蘇 宏 何遠(yuǎn)山 馮 霖 黃用豪

(1 青海省第五人民醫(yī)院普通外科，西寧市 810000，電子郵箱：liu520bing@aliyun.com；2 海南醫(yī)學(xué)院臨床學(xué)院，?？谑?571199)

結(jié)直腸癌是人類常見的惡性腫瘤之一，具有較高的病死率[1]。2019年全國癌癥中心統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，2015年我國結(jié)直腸癌發(fā)病率在全部惡性腫瘤中位居第3位，病死率位居第5位[2]，這表明結(jié)直腸癌的防治形勢(shì)嚴(yán)峻，而早診斷、早治療的患者的5年生存率可達(dá)90%[3]。目前，結(jié)直腸癌的早期診斷方法分為侵入性檢查和非侵入性檢查。非侵入性檢查包括糞便檢查、血液檢查及放射檢查，例如糞便潛血試驗(yàn)和腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)，但這兩種方法的檢測(cè)敏感性和特異性均較差[4]。侵入性檢查包括內(nèi)窺鏡檢查等，可直接觀察結(jié)直腸病變，并獲得病理標(biāo)本[5]。在許多國家(包括美國、德國、波蘭、奧地利和意大利)，內(nèi)窺鏡檢查是結(jié)直腸癌篩查的主要方法[5]。但由于內(nèi)窺鏡很難在形態(tài)學(xué)上對(duì)病灶異型程度和是否發(fā)生浸潤作出判斷，因此內(nèi)窺鏡診斷早期癌的準(zhǔn)確性受到影響[6]。微小RNA是一類小的單鏈非編碼RNA，在多種生物學(xué)過程(包括細(xì)胞增殖、凋亡和器官發(fā)育)中發(fā)揮重要作用，可以用作人類疾病診斷和預(yù)后評(píng)估的重要工具[7]。目前，已發(fā)現(xiàn)多種微小RNA(例如微小RNA-21和微小RNA-92a)可作為結(jié)直腸癌的診斷標(biāo)志物[8]。此外，有研究表明，微小RNA-107(microRNA-107,miR-107)和微小RNA-34a(microRNA-34a,miR-34a)可影響結(jié)直腸癌的發(fā)生和發(fā)展[9-10]。本研究探討結(jié)直腸癌患者血清miR-107和miR-34a的表達(dá)情況及二者診斷結(jié)直腸癌的價(jià)值，以期為結(jié)直腸癌的早期診斷提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2016年1月至2018年12月青海省第五人民醫(yī)院收治的50例結(jié)直腸癌患者為結(jié)直腸癌組，50例健康人群為對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)結(jié)直腸癌患者均接受結(jié)直腸內(nèi)窺鏡活檢，且經(jīng)病理確診；(2)參照第8版美國癌癥聯(lián)合委員會(huì)癌癥分期手冊(cè)[11]，結(jié)直腸癌為Ⅰ～Ⅳ期；(3)未接受其他手術(shù)治療或放化療；(4)病例資料記錄完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)伴有嚴(yán)重并發(fā)癥；(2)病例資料記錄缺失。結(jié)直腸癌組中男性27例、女性23例，年齡32～80(51.14±6.18)歲；腫瘤呈高分化15例，中分化24例，低分化11例；TNM分期Ⅰ期3例，Ⅱ期14例，Ⅲ期21例，Ⅳ期12例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移31例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移19例。對(duì)照組中男性29例、女性21例，年齡30～75(50.97±3.28)歲。兩組研究對(duì)象的性別、年齡差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。本研究獲青海省第五人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均對(duì)本研究知情同意并簽署知情同意書。

1.2 微小RNA檢測(cè)方法

1.2.1 主要儀器與試劑：超微量紫外分光光度計(jì)(型號(hào)：DS11)購自美國DeNovix公司；熒光定量PCR儀(型號(hào)：CFX96)和普通PCR儀(型號(hào)：C1000)均購自美國Bio-Rad公司；血清miRNA提取試劑盒(Lot#O3330)、miRcute增強(qiáng)型miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒(KR211，Lot#T9998)、miRcute miRNA熒光定量檢測(cè)試劑盒(FP411，產(chǎn)品編號(hào)：4992887)均購自天根生化科技(北京)有限公司；所有引物均由北京六合華大基因科技有限公司合成。

1.2.2 血清標(biāo)本的制備：抽取所有受試者清晨空腹?fàn)顟B(tài)下的外周靜脈血5 mL，室溫靜置30 min后，在4℃條件下，3 000 r/min離心10 min，取上層血清，置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 總RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄：使用血清微小RNA提取試劑盒提取血清中的總RNA，使用超微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的濃度和純度，A260/280值在1.8～2.2之間為合格。使用miRcute增強(qiáng)型miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒將樣本總RNA反轉(zhuǎn)錄成單鏈cDNA。上述操作均嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行。

