李文哲 萬松林 劉韋成 吳云華 江從慶 錢群

我國慢性便秘(chronic constipation，CC)患病率近年來明顯上升，已經(jīng)成為影響人們生活質(zhì)量的一個重要因素[1]。據(jù)統(tǒng)計慢性便秘發(fā)病率達(dá)20%，在我國成人慢性便秘患病率為4%～6%，但是60歲以上人群慢性便秘患病率可高達(dá)22%[1]。慢性便秘主要類型為出口梗阻型便秘(obstructed defecation syndrome,ODS)，臨床表現(xiàn)為排便困難，排便過程肛門堵塞[2]。導(dǎo)致ODS的解剖學(xué)改變主要為直腸內(nèi)脫垂，直腸前突等。雖然目前針對ODS治療的方法較多，但臨床療效并不確切[1-2]。目前已有便秘治療一線方案對這類慢性便秘主要類型治療效果欠佳[3]。通過手術(shù)治療短期效果尚可，但是存在急便感等并發(fā)癥，影響病人術(shù)后滿意度。隨著隨訪時間延長，便秘復(fù)發(fā)比例增加。目前ODS治療對于臨床醫(yī)生仍然是挑戰(zhàn)[1,4-5]。我們采用同位素標(biāo)記相對和絕對定量(isobaric tags for relative and absolute quantification，iTRAQ) 技術(shù)，比較ODS病人與相應(yīng)非便秘病人手術(shù)切除直腸標(biāo)本中的差異蛋白譜，以了解ODS病人存在解剖學(xué)改變直腸蛋白質(zhì)組表達(dá)差異。

對象與方法

一、對象

我院結(jié)直腸肛門外科2016年1～5月間收治直腸內(nèi)脫垂/直腸前突導(dǎo)致出口梗阻型便秘病人20例，年齡31～82歲，平均年齡(62.3±15.3)歲。納入標(biāo)準(zhǔn):診斷均符合羅馬Ⅳ便秘診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]。排除標(biāo)準(zhǔn):合并子宮陰道脫垂;合并直腸肛管炎癥性疾病;盆底痙攣綜合征或者恥骨直腸肌肥厚導(dǎo)致便秘;合并肛門直腸狹窄;合并慢傳輸便秘、腸易激綜合征、炎癥性腸病;合并精神疾病或者拒絕手術(shù);合并肛門失禁。同期選取與入組病人的年齡、性別匹配的混合痔Ⅳ度脫垂病人10例，年齡29～88歲，平均(60.1±15.1)歲。所有病人均采用經(jīng)肛門吻合器直腸切除術(shù)并收集手術(shù)切除直腸標(biāo)本，術(shù)前完成慢傳輸試驗，排糞造影，結(jié)腸鏡檢查。本研究經(jīng)武漢大學(xué)中南醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)(No.2015048)，中國臨床試驗注冊中心臨床研究注冊(No.ChiCTRORN-16007696)，所有研究對象均簽署知情同意書。

二、方法

1.實驗方法：所有收集ODS組以及混合痔組切除直腸標(biāo)本用預(yù)冷的PBS清洗；液氮充分研磨，將研磨后的粉末轉(zhuǎn)移至離心管中。加入適量的lysis buffer(含有終濃度1% PMSF 的PBS溶液)，冰浴超聲5分鐘；4 ℃，12 000 g離心10分鐘，取上清；加等體積的100%乙腈溶液，混合均勻，冰上放置1小時；沉淀完成后10 000 g離心10分鐘，取除沉淀外的所有上清液；冷凍抽干至體積縮小一半后，用預(yù)先潤濕的10 kD超濾管10 000 g，4 ℃離心20分鐘，然后用200 μl超純水重復(fù)上述操作，收集穿透液，加入1%的甲酸調(diào)pH至2～3。在-80 ℃下保存待測。共分為2組進(jìn)行實驗，包括ODS組、對照組(混合痔組)，各自將組內(nèi)所有樣本進(jìn)行混合。取適量樣本用Bradford法進(jìn)行蛋白定量，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和蛋白樣品稀釋倍數(shù)計算出蛋白濃度，進(jìn)行酶解除鹽，iTRAQ標(biāo)記后進(jìn)行肽段組分分離，最后進(jìn)行液相色譜-多級質(zhì)譜聯(lián)用分析。

