毛曉怡，楊 鑫，劉 銳，建德鋒

（吉林農(nóng)業(yè)科技學院 吉林，吉林 132101）

蛇足石杉（），又名蛇足石松，為石杉科中的一種多年生草本植物，該植物為陰生蕨類植物，全草均可入藥，入藥具有消腫止痛、止血散瘀、清熱除濕等功效，還可以治跌打損傷、內傷吐血、燙火傷等癥。隨著蛇足石杉在藥用方面的需求量日益增大,野生資源又極其匱乏,而人工繁殖起來又很不易，導致市場上蛇足石杉藥材稀缺。為此，加速蛇石足杉苗木的培育非常關鍵，為給其快速繁殖提供參考依據(jù),該試驗以蛇足石杉的孢子為原材料，研究其離體繁殖技術。

1 材料和方法

1.1 實驗時間及地點

試驗于2020年6月份開始進行，2021年3月份結束，試驗于吉林農(nóng)業(yè)科技學院北校區(qū)組培實驗室進行。

1.2 材料處理

從野外采挖蛇足石杉植株，帶土栽植入花盆中，放入室內進行重點養(yǎng)護。接種前采集母株上的孢子葉，在0.1%的升汞（HgCL）溶液中浸泡3 min，再用無菌水沖洗4-5次，瀝干水分，帶入接種室中，放在超凈臺下分三種方式進行接種，分別為：A1.將1cm大小的孢子葉直接接到培養(yǎng)基上；A2.把孢子囊從孢子葉上分離后接種；A3.將孢子囊分離后，放在小塊濾紙上（2cm大小），壓碎取出孢子，連同濾紙一起接種。

1.3 培養(yǎng)基配方

培養(yǎng)基均以MS作為基本培養(yǎng)基，添加糖30g/L，瓊脂7g/L。具體各個階段的配方見表1。

2 結果和分析

2.1 孢子體不同接種方式對誘導萌發(fā)的影響

外植體以3種不同放置方式接種到6種培養(yǎng)基上，每瓶接1塊原材料，每種培養(yǎng)基接30瓶，每種方式180瓶，共接540 瓶。接種后統(tǒng)計成活數(shù)量、污染數(shù)量、出現(xiàn)愈傷組織數(shù)量，計算出愈率；后期統(tǒng)計不定芽出現(xiàn)時間、芽成活瓶數(shù)，計算萌發(fā)率，具體如表2。由表2 可以得出，3 種接種方式污染瓶數(shù)都比較多，這是因為初次接種外植體來自于室外；3種接種方式都能產(chǎn)生愈傷組織，但A1萌發(fā)成活瓶數(shù)及萌發(fā)率顯著高于A2和A3。

2.2 不同誘導培養(yǎng)基對誘導萌芽的影響

表1 各階段培養(yǎng)基配方

表2 外植體3種處理方法萌發(fā)情況

表3 不同誘導培養(yǎng)基對誘導萌芽的影響

表4 不同增殖培養(yǎng)基上增殖情況

表5 不同生根培養(yǎng)基中生根情況

在6 種不同誘導培養(yǎng)基上用A1 的接種方式進行接種，每瓶培養(yǎng)基接1塊外植體，共接300瓶，觀察愈傷組織形成芽的情況，計算芽萌發(fā)率，見表3。由表3可知，成活瓶中外植體也都誘導出了愈傷組織，這就說明配方中6-BA和NAA的選擇是正確的，一段時間后，愈傷組織能萌發(fā)出不定芽，但各自的萌發(fā)狀況不同，這說明激素的濃度對誘導萌發(fā)有影響，但B3、B4 這兩種培養(yǎng)基配方的萌發(fā)率較高，B5、B6、B2、B1相對較低，綜合比較得出MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L配方最好。

2.3 不同增殖培養(yǎng)基上增殖情況

待誘導階段萌發(fā)出的不定芽長成3-4 cm 高時，將其切成1-2 cm 小段轉接到7 種不同增殖培養(yǎng)基配方中，各小段開始生長，轉瓶28 d統(tǒng)計各瓶中苗木的增殖狀況，具體結果見表4。由表4可以看出，C6增值倍數(shù)最大，C5平均苗高最大；從C1-C6玻璃化的比率一直處于上升狀態(tài)，說明NAA 添加容易導致玻璃化。經(jīng)查閱資料顯示，在培養(yǎng)基中添加1.0 mg/L的GA，可以減少玻璃化現(xiàn)象。因此在第2次繼代時，選擇在C5、C6配方添加1.0 mg/L GA，發(fā)現(xiàn)C5配方添加后已無玻璃化現(xiàn)象發(fā)生，而C6配方仍有玻璃化存在。最終得出C5+GA1.0mg/L最適合作為增殖培養(yǎng)基配方。

2.4 不同生根培養(yǎng)基上生根情況

表5 是不同生根培養(yǎng)基配方中生根情況的數(shù)據(jù)。由表5 可以看出，D1 和D2 的生根率最高，并且達到了100%，而D3 與D4 的生根率只有72%和23%。通過比較D1 和D2 的其他因素，綜合得出D2 更適合蛇足石杉生根生長。

3 結論與討論

誘導階段得出A1 為最佳接種方式。采用A1 這種接種方式進行接種，觀察在不同誘導培養(yǎng)基中的莖段的誘導分化情況，從而得出最佳的初代培養(yǎng)基配方為MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L，最佳的增殖培養(yǎng)基配方為MS+KT 1.0mg/L+NAA 0.2 mg/L+ GA3 1.0mg/L，最佳的生根培養(yǎng)基配方為1/2 MS+IBA 0.5 mg/L。6-BA 和NAA 為植物組織培養(yǎng)中非常常見的生長素，主要作用是誘導細胞分裂和根的分化，這兩種激素一起使用可以誘導蛇足石杉產(chǎn)生愈傷組織并萌發(fā)，但是它們的作用濃度有一定的范圍，濃度超過這個范圍就會產(chǎn)生抑制作用，所以該試驗誘導階段選用濃度配方MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L具有一定的實踐意義。