陳枝挺 趙振華 蔡國(guó)恩 李元霄 林漢斌 劉昌云 葉欽勇

(福建醫(yī)科大學(xué) 1附屬協(xié)和醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，福建 福州 350001；2臨床神經(jīng)病學(xué)研究所；3福建省立臨床醫(yī)學(xué)院)

小膠質(zhì)細(xì)胞約占腦部膠質(zhì)細(xì)胞總數(shù)的20%，是巨噬細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的特殊存在形式〔1〕。當(dāng)受到外界不同刺激后，小膠質(zhì)細(xì)胞也類似巨噬細(xì)胞發(fā)生極化，分化為促炎作用為主的經(jīng)典活化型(M1)或抗感染作用為主的替代活化型(M2)〔2〕。腦梗死是一個(gè)復(fù)雜的病理生理過程，小膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)揮了神經(jīng)修復(fù)和神經(jīng)損傷的雙重作用〔3〕。了解小膠質(zhì)細(xì)胞的作用規(guī)律，調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞的分化，是缺血性腦卒中治療的一個(gè)重要策略。血紅蛋白(Hb)是紅細(xì)胞中攜帶氧的重要蛋白。紅細(xì)胞破壞后，游離的Hb與血液中的結(jié)合珠蛋白(Hp)快速結(jié)合，二者通過巨噬細(xì)胞表面的CD163受體內(nèi)吞而清除Hb〔4〕。腦出血〔5〕和蛛網(wǎng)膜下腔出血的研究〔6〕都證實(shí)了Hb會(huì)誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞活化，其促炎作用導(dǎo)致血管炎癥、腦水腫、外周炎性細(xì)胞黏附等，加重腦損傷。在嚴(yán)重的腦梗死部位，外周血液中的各種成分，包括Hp、紅細(xì)胞，可通過受損的血腦屏障進(jìn)入梗死區(qū)。病灶內(nèi)的小膠質(zhì)細(xì)胞可能受到紅細(xì)胞破壞后釋放的Hb和缺血缺氧的雙重刺激，細(xì)胞損傷和極化的情況尚不明確。小膠質(zhì)細(xì)胞在利用Hp清除游離Hb的過程中，是否發(fā)生了細(xì)胞活化和細(xì)胞極化的改變，也未見相關(guān)報(bào)道。本研究采用小鼠BV2細(xì)胞構(gòu)建氧葡萄糖剝奪-再恢復(fù)(OGDR)細(xì)胞模型，同時(shí)給予Hb和(或)Hp干預(yù)，觀察BV2細(xì)胞的損傷、激活情況及炎性因子表達(dá)的變化規(guī)律。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞來源 小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞BV2購(gòu)自中國(guó)國(guó)家生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞資源庫(kù)，在福建省老年醫(yī)學(xué)研究所液氮中常規(guī)保存。

1.2細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)及分組 將細(xì)胞復(fù)蘇于含10%胎牛血清的高糖DMEM中，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中以37℃、5%CO2條件進(jìn)行常培培養(yǎng)。0.25%胰酶-乙二胺四乙酸(EDTA)消化1∶8傳代，3～5 d傳代1次。把BV2細(xì)胞以2×105個(gè)/ml的密度接種于96孔板。為觀察Hb和Hp對(duì)常規(guī)培養(yǎng)的BV2細(xì)胞的影響，常規(guī)培養(yǎng)的BV2細(xì)胞分別加入不同濃度Hb(5、10、15、20 μmol/L Hb)、4 μmol/L Hp和15 μmol/L Hb+4 μmol/L Hp共培養(yǎng)1 d后，進(jìn)行相應(yīng)指標(biāo)的觀察。以常規(guī)培養(yǎng)的BV2細(xì)胞為對(duì)照組。

1.3OGDR干預(yù)及分組 把BV2細(xì)胞以2×105個(gè)/ml的密度分別接種于24和96孔板，次日，細(xì)胞匯合度達(dá)到50%～60%后用于后續(xù)試驗(yàn)。參考Badiola等〔7〕和楊碧瑩等〔8〕的方法，將含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基換成Earle平衡鹽溶液，把細(xì)胞培養(yǎng)板移入低氧培養(yǎng)箱中，連續(xù)通入含95%N2和5%CO2的混合氣體30 min，再放回37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)進(jìn)行氧葡萄糖剝奪，4 h后更換成含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)造成OGDR損傷，1 d后細(xì)胞損傷達(dá)30%～40%為造模成功。為觀察Hb和Hp OGDR損傷對(duì)BV2細(xì)胞的影響，在氧葡萄糖剝奪4 h后加入Hb和(或)Hp在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)1 d，分為OGDR組(OGDR損傷)、5、10、15、20 μmol/L Hb組(OGDR損傷+5、10、15、20 μmol/L Hb)、Hp組(OGDR損傷+4 μmol/L Hp)和Hb+Hp組(OGDR損傷+15 μmol/L Hb+4 μmol/L Hp)，干預(yù)1 d后，進(jìn)行相應(yīng)指標(biāo)觀察。

