNF-α-R：5′-CGA-TGCGGCTGATGGTGCGG-3′；IL-6-F：5′-CACTG-GTCTTTTGGAGTCTGAG-3′，IL-6-R：5′-GGACTT-TTGTACTCATCCGCAC-3′；IL-1β-F：5′-GCCAGT-GAAATGATGGCCTATC-3′，IL-1β-R：5′-AGGAG-CACTTCATCTGTCTAGG-3′；GAPDH-F：5′-ACAA-CTTTGGTATCGTGGAAGG-3′，GAPDH-R：5′-GCC-ATCACGCCACAGTTTC-3′。目標(biāo)基因表達(dá)以GAPDH水平規(guī)范化，使用2-ΔΔCt方法計(jì)算。

1.4.4 AnnexinⅤ-FITC/PI流式細(xì)胞術(shù) 利用Annexin Ⅴ-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(Beyotime公司,C1062S)檢測HK-2細(xì)胞凋亡率。標(biāo)準(zhǔn)步驟：消化細(xì)胞，1 000×g，離心5 min，棄上清液。用PBS輕輕重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)，取5～10萬個(gè)重懸的細(xì)胞，1 000×g，離心5 min，棄上清液。加入195 μL Annexin V-FITC結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞，5 μL Annexin V-FITC混勻細(xì)胞，10 μLPI再次混勻細(xì)胞后，室溫避光孵育15 min，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞凋亡分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 外泌體鑒定和攝取結(jié)果

透射電鏡觀察到提取物為具有單層膜結(jié)構(gòu)的盤狀囊泡，符合外泌體的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)(圖1A)。納米顆粒跟蹤分析顯示提取物粒徑大多為30～200 nm，與外泌體粒徑范圍一致(圖1B)。Western印跡法進(jìn)一步檢測外泌體表面生物標(biāo)志物CD9、CD63和CD81以及細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)特異分子Calnexin的表達(dá)情況，結(jié)果顯示：與對照組相比，BMSCs-Exo組CD9、CD63和CD81均高表達(dá)，而Calnexin幾乎不表達(dá)(圖1C)，提示外泌體提取成功。從圖1D可以看出，HK-2細(xì)胞(綠色)成功攝取BMSCs-Exo(紅色)。

2.2 LPS誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞活力下降

不同濃度LPS(0、1、10、100、500 μg/mL)處理細(xì)胞，24 h后檢測細(xì)胞活力，結(jié)果顯示：當(dāng)LPS濃度為1、10 μg/mL時(shí)，細(xì)胞活力分別為對照組的99.90%、98.72%，較對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；當(dāng)濃度為100和500 μg/mL時(shí)，細(xì)胞活力分別為對照組的86.64%和60.84%，較對照組顯著降低(P<0.05)，結(jié)果見圖2。根據(jù)此結(jié)果，選擇100 μg/mL的LPS處理24 h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 不同濃度脂多糖對HK-2細(xì)胞活力影響Fig.2 HK-2 cells viability at different concentrations of LPS與LPS(0 μg/mL)組相比，*P<0.05；**P<0.01

2.3 BMSCs-Exo改善LPS誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞活性下降

先用LPS處理細(xì)胞24 h，再使用不同濃度外泌體(0、10、50、100、200 μg/mL)處理細(xì)胞24 h后檢測細(xì)胞活力，結(jié)果顯示：LPS引起細(xì)胞活性顯著下降(P<0.01)，當(dāng)外泌體濃度為10 μg/mL時(shí)，對LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞活性下降無明顯影響，而當(dāng)外泌體濃度為50、100和200 μg/mL時(shí)，外泌體顯著改善LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞活性下降(P<0.01)，見圖3。根據(jù)此結(jié)果并結(jié)合目前已報(bào)道的其他外泌體相關(guān)研究，本研究選擇100 μg/mL的外泌體處理24 h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖3 外泌體改善脂多糖誘發(fā)的細(xì)胞活力下降Fig.3 Exosomes improve LPS-induced decreased HK-2 cells viability與CON組相比，**P<0.01；與EXO(0 μg/mL)組相比，**P<0.01；***P<0.001

2.4 BMSCs-Exo抑制LPS誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞炎癥反應(yīng)

qRT-PCR檢測各組HK-2細(xì)胞中炎性指標(biāo)TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA表達(dá)水平，結(jié)果如圖4所示：與對照組相比，LPS組細(xì)胞中TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA水平顯著增加(P<0.01)，外泌體組與LPS組相比，這些炎性因子mRNA水平均顯著下降(P<0.05)。進(jìn)一步驗(yàn)證了在LPS作用下HK-2細(xì)胞中的炎性因子mRNA表達(dá)增多可能造成細(xì)胞受損，而外泌體可能通過減輕細(xì)胞炎癥從而改善其功能。