1.2.4 血清miR-107、miR-34a相對(duì)表達(dá)水平的檢測(cè)：使用miRcute miRNA熒光定量檢測(cè)試劑盒，以U6作為內(nèi)參基因，檢測(cè)血清miR-107、miR-34a的相對(duì)表達(dá)水平。miR-107上游引物(5′-3′)為ACACTCCAGCTGGGAGCAGCATTGТACAG，下游引物(5′-3′)為CTCAACTGGTGTCGTGGA；miR-34a上游引物(5′-3′)為GGCAGTGTCTTAGCTGGTTG，下游引物(5′-3′)為GCGAGCACAGAATTAATACGAC；內(nèi)參基因U6上游引物(5′-3′)為CTCGCTTCGGCAGCACATATACT，下游引物(5′-3′)為CGAATTTGCGTGTCATССTTGCG。熒光定量反應(yīng)體系共20 μL，包括10 μL 2×miRcute miRNA Premix，1.6 μL 50×ROX參比染料，0.5 μL 10 μmol/L的正向引物，0.5 μL 10 μmol/L的反向引物，1.5 μL cDNA，5.9 μL ddH2O。反應(yīng)條件為94 ℃ 2 min；94 ℃ 20 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，并重復(fù)3次平行實(shí)驗(yàn)，最終取平均值進(jìn)行計(jì)算。采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-107和miR-34a基因的相對(duì)表達(dá)量，其中ΔCt=Ct目的基因-CtU6，ΔΔCt=ΔCt結(jié)直腸癌組-ΔCt對(duì)照組。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以(x±s)表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；非正態(tài)分布的計(jì)量資料以[M(P25，P75)]表示，組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)或Mann-Whitneyu檢驗(yàn)。采用Spearman秩相關(guān)檢驗(yàn)分析結(jié)直腸癌患者的血清微小RNA相對(duì)表達(dá)水平與臨床病理特征的相關(guān)性。繪制受試者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲線評(píng)估血清miR-107和miR-34a單獨(dú)診斷及二者聯(lián)合診斷結(jié)直腸癌的效能。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組血清miR-107和miR-34a的表達(dá)情況 結(jié)直腸癌組、對(duì)照組血清中miR-107的相對(duì)表達(dá)量分別為(13.65±4.26)、(5.82±1.96)，miR-34a的相對(duì)表達(dá)量分別為(1.98±0.49)、(16.70±4.29)。其中，結(jié)直腸癌組miR-107的相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組(t=11.807，P<0.001)，miR-34a的相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組(t=24.106，P<0.001)。

2.2 不同臨床病理特征結(jié)直腸癌患者miR-107和miR-34a的表達(dá)情況 Ⅰ期結(jié)直腸癌患者的血清miR-107相對(duì)表達(dá)量低于Ⅳ期患者，而血清miR-34a相對(duì)表達(dá)量高于Ⅳ期患者(均P<0.05)；高分化結(jié)直腸癌患者的血清miR-34a相對(duì)表達(dá)量高于低分化患者(P<0.05)；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌患者的血清miR-34a相對(duì)表達(dá)量低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者(P<0.05)。見表1。

表1 不同臨床病理特征結(jié)直腸癌患者miR-107和miR-34a相對(duì)表達(dá)量的比較[M(P25，P75)]

進(jìn)一步行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示結(jié)直腸癌患者的血清miR-107相對(duì)表達(dá)量與TNM分期呈正相關(guān)，血清miR-34a相對(duì)表達(dá)量與分化程度呈正相關(guān)，與TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況呈負(fù)相關(guān)(均P<0.05)。見表2。

表2 結(jié)直腸癌患者血清miR-107和miR-34a相對(duì)表達(dá)量與臨床病理特征的相關(guān)性

2.3 ROC曲線分析結(jié)果 以病理診斷結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，采用ROC曲線分析血清miR-107和miR-34a相對(duì)表達(dá)量對(duì)結(jié)直腸癌的診斷效能。結(jié)果顯示，miR-107相對(duì)表達(dá)量診斷結(jié)直腸癌的曲線下面積為0.849(95%CI:0.793～0.905,P<0.001)，診斷靈敏度和特異度分別為83.7%和81.5%；miR-34a相對(duì)表達(dá)量診斷結(jié)直腸癌的曲線下面積為0.959(95%CI:0.932～0.986,P<0.001)，診斷靈敏度和特異度分別為92.9%和91.3%；二者聯(lián)合診斷結(jié)直腸癌的曲線下面積為0.983(95%CI:0.977～0.991,P<0.001)，診斷靈敏度和特異度分別為98.7%和97.4%。見圖1。