1.4細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK)8法檢測(cè)細(xì)胞存活率 細(xì)胞以2×105個(gè)/ml接種于96孔板，每組細(xì)胞設(shè)3個(gè)復(fù)孔。各組細(xì)胞接受干預(yù)1 d后棄去培養(yǎng)基，加入100 μl相應(yīng)培養(yǎng)基及10 μl CCK-8，培養(yǎng)箱中避光孵育0.5 h后，于多功能酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔的吸光度(A)值(波長(zhǎng)450 nm)，計(jì)算各組細(xì)胞的存活率。存活率(%)=處理組吸光度(A)值/對(duì)照組吸光度(A)值×100%。

1.5實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)mRNA的表達(dá) 按RNA提取試劑盒操作說明書提取總RNA。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。得到的cDNA再進(jìn)行后續(xù)的RT-PCR檢測(cè)相應(yīng)的mRNA表達(dá)。M1型小膠質(zhì)細(xì)胞的高表達(dá)基因包括誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)、分化群(CD)32和CD11b，M2型小膠質(zhì)細(xì)胞的高表達(dá)基因包括CD206、精氨酸酶(Arg)1、幾丁質(zhì)酶樣蛋白(CHIL)3和CD163。PCR引物序列分別為：iNOS正向：CAAGCACCTTGGAAGAGGAG，反向：AAGGCCAAACACAGCATAC；CD32正向：AATCCTGCCGTTCCTACTGATC，反向：GTGTCACCGTGTCTTCCTTGAG；CD11b正向：CCAAGACGATCTCAGCATCA，反向：TTCTGGCTTGCTGAATCCTT；CD206正向：CAA-GGAAGGTTGGCATTTGT；反向：CCTTTCAGTCCTTTGCAAGC；Arg1正向：TCACCTGAGCTTTGATGTCG；反向：CTGAAAGGAGCCCTGTCTTG；CHIL3正向：CAGGGTAATGAGTGGGTTGG，反向：CACGGCACC-TCCTAAATTGT；CD163正向：ACGGGTGGTGAAAACAAGTGCT，反向：TCTCAGTTTCAGGTCTGCTCCA；內(nèi)參β-肌動(dòng)蛋白(actin)正向：AGGCATCCTGACCCTGAAGTAC，反向：TCTTCATGAGGTAGTCTGTCAG。PCR條件為98℃，5 min；98℃，5 s；60℃，30 s，40個(gè)循環(huán)。PCR結(jié)束后，進(jìn)行熔煉曲線分析擴(kuò)增曲線在儀器自帶軟件分析獲取Ct值，mRNA相對(duì)表達(dá)量=2-(△CT實(shí)驗(yàn)組目的基因-△CT對(duì)照組內(nèi)參基因)。

1.6酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELSIA)檢測(cè)炎癥因子白細(xì)胞介素(IL)-6、IL-10和肺瘤壞死因子(TNF)-α表達(dá) 細(xì)胞以2×105個(gè)/ml接種于24孔板，每組細(xì)胞設(shè)3個(gè)復(fù)孔。到達(dá)干預(yù)時(shí)間后，吸取細(xì)胞培養(yǎng)液，3 000 r/min離心10 min，吸取上清，根據(jù)ELISA試劑盒說明書，檢測(cè)IL-6、IL-10和TNF-α表達(dá)。