圖4 外泌體逆轉(zhuǎn)脂多糖誘發(fā)的HK-2細(xì)胞炎癥反應(yīng)Fig.4 Exosomes reverse LPS-induced HK-2 cells inflammatory response與CON組相比，**P<0.01；與LPS組相比，#P<0.05；##P<0.01；###P<0.001

2.5 BMSCs-Exo降低LPS誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞凋亡水平

分別收集LPS、LPS和外泌體處理的細(xì)胞，Annexin V-FITC和PI染色后，流式細(xì)胞儀檢測凋亡細(xì)胞，以未經(jīng)處理的細(xì)胞作為對照。Q1-UR(晚期凋亡)+Q1-LR(早期凋亡)百分比之和為細(xì)胞總凋亡率。研究結(jié)果如圖5所示，LPS處理24 h后，HK-2凋亡細(xì)胞比例為10.76%，對照組為3.68%，LPS組凋亡率較對照組顯著上升(P<0.01)。LPS+EXO組細(xì)胞凋亡率為8.18%，顯著低于LPS組(P<0.05)。Western印跡法結(jié)果(圖6)與流式結(jié)果一致，與對照組相比，LPS組凋亡蛋白cleaved-Caspase3和Bax表達(dá)顯著增多，抗凋亡蛋白bcl2表達(dá)顯著降低(P<0.05)，而這一作用可以被外泌體逆轉(zhuǎn)。說明外泌體對LPS誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用。

圖5 外泌體對脂多糖誘發(fā)的HK-2細(xì)胞凋亡的影響Fig.5 The effect of exosomes on apoptosis of HK-2 cells induced by LPS與CON組相比，**P<0.01；與LPS組相比，#P<0.05

圖6 外泌體逆轉(zhuǎn)脂多糖對HK-2細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的作用Fig.6 Exosomes reverse the effects of LPS on the expression of apoptosis-related proteins in HK-2 cells與CON組相比，*P<0.05；**P<0.01；與LPS組相比，#P<0.05

3 討 論

膿毒癥為重癥監(jiān)護(hù)室(intensive care unit,ICU)常見疾病，可誘發(fā)多器官功能障礙或衰竭嚴(yán)重影響患者預(yù)后，膿毒癥相關(guān)急性腎損傷是膿毒癥預(yù)后不佳的主要因素之一。膿毒癥引起的急性腎損傷機(jī)制尚未完全闡述清楚，目前認(rèn)為與以下幾方面可能相關(guān)：腎臟血流動力學(xué)改變[11]、細(xì)胞因子和自由基對細(xì)胞損傷[12]、微粒與血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷[13]、腎小管上皮細(xì)胞能量代謝障礙[14]及SAKI中基因差異性表達(dá)等[15]。膿毒癥發(fā)生時(shí)，血液中內(nèi)毒素增多，內(nèi)毒素脂多糖與脂多糖蛋白結(jié)合激發(fā)細(xì)胞炎性反應(yīng)，炎性因子釋放損傷腎小管上皮細(xì)胞。

應(yīng)用LPS處理HK-2細(xì)胞來建立SAKI細(xì)胞模型被廣泛報(bào)道，其不僅具有促炎性作用，而且可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，但目前尚缺乏LPS處理濃度的標(biāo)準(zhǔn)，既往研究[16-18]應(yīng)用的LPS處理濃度差異較大(1～100 μg/mL)。Shi等[16]和Xu等[17]應(yīng)用LPS(1 μg/mL)處理HK-2細(xì)胞24 h，細(xì)胞活性下降，細(xì)胞炎性表達(dá)明顯增高。Zhong等[18]應(yīng)用LPS(1、5、10、25、50、100 μg/mL)處理HK-2細(xì)胞24 h，結(jié)果表明當(dāng)LPS濃度為50～100 μg/mL時(shí)可使細(xì)胞活力明顯下降，凋亡增加。不同研究應(yīng)用的LPS濃度差異較大可能與HK-2細(xì)胞的培養(yǎng)條件以及細(xì)胞本身的狀態(tài)相關(guān)，因此應(yīng)用LPS處理HK-2細(xì)胞建立SAKI細(xì)胞模型時(shí)，建議采用需構(gòu)建濃度梯度來確定最終的探索LPS處理濃度。本研究應(yīng)用濃度梯度LPS(0、1、10、100、500 μg/mL)處理HK-2細(xì)胞，24 h后檢測細(xì)胞活力，結(jié)果顯示：當(dāng)LPS濃度為1、10 μg/mL時(shí)，細(xì)胞活力分別為對照組的99.90%、98.72%，較對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而當(dāng)濃度為100和500 μg/mL時(shí)，細(xì)胞活力分別為對照組的86.64%和60.84%，較對照組顯著降低(P<0.05)，此研究結(jié)果與Zhong等[18]研究結(jié)果一致，最終選擇100 μg/mL的LPS建立SAKI細(xì)胞模型。