圖1 血清miR-107、miR-34a相對(duì)表達(dá)量單獨(dú)及聯(lián)合診斷結(jié)直腸癌的ROC曲線

3 討 論

結(jié)直腸癌是臨床常見的惡性腫瘤，患者的病死率較高。微小RNA在結(jié)直腸癌中具有抑癌或致癌作用，因此，微小RNA對(duì)結(jié)直腸癌具有一定的診斷價(jià)值[12]。相關(guān)研究表明，miR-107對(duì)結(jié)直腸癌的發(fā)生和發(fā)展具有重要作用[13-14]。例如，Chen等[13]報(bào)告，在結(jié)直腸癌細(xì)胞模型中，miR-103/107通過靶向轉(zhuǎn)移抑制因子死亡相關(guān)蛋白激酶(death-associated protein kinase,DAPK)和Kruppel 樣因子4(Kruppel-like factor 4,KLF4)來促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移；此外，miR-103/107高表達(dá)、DAPK和KLF4低表達(dá)與結(jié)直腸癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)。Molina-Pinelo等[14]報(bào)告，miR-107可評(píng)估結(jié)直腸癌患者對(duì)氟尿嘧啶標(biāo)準(zhǔn)化療的反應(yīng)。此外，miR-34a也與結(jié)直腸癌的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。miR-34家族由miR-34a、miR-34b和miR-34c組成，其參與細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡過程，具有抑制腫瘤的特性[15]。miR-34a可通過靶向原癌基因Fra-1抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲；結(jié)腸癌組織中缺乏miR-34a也會(huì)導(dǎo)致P53突變和缺乏，從而加速癌癥的發(fā)展[16]。因此，本研究探討miR-107和miR-34a在結(jié)直腸癌患者血清中的表達(dá)及其診斷結(jié)直腸癌的價(jià)值。

Liu等[17]的研究表明，miR-107在結(jié)直腸癌的癌組織和細(xì)胞株中均呈高表達(dá)。另外，鄒德勝等[18]報(bào)告，結(jié)直腸癌患者血清miR-107的表達(dá)量高于正常人群，miR-107的表達(dá)量與結(jié)直腸癌患者的TNM分期有關(guān)。本研究中，結(jié)直腸癌患者血清miR-107的相對(duì)表達(dá)量高于正常人群，且血清miR-107的相對(duì)表達(dá)量與結(jié)直腸癌患者的TNM分期呈正相關(guān)(均P<0.05)，這與鄒德勝等[18]的研究結(jié)果相似。這表明miR-107與直腸癌的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)。另外，張肖麗等[19]發(fā)現(xiàn)，除了TNM分期，miR-107的表達(dá)量還與結(jié)直腸癌患者的腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。但本研究中，結(jié)直腸癌患者的血清miR-107的相對(duì)表達(dá)量與腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移并無相關(guān)性(均P>0.05)，這可能與本研究收集的結(jié)直腸癌樣本腫瘤分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的占比與上述研究不同有關(guān)。

Badr等[20]報(bào)告，與健康對(duì)照者相比，結(jié)直腸癌患者miR-34a的表達(dá)量顯著降低，且TNM分期Ⅰ期結(jié)直腸癌患者miR-34a的表達(dá)量最高，Ⅲ期結(jié)直腸癌患者miR-34a的表達(dá)量最低。Ma等[10]也報(bào)告，與健康對(duì)照者相比，結(jié)直腸癌患者miR-34a的表達(dá)量顯著降低。這些研究均表明，miR-34a基因也與結(jié)直腸癌的發(fā)生密切相關(guān)。本研究中，結(jié)直腸癌患者血清miR-34a的相對(duì)表達(dá)量低于正常人群，且miR-34a 相對(duì)表達(dá)量與結(jié)直腸癌患者的TNM分期、分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均相關(guān)(均P<0.05)，這與雒亞蒙等[21]的研究結(jié)果相似。以上研究結(jié)果提示，miR-34a低表達(dá)不僅與結(jié)直腸癌的發(fā)生有關(guān)，還能反映腫瘤的進(jìn)展情況。

目前，還沒有公認(rèn)的診斷結(jié)直腸癌靈敏度和特異度均較高的微小RNA，因此，多個(gè)標(biāo)志物的聯(lián)合檢測(cè)對(duì)疾病的診斷有更大的參考價(jià)值。本研究的ROC曲線分析結(jié)果顯示，血清miR-107和miR-34a相對(duì)表達(dá)量診斷結(jié)直腸癌的曲線下面積分別為0.849、0.959，靈敏度分別為83.7%、92.9%，特異度分別為81.5%、91.3%，提示兩者對(duì)結(jié)直腸癌具有較好的診斷效能；而二者聯(lián)合診斷時(shí)，ROC曲線下面積可達(dá)0.983，診斷靈敏度和特異度可提高至98.7%和97.4%，提示聯(lián)合檢測(cè)血清miR-107和miR-34a的相對(duì)表達(dá)量，可進(jìn)一步提高對(duì)結(jié)直腸癌的診斷效能。此外，血清微小RNA的檢測(cè)不具有創(chuàng)傷性，有利于重復(fù)檢測(cè)，可用于疾病的監(jiān)控和評(píng)估。

綜上所述，結(jié)直腸癌患者血清中miR-107的表達(dá)上調(diào)，而miR-34a的表達(dá)下調(diào)，二者均可反映腫瘤的進(jìn)展情況且均可用于結(jié)直腸癌的輔助診斷，二者聯(lián)合應(yīng)用時(shí)的診斷效能更高。