紀偉超 劉 杰 王曉靜

(河北省以嶺醫(yī)院腎病科，石家莊市 050051,電子郵箱：jiweichao2244@163.com)

尿毒癥是慢性腎功能衰竭的終末階段，維持性血液透析(maintenance hemodialysis，MHD)是目前治療尿毒癥的手段之一，可有效延長患者生命[1]。研究表明，MHD治療雖有效，但并發(fā)癥發(fā)生率高，其中血管鈣化是MHD患者最常見的并發(fā)癥[2]。血管鈣化與尿毒癥所致心血管并發(fā)癥的關(guān)系較為密切，可影響患者的生存質(zhì)量和長期生存率[3]。微小RNA是一類長度為21～25個核苷酸的非編碼RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平參與調(diào)節(jié)機體的生物學功能，在細胞增殖和分化、炎性反應(yīng)、纖維化等過程中發(fā)揮著重要作用。有學者發(fā)現(xiàn)，miR-21與miR-155-5p在腎臟疾病中發(fā)揮著重要作用，尤其是miR-21參與了急性腎損傷、腎臟纖維化、腎臟腫瘤等疾病的發(fā)展[4]。行血液透析的尿毒癥患者體內(nèi)存在調(diào)節(jié)性T淋巴細胞(regulatory T lymphocyte，Treg)/輔助性T淋巴細胞17(helper T lymphocyte 17,Th17)失衡，這可導致血管鈣化的發(fā)生或加劇[5]。而有研究表明，miR-21與miR-155-5p在調(diào)節(jié)Treg/Th17平衡中發(fā)揮著重要作用：促炎癥消退介質(zhì)Maresin 1可通過miR-21改善類風濕關(guān)節(jié)炎患者的Treg/Th17失衡[6]；慢性牙周炎患者外泌體中的miR-155-5p可通過組蛋白去乙酰化酶調(diào)節(jié)Treg/Th17平衡[7]。因此，我們認為miR-21、miR-155-5p也許能通過調(diào)節(jié)Treg/Th17平衡從而改善行MHD的尿毒癥患者的血管鈣化情況。但目前未發(fā)現(xiàn)有關(guān)miR-21、miR-155-5p在行MHD的尿毒癥患者外周血中的表達情況及其與血管鈣化之間關(guān)系的研究。為此，本研究采用實時熒光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR，qRT-PCR)法檢測行MHD的尿毒癥患者外周血miR-21、miR-155-5p的表達情況，并探討二者與血管鈣化的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2018年1月至2019年12月在我院血液凈化中心行MHD的100例尿毒癥患者，其中男性68例、女性32例，年齡28～75(57.60±9.40)歲，透析齡8～42(28.30±12.50)個月。納入標準：(1)符合尿毒癥的診斷標準[8]；(2)臨床資料完整；(3)均對本研究知情同意并簽署知情同意書。排除標準：(1)伴有急慢性感染、惡性腫瘤或者處于自體免疫性疾病活動期者；(2)近期使用糖皮質(zhì)激素或免疫抑制劑治療者；(3)發(fā)生心臟瓣膜鈣化者；(4)存在嚴重低白蛋白血癥(血清白蛋白<30 g/L)、貧血(血紅蛋白≤59 g/L)者。通過腹部側(cè)位X 線片評估所有患者的血管鈣化情況，根據(jù)腹主動脈鈣化評分(abdominal aortic calcification score，AACS)[9]，將患者分為無血管鈣化組(AACS=0分)43例和血管鈣化組(AACS≥1分)57例。本研究已通過我院醫(yī)學倫理委員會審批。

1.2 主要試劑與儀器 RNA提取試劑盒(批號：9112)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號：RR036A)、qRT-PCR試劑盒(批號：RR820A)均購自大連TaKaRa公司；miR-21、miR-155-5p引物由上海吉瑪公司合成；CD25-異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)單克隆抗體(批號：11-0250-41)、CD4-藻紅蛋白(phycoerythrin,PE)單克隆抗體(批號：25-4714-80)、CD3-別藻藍蛋白(allophycocyanin,APC)單克隆抗體(批號：47-0032-82)、PE-白細胞介素(interleukin,IL)-17單克隆抗體(批號：25-7179-41)、PE-叉頭框蛋白P3(forkhead box protein P3,Foxp3)單克隆抗體(批號：12-5773-82)均購自美國eBioscience公司；Ficoll 淋巴細胞分離液(批號：LTS1077-1)購自天津市灝洋生物制品科技有限責任公司；CD4-多甲藻黃素-葉綠素-蛋白質(zhì)(Peridinin-Chlorophyll-Protein, PerCP)復合物抗體購自Abcam公司(批號：ab210374)；全段甲狀旁腺激素(intact parathyroid hormone，iPTH)試劑盒(批號：E-EL-H6076)、轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor，TGF)-β試劑盒(批號：E-EL-0162c)均購自Elabscience公司；IL-6(批號：ab178013)、IL-10(批號：ab185986)、IL-17(批號：ab119535)、骨形成蛋白2(bone morphogenetic protein 2，BMP-2；批號：ab119581)、C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein，CRP；批號：ab260058)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α;批號：ab181421)試劑盒均購自美國Abcam公司。ABI7500型熒光定量PCR儀購自美國ABI公司，F(xiàn)ACSCalibur型流式細胞儀購自美國BD公司，7600型自動生化儀購自日立公司。