2.生物信息分析：為了研究所鑒定蛋白的生理功能，我們將上述鑒定的顯著差異表達(dá)蛋白和NR動物庫進(jìn)行blast比對，然后借助blast2go軟件將蛋白映射到基因本體論(GO)，從而實現(xiàn)蛋白的GO功能注釋和富集分析；為了研究所鑒定的顯著差異蛋白可能參與的通路途徑，我們使用京都基因與基因組百科全書 Pathway數(shù)據(jù)庫進(jìn)行通路富集分析。GO富集分析和KEGG Pathway富集分析均采用費舍爾精確檢驗，并認(rèn)為P-value≤0.05作為顯著富集的功能條目。我們采用軟件信號肽(SignalP)4.0進(jìn)行蛋白的信號肽預(yù)測，最后根據(jù)軟件的Dmax得分來評估蛋白是否含有信號肽區(qū)及信號肽區(qū)域，結(jié)果以Dmax為0.45作為閾值，大于0.45則認(rèn)為蛋白含信號肽區(qū)域。

結(jié)果

1.質(zhì)量檢測：電泳結(jié)果顯示總蛋白提取質(zhì)量較好，總量足夠，各組樣本分離情況佳且基本相同，見圖1;色譜-質(zhì)譜分析中，肽段長度整體集中在10aa附近，表明酶解正常，質(zhì)譜性能穩(wěn)定，見圖2，可進(jìn)行下一步實驗。

注:1、2分別為ODS組、混合痔組，M為電泳條帶標(biāo)志物。圖1 兩組樣本SDS-PAGE 電泳圖

圖2 肽段長度分布圖

2.質(zhì)譜數(shù)據(jù)檢測結(jié)果：共采集到153 332張二級譜圖，其中有52 560張得以解析，共對應(yīng)29 455種肽段，匹配到3 122種蛋白group。

3.生物信息學(xué)分析結(jié)果：(1)定量分析：質(zhì)譜下機(jī)數(shù)據(jù)通過ProteinPilot V4.5(AB SCIEX，USA)與Uniprot人屬蛋白數(shù)據(jù)庫進(jìn)行匹配分析，按照Unused得分在1.3以上匹配結(jié)果進(jìn)行篩選，從質(zhì)譜數(shù)據(jù)中匹配上29 455個肽段，共3 122個蛋白，部分信息見表1。(2)差異分析：本研究根據(jù)蛋白質(zhì)組學(xué)定量結(jié)果，在ODS組：混合痔組中，通過控制篩選中標(biāo)準(zhǔn)差異系數(shù)(Fold Change,FC)和矯正后的假定概率(Adjust.P value,adj.P)的閾值來實現(xiàn)差異篩選。本研究使用的篩選閾值為FC≥1.5或FC≤0.667及adj.P≤0.05，共篩選出了164個顯著差異的蛋白(上調(diào)蛋白88種，下調(diào)蛋白76種)。見圖3。(3)GO分析：對ODS組以及混合痔組相比的164種差異表達(dá)蛋白進(jìn)行GO功能分類，涉及20種生物學(xué)過程、3種細(xì)胞組分和15種分子功能。其中，生物過程包括細(xì)胞進(jìn)程(154種差異蛋白)、生物調(diào)節(jié)(129種差異蛋白)、代謝過程(88種差異蛋白)、刺激反應(yīng)(75種差異表達(dá)蛋白)、運動(23種差異蛋白)、免疫系統(tǒng)過程(34種差異表達(dá)蛋白)、行為(6種差異表達(dá)蛋白)、生長(6種差異表達(dá)蛋白)等，分子功能主要表現(xiàn)為結(jié)合(157種差異表達(dá)蛋白)、催化活性(56種差異表達(dá)蛋白)、結(jié)構(gòu)分子活性(35差異表達(dá)蛋白)、運輸活性(14種差異表達(dá)蛋白)、抗氧化活性(8種差異蛋白)等，細(xì)胞組分主要為細(xì)胞解剖實體(163種差異表達(dá)蛋白)、含蛋白復(fù)合體(74種差異表達(dá)蛋白)、病毒組件(1種差異表達(dá)蛋白)等，見圖4。(4)KEGG通路分析：對ODS組以及混合痔組比較的差異表達(dá)蛋白經(jīng)過KEGG Pathway注釋，共涉216條條通路，包括代謝通路(27種差異表達(dá)蛋白)、糖尿病性心肌病(13種差異表達(dá)蛋白)、阿爾茨海默病(10種差異表達(dá)蛋白)、血小板激活(10種差異表達(dá)蛋白)等，特別地，注釋到較多神經(jīng)性相關(guān)疾病的通路，見圖5。(5)SignalP分析：為了研究可能的信號肽，我們使用SignalP 4.0進(jìn)行蛋白的信號肽預(yù)測。