1.7Western印跡檢測(cè)GPX4蛋白表達(dá) 提取細(xì)胞總蛋白，采用二喹啉甲酸(BCA)法測(cè)定蛋白濃度。以β-actin為內(nèi)參。10%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，通過電轉(zhuǎn)將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上，3%脫脂奶粉封閉1 h。分別加入一抗(1∶500 GPX4抗體，1∶2 000 β-actin抗體)4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，加入相應(yīng)二抗(1∶5 000)室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，電化學(xué)發(fā)光(ECL)法顯色，化學(xué)發(fā)光成像儀拍照。采用Image J分析軟件分析條帶的灰度值，比較目的條帶和內(nèi)參的比值。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，對(duì)于方差齊的樣本，兩兩比較采用LSD法檢驗(yàn)；對(duì)于方差不齊的樣本，兩兩比較采用DunnettT3法檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組BV2細(xì)胞生存率比較 常規(guī)培養(yǎng)條件下，BV2細(xì)胞給予不同濃度的Hb、Hp及Hb+Hp進(jìn)行干預(yù)，各組細(xì)胞存活率干預(yù)前后比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。OGDR干預(yù)BV2細(xì)胞的同時(shí)加入不同濃度Hb和(或)4 μmol/L Hp進(jìn)行干預(yù)，與對(duì)照組比較，OGDR損傷的各組細(xì)胞存活率明顯下降(P<0.05)；與OGDR組相比，15、20 μmol/L Hb組及Hb+Hp組細(xì)胞存活率明顯下降(P<0.05)；與15 μmol/L Hb組相比，Hb+Hp組細(xì)胞存活率明顯下降(P<0.05)。見表1。

表1 各組BV2細(xì)胞存活率的比較

2.2各組BV2細(xì)胞炎癥因子比較 與對(duì)照組、OGDR組和15 μmol/L Hb組相比，Hb+Hp組IL-6及TNF-α水平明顯升高(P<0.010)。各組IL-10水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

2.3各組BV2細(xì)胞極化標(biāo)志物的mRNA表達(dá)比較 各組CHIL3、Arg-1、CD163和CD11b mRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)；各組CD206、iNOS和CD32 mRNA表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)。見表2。

2.4各組BV2細(xì)胞GPX4蛋白表達(dá)比較 與對(duì)照組〔(100.0±0.0)%〕、OGDR組〔(117.7±21.0)%〕和15 μmol/L Hb組〔(104.3±7.5)%〕對(duì)比，Hb+Hp組GPX4表達(dá)量〔(62.0±15.1)%〕明顯降低(P<0.05)。見圖1。

1～4:對(duì)照組，OGDR組，15 μmol/L Hb組，Hb+Hp組圖1 各組BV2細(xì)胞GPX4蛋白表達(dá)

3 討 論

小膠質(zhì)細(xì)胞大多處于靜息狀態(tài)，當(dāng)其受到缺血缺氧損傷微環(huán)境的刺激后，可以表現(xiàn)出巨噬細(xì)胞樣功能和細(xì)胞極化現(xiàn)象，同時(shí)產(chǎn)生各種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，通過旁分泌的方式影響神經(jīng)血管單元內(nèi)神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞〔9〕。M1型的小膠質(zhì)細(xì)胞可誘導(dǎo)促炎因子(如CD16 Fc受體、CD32、CD64、IL-1、IL-6、IL-12、IL-23和TNF-α)上調(diào)，能加重神經(jīng)損傷，而M2型的小膠質(zhì)細(xì)胞能夠釋放抗炎因子(如IL-10、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β)和一些生長(zhǎng)因子，抑制炎癥反應(yīng)而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用〔10〕。因此，調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞的極化，減少其過度的促炎效應(yīng)，增加其抗炎效應(yīng)，是腦卒中治療的一個(gè)重要策略。

小膠質(zhì)細(xì)胞在發(fā)生腦缺血損害時(shí)表現(xiàn)出規(guī)律性的極化現(xiàn)象。首先，極化現(xiàn)象與腦缺血損害的時(shí)間有關(guān)。Hu等〔11〕對(duì)小鼠局灶短暫性腦缺血模型的研究發(fā)現(xiàn)，M1型小膠質(zhì)細(xì)胞在造模第3天后逐漸升高，M2型小膠質(zhì)細(xì)胞在造模的第1～3天開始升高并于第3～5天達(dá)峰后逐漸減少或向M1型轉(zhuǎn)化。Suenaga等〔12〕永久閉塞大腦中動(dòng)脈和頸總動(dòng)脈制作小鼠腦缺血模型發(fā)現(xiàn)，M1型和M2型小膠質(zhì)細(xì)胞都在造模的第3天開始顯著上升，并且前者在第14天到達(dá)高峰逐漸回落，而后者在第7天達(dá)到高峰。其次，極化現(xiàn)象與缺血損害的位置有關(guān)。Perego等〔13〕對(duì)持續(xù)性大腦中動(dòng)脈閉塞的小鼠腦缺血模型的研究發(fā)現(xiàn)，在造模后24 h后，CD68為代表的M1型細(xì)胞主要在缺血周邊區(qū)域大量表達(dá)，而CHIL3和CD206為代表的M2型細(xì)胞在缺血核心區(qū)表達(dá)更高；在造模7 d后，梗死區(qū)域的CD68表達(dá)明顯增加，特別在缺血核心區(qū)域增加更為明顯，而M2型細(xì)胞則無明顯變化。