外泌體是細(xì)胞間通訊的一種方式，細(xì)胞通過分泌外泌體將其大量活性物質(zhì)傳遞給靶細(xì)胞，從而影響靶細(xì)胞的生物功能，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞間信號的傳遞[19-20]。外泌體的特性主要取決于其細(xì)胞來源[21-22]，間充質(zhì)干細(xì)胞是一類能夠自我更新并具有多向分化潛能的細(xì)胞[23]，存在于多種組織(如臍帶、月經(jīng)血、骨髓和脂肪組織等)[24]。與直接用間充質(zhì)干細(xì)胞相比，使用細(xì)胞來源的外泌體可以降低免疫反應(yīng)的發(fā)生以及異位移植的風(fēng)險(xiǎn)[25]。BMSCs具有強(qiáng)大的再生修復(fù)能力并且獲取相對更加容易，因此BMSCs-Exo被廣泛研究。目前尚無研究闡述BMSCs-Exo在SAKI中的作用，本研究結(jié)果顯示，當(dāng)BMSCs-Exo濃度為10 μg/mL時(shí)，其對LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞活性下降無明顯影響，而當(dāng)BMSCs-Exo濃度為50、100和200 μg/mL時(shí)，其顯著改善LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞活性下降(P<0.01)。結(jié)合既往研究[26-28]報(bào)道的外泌體處理濃度和時(shí)間，本研究采取的外泌體處理方式為100 μg/mL處理24 h，以確保實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性。本研究通過親脂性熒光染料DiI標(biāo)記BMSCs-Exo，同時(shí)分別使用DAPI和phalloidin熒光染料標(biāo)記HK-2細(xì)胞核和微絲骨架，結(jié)果顯示HK-2細(xì)胞成功攝取了BMSCs-Exo。

SAKI發(fā)生時(shí)腎小管細(xì)胞在炎性等損傷因素下促進(jìn)了細(xì)胞凋亡。盡管SAKI發(fā)生時(shí)，腎小管上皮細(xì)胞凋亡水平上調(diào)被廣泛認(rèn)同，但其具體機(jī)制尚未闡述完全。有研究認(rèn)為膿毒癥時(shí)腎臟組織細(xì)胞凋亡與鈣負(fù)載相關(guān)，SAKI時(shí)，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高，鈣依賴性核酸限制性內(nèi)切酶活化，導(dǎo)致核基因裂解成180～200 bp的小片段，引起細(xì)胞凋亡[29]。本研究結(jié)果顯示，LPS處理HK-2細(xì)胞后，細(xì)胞炎癥和凋亡水平均升高。在炎癥方面具體表現(xiàn)炎性因子(TNF-α、IL-6和IL-1β)mRNA水平顯著上調(diào)；在凋亡方面表現(xiàn)為細(xì)胞凋亡率明顯增高，凋亡蛋白cleaved-Caspase3和Bax表達(dá)上調(diào)，而抗凋亡蛋白bcl2表達(dá)下調(diào)。而BMSCs-Exo處理后，逆轉(zhuǎn)了LPS對HK-2的作用。LPS可誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞凋亡水平上調(diào)同樣被其他研究證實(shí)，Zhu等[30]分別通過小鼠盲腸套扎和LPS處理HK-2細(xì)胞建立SAKI體內(nèi)外模型，分析小鼠腎臟組織和HK-2細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)SAKI體內(nèi)外模型中凋亡水平均出現(xiàn)上調(diào)。同樣，研究顯示，BMSCs-Exo具有抗凋亡作用[31-32]。最近一項(xiàng)關(guān)于干細(xì)胞來源外泌體對急性腎損傷作用的Meta分析[33]，共納入31項(xiàng)研究，結(jié)果認(rèn)為干細(xì)胞來源外泌體通過抑制細(xì)胞炎癥反應(yīng)和減輕細(xì)胞凋亡來改善急性腎損傷模型腎功能。然而，目前尚無研究探索BMSCs-Exo在SAKI中的作用及機(jī)制。

綜上所述，本研究證實(shí)了BMSCs-Exo對LPS誘導(dǎo)的HK-2損傷具有抗炎和抗凋亡的保護(hù)作用，為SAKI的治療提供一定的方向。但本研究具有如下不足：(1) 未深入研究BMSCs-Exo發(fā)揮保護(hù)作用的活性成分；(2) 未明確BMSCs-Exo發(fā)揮保護(hù)作用的信號通路；(3) 未進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。進(jìn)一步研究可聚焦于明確BMSCs-Exo發(fā)揮作用的主要活性物質(zhì)如miRNA及其作用的信號通路，同時(shí)建立體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)體系，以及進(jìn)一步探索外泌體作用腎小管上皮細(xì)胞的其他機(jī)制如自噬等，以期探索應(yīng)用BMSCs-Exo治療SAKI的基礎(chǔ)理論依據(jù)。