表1 Unused得分排名前5的蛋白結(jié)果

圖3 差異蛋白火山圖

圖4 差異蛋白GO注釋

在164種差異蛋白中，我們預(yù)測到有42種蛋白可能是信號肽，如基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP9，在細(xì)胞外基質(zhì)的局部蛋白水解和白細(xì)胞遷移中起重要作用)、IGKV3-20(免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)域的V區(qū)，參與抗原識別)、DEFA3(防御素2和防御素3具有抗生素、殺菌劑和抗病毒活性)等。(6)PPI互作分析:在針對差異蛋白的GO,KEGG注釋結(jié)果中，我們發(fā)現(xiàn)許多神經(jīng)調(diào)控通路以及神經(jīng)疾病相關(guān)的蛋白都出現(xiàn)了顯著的上下調(diào)差異。為了尋找神經(jīng)調(diào)控與ODS之間可能存在的潛在聯(lián)系，在注釋結(jié)果中我們篩選出了兩個在功能注釋中明顯富集的通路negative regulation of neuron apoptotic process(GO-biological process)和Neurodegenerative disease(KEGG),共24個蛋白進(jìn)行了蛋白互作分析(protein-protein interaction,PPI)，見圖6，其中紅色為上調(diào)蛋白，藍(lán)色為下調(diào)蛋白，灰色為通路名。

圖5 差異蛋白KEGG Pathway注釋結(jié)果

圖6 PPI互作分析結(jié)果

討論

直腸內(nèi)脫垂、直腸前突是導(dǎo)致ODS癥狀主要解剖學(xué)異常。目前,臨床對ODS病人一線治療方案主要為飲食調(diào)節(jié)、常規(guī)瀉劑、生物反饋等行保守治療，但療效并不確切[1-2]。保守治療無效病人需要手術(shù)切除直腸內(nèi)脫垂、直腸前突部分恢復(fù)正常解剖學(xué)結(jié)構(gòu)。手術(shù)治療的短期療效尚可，但隨著手術(shù)時間推移，病人便秘癥狀多再次出現(xiàn)[1,3-5]。因此，存在相當(dāng)數(shù)量ODS病人經(jīng)過保守甚至手術(shù)治療后依然需要瀉劑等輔助排便。

基于質(zhì)譜的高通量蛋白質(zhì)組學(xué)是研究大規(guī)模蛋白質(zhì)表征的核心技術(shù)，是一個多組學(xué)研究領(lǐng)域，旨在有效整合基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)。通過這種方法，可以識別可能對疾病發(fā)展，特別是新的病人特異性蛋白形式。通過蛋白質(zhì)組學(xué)能夠更好地解釋疾病的分子機(jī)制，識別病人特異性蛋白質(zhì)形式并更好地了解疾病的分子機(jī)制，進(jìn)而為精準(zhǔn)和個性化醫(yī)療開辟道路[7-8]。

目前,在外科研究領(lǐng)域，蛋白質(zhì)組學(xué)研究主要集中在腫瘤相關(guān)疾病，對于功能性疾病蛋白質(zhì)組學(xué)研究較少，對于ODS的蛋白質(zhì)組學(xué)研究尚鮮見報道[9-10]。iTRAQ 蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)作為一種新的蛋白質(zhì)定量技術(shù)，能夠提供有關(guān)疾病對蛋白質(zhì)改變影響的信息，可以同時篩查疾病中幾乎全部蛋白質(zhì)的改變，以及對疾病治療所涉及的潛在機(jī)制和途徑的深入了解，從而發(fā)現(xiàn)致病過程中的關(guān)鍵蛋白質(zhì)分子[11]。

我們利用iTRAQ技術(shù)分析ODS組以及混合痔組病人組織標(biāo)本中差異蛋白的表達(dá)譜，結(jié)果顯示，ODS組與混合痔組比較，88種蛋白質(zhì)表達(dá)水平升高，76種蛋白質(zhì)表達(dá)水平降低。ODS組以及混合痔組之間的差異表達(dá)蛋白中，共涉及216條通路，包括代謝通路(27種差異表達(dá)蛋白)、糖尿病性心肌病(13種差異表達(dá)蛋白)、阿爾茨海默病(10種差異表達(dá)蛋白)、血小板激活(10種差異表達(dá)蛋白)等，特別地，注釋到較多神經(jīng)性相關(guān)疾病的通路，具有臨床意義。