腦缺血損傷是一個(gè)伴隨著血腦屏障破壞的病理生理過程。當(dāng)梗死區(qū)域發(fā)生嚴(yán)重的血管壁破壞和血腦屏障功能受損時(shí)，血管中物質(zhì)可能大量進(jìn)入缺血損傷的腦組織引起和加速出血轉(zhuǎn)化、腦水腫等現(xiàn)象，加重神經(jīng)功能惡化〔14〕。已有研究表明紅細(xì)胞破裂后釋放出的Hb就一種可以誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞M1型極化的物質(zhì)。Peng等〔15〕在常規(guī)培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞中加入Hb，小膠質(zhì)細(xì)胞出現(xiàn)了M1型極化現(xiàn)象，IL-1β、TNF-α和IL-6等mRNA表達(dá)和分泌都出現(xiàn)升高。Wei等〔16〕使用Hb干預(yù)BV2細(xì)胞，也觀察到iNOS和CD206細(xì)胞的比例明顯升高，同時(shí)在蛛網(wǎng)膜下腔出血的小鼠模型中也發(fā)現(xiàn)了小膠質(zhì)細(xì)胞的增殖和M1極化現(xiàn)象。腦卒中受累區(qū)域有可能受到缺血缺氧損傷和游離Hb的雙重打擊，其中的小膠質(zhì)細(xì)胞的極化現(xiàn)象還未見相關(guān)的研究報(bào)道。本研究結(jié)果提示，BV2細(xì)胞經(jīng)OGDR與Hb刺激后，可以誘導(dǎo)M1型極化。在此基礎(chǔ)上加用Hp干預(yù)后的結(jié)果提示，Hp促進(jìn)了BV2細(xì)胞進(jìn)一步向M1型極化。本研究提示在缺血缺氧和Hb的共同刺激可促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞的促炎反應(yīng)，Hp則進(jìn)一步加速了M1型極化，可能加重局部的炎癥反應(yīng)。

紅細(xì)胞破壞后，產(chǎn)生的血紅素鐵可與內(nèi)源性的過氧化氫產(chǎn)生自由基，加重周圍組織的損傷。同時(shí)，Hb可快速且不可逆地結(jié)合一氧化氮，導(dǎo)致高鐵血紅蛋白生成，影響一氧化氮調(diào)節(jié)血管舒張的生物學(xué)活性。Hb和清道夫受體結(jié)合低下，只有與Hp結(jié)合后，二者的復(fù)合物才能被清道夫受體結(jié)合，被巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬而分解〔17〕。游離的Hb會(huì)誘發(fā)腦水腫、炎性反應(yīng)及神經(jīng)元死亡〔18〕。但是關(guān)于Hb是否直接導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞損傷的研究報(bào)道較少。Wang等〔19〕采用20 μmol/L Hb干預(yù)小膠質(zhì)細(xì)胞可誘導(dǎo)自噬反應(yīng)，但是作者并未對(duì)細(xì)胞存活率的改變進(jìn)行研究。本研究發(fā)現(xiàn)，在常規(guī)培養(yǎng)條件下，Hb在短時(shí)間內(nèi)并不會(huì)對(duì)的BV2細(xì)胞的存活造成明顯影響。但是在OGDR損傷的同時(shí)，隨著Hb干預(yù)濃度增加，可引起B(yǎng)V2細(xì)胞的存活率明顯下降。說明Hb加重了OGDR對(duì)BV2細(xì)胞的損傷。在此基礎(chǔ)上同時(shí)給予Hp干預(yù)，BV2細(xì)胞存活率進(jìn)一步下降，說明Hp促進(jìn)BV2細(xì)胞攝取Hb，可能進(jìn)一步加重OGDR對(duì)細(xì)胞的損傷。這些結(jié)果提示在特定情況下較大劑量Hb及Hp增加Hb攝取，可造成Hb對(duì)BV2細(xì)胞的毒性。內(nèi)源性GPX4是一種硒依賴的內(nèi)源性抗氧化酶，其主要通過抵抗脂質(zhì)過氧化物而阻止細(xì)胞死亡〔20〕。本研究結(jié)果提示BV2細(xì)胞的損傷可能與抗氧化酶缺乏有關(guān)。

綜上，在OGDR條件下，Hb和Hp造成了BV2細(xì)胞的損傷，與抗氧化蛋白GPX4不足有關(guān)，同時(shí)促進(jìn)了細(xì)胞的M1型極化。