線粒體是細(xì)胞進(jìn)行有氧呼吸的主要場所，為細(xì)胞的生命活動提供能量，在細(xì)胞能量代謝、維持氧化還原平衡和調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡中起著重要作用[12]。線粒體功能障礙在多種疾病過程中發(fā)揮重要作用，如神經(jīng)系統(tǒng)疾病、腎臟疾病、肝臟疾病、心血管疾病、癌癥等[13-15]。線粒體呼吸鏈?zhǔn)蔷€粒體的主要功能單元，線粒體呼吸鏈?zhǔn)怯蓮?fù)合體Ⅰ(NADH-泛醌還原酶)、Ⅱ(琥珀酸-泛醌還原酶)、 Ⅲ(泛醌-細(xì)胞色素C還原酶)、 Ⅳ(細(xì)胞色素C氧化酶)、Ⅴ(ATP合成酶)組成。在氧化磷酸化過程中，線粒體呼吸鏈上的大部分電子向下傳遞到細(xì)胞色素C氧化酶，然后與質(zhì)子和氧反應(yīng)形成水。但是電子在經(jīng)過線粒體呼吸鏈傳遞過程中極易發(fā)生逃逸，與氧反應(yīng)形成超氧陰離子(O2-)自由基， 進(jìn)而形成過氧化氫(H2O2)等[16]。線粒體是細(xì)胞中ROS形成的主要部位。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)，在ODS病人的直腸組織標(biāo)本中線粒體呼吸鏈上多個蛋白發(fā)生明顯變化，包括NDUFS1和NDUFS3(復(fù)合體I的亞基)，COX5A 和COX7C(復(fù)合體IV的亞基),ATP5B 和 ATP5D(復(fù)合體V的亞基)。其中，NDUFS1是線粒體復(fù)合體I最大的核心亞基，在維持復(fù)合體I的結(jié)構(gòu)和功能方面起關(guān)鍵作用。在成纖維細(xì)胞以及星形膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元中的研究發(fā)現(xiàn)，NDUFS1 表達(dá)降低不利于線粒體復(fù)合體I 組裝成超級復(fù)合體，削弱氧氣消耗，導(dǎo)致線粒體ROS 升高。因此，我們推測線粒體呼吸鏈損害導(dǎo)致的線粒體ROS增多或細(xì)胞氧化應(yīng)激可能通過某些通路參與到ODS的發(fā)病過程。

腦組織具有很高的能量需求，有研究表明，線粒體功能障礙是抑郁癥、自閉癥和雙相情感障礙等精神疾病病理生理學(xué)的潛在機(jī)制[17-18]。在線粒體一系列的生理活動中，氧化磷酸化是為細(xì)胞提供能量的重要環(huán)節(jié)。有研究發(fā)現(xiàn)，COX5A、COX5B等參與氧化磷酸化的蛋白質(zhì)在抗壓模型小鼠中表達(dá)上調(diào)，這些蛋白的調(diào)節(jié)為小鼠面對壓力應(yīng)激時提供保護(hù)，降低其患抑郁癥等精神性疾病的風(fēng)險[19]。而在我們的研究中，COX5A蛋白表達(dá)下調(diào)，這可能說明ODS病人同時患上抑郁癥等精神疾病的風(fēng)險會增加。

ITPR3基因可編碼肌醇1，4，5三磷酸受體(IP3R)[20]，后者可介導(dǎo)Ca2+從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放到細(xì)胞質(zhì)，該信號傳導(dǎo)途徑被證實與哺乳動物腦神經(jīng)功能、外分泌等重要生理活動密切相關(guān)[21-22]。IP3R可在胃腸道的肌肉細(xì)胞中表達(dá)[23]，也可在腸道神經(jīng)元上發(fā)生表達(dá)[24]，胃腸道平滑肌收縮障礙或者胃腸神經(jīng)元受損均可導(dǎo)致胃腸道消化功能障礙。有研究發(fā)現(xiàn)，IP3R在調(diào)節(jié)體內(nèi)腸道的生理功能中起著關(guān)鍵作用，缺乏IP3R的小鼠腸動力顯著減弱，全腸道傳輸時間延長，導(dǎo)致假性腸梗阻，這說明IP3R可能和維持腸道的正常生理功能有關(guān)。同時，這項研究中初步發(fā)現(xiàn)IP3R的缺乏可能會導(dǎo)致腸神經(jīng)元結(jié)構(gòu)的細(xì)胞分化和功能出現(xiàn)微小的畸形或缺陷[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，ODS病人直腸組織標(biāo)本中ITPR3表達(dá)發(fā)生下調(diào)。因此，ITPR3的表達(dá)變化可能與ODS的潛在發(fā)病機(jī)制有一定的相關(guān)性。

綜上所述，基于iTRAQ技術(shù)的蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，ODS病人以及混合痔病人之間存在較多差異表達(dá)蛋白，這些蛋白質(zhì)涉及包括免疫過程在內(nèi)的眾多生物學(xué)過程及分子功能，可能參與了ODS分子發(fā)病機(jī)制。