1.3 研究方法

1.3.1 樣品采集及保存：采集患者透析前空腹靜脈血12 mL，其中5 mL室溫靜置20 min，2 000 r/min離心15 min后收集血清，于-80℃環(huán)境中保存，用于檢測血清中白蛋白、磷、鈣、iPTH、IL-6、IL-10、IL-17、BMP-2、CRP、TNF-α水平。2 mL全血用于檢測血紅蛋白。將剩余5 mL血液置于抗凝管，用Ficoll 淋巴細胞分離液行密度梯度離心，分離得到外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，置于-80℃環(huán)境中保存，用于檢測Treg、Th17。

1.3.2 qRT-PCR法檢測外周血miR-21、miR-155-5p相對表達水平：采集患者透析前的空腹靜脈血2 mL。根據(jù)RNA提取試劑盒說明書操作要求提取外周血RNA，用紫外分光光度計檢測總RNA純度，以A260/280值在1.8～2.0之間為純度較好，以純度較好的總RNA進行后續(xù)實驗。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，使用qRT-PCR試劑盒檢測外周血miR-21、miR-155-5p相對表達水平。引物序列見表1。PCR的反應(yīng)體系共25 μL，包括上下游引物各0.5 μL、cDNA 2 μL、SYBR Green Mix 8 μL，加雙蒸水至25 μL。反應(yīng)條件為95℃ 120 s，95℃ 60 s，65℃ 45 s，72℃ 30 s，共40個循環(huán)。每個樣品設(shè)置3個復孔。用U6作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算外周血miR-21、miR-155-5p相對表達水平。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.3 流式細胞術(shù)檢測Treg、Th17 水平：(1)檢測PBMC中Treg水平。取200 μL的PBMC懸液，依次加入CD25-FITC、CD4-PerCP、PE-Foxp3單克隆抗體各10 μL，37℃避光孵30 min，磷酸緩沖鹽溶液洗滌3次，室溫下1 500 r/min離心10 min,再加入0.5 mL磷酸緩沖鹽溶液重懸，使用流式細胞儀檢測PBMC中Treg水平(即CD4+CD25+Foxp3+T淋巴細胞占CD4+T淋巴細胞的比例)。(2)檢測PBMC中Th17水平。取200 μL的PBMC懸液，依次加入CD3-APC、CD4-PE、PE-IL-17單克隆抗體各10 μL，37℃避光孵20 min,磷酸緩沖鹽溶液洗滌3次，室溫下1 500 r/min離心10 min,再加入0.5 mL磷酸緩沖鹽溶液重懸，使用流式細胞儀檢測PBMC中Th17水平(即CD3+CD4+IL-17+T淋巴細胞占CD4+T淋巴細胞的比例)。

1.3.4 其他指標的檢測：采用自動生化分析儀檢測血清白蛋白水平，血細胞分析儀檢測外周血血紅蛋白水平，化學發(fā)光法檢測血清鈣、血清磷水平；采用ELISA檢測血清iPTH、IL-6、IL-10、IL-17、BMP-2、CRP、TNF-α水平，按照相應(yīng)試劑盒說明書進行操作。

1.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計數(shù)資料以例數(shù)和百分比表示，組間比較采用χ2檢驗；正態(tài)分布的計量資料以(x±s)表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；變量的相關(guān)性分析采用Pearson檢驗。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組患者基線資料、代謝和炎癥指標的比較 兩組患者年齡、性別、體質(zhì)指數(shù)、透析齡、全血血紅蛋白和血清白蛋白水平比較，差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)，組間具有可比性。血管鈣化組患者血清磷、鈣、BMP-2、iPTH、CRP、TNF-α水平均高于無血管鈣化組患者(均P<0.05)。見表2。

表2 兩組患者基線資料、代謝和炎癥指標的比較

2.2 兩組患者PBMC中Treg、Th17水平和外周血miR-21、miR-155-5p相對表達水平的比較 血管鈣化組患者PBMC中的Th17水平、Th17/Treg比值，以及外周血miR-155-5p相對表達水平均高于無血管鈣化組，而PBMC中的Treg水平與外周血miR-21相對表達水平均低于無血管鈣化組(均P<0.05)，見表3。

表3 兩組患者Treg、Th17水平和miR-21、miR-155-5p相對表達水平的比較(x±s)

2.3 兩組患者血清中Th17和Treg相關(guān)細胞因子水平的比較 血管鈣化組患者血清IL-17、IL-6水平均高于無血管鈣化組，血清IL-10、TGF-β水平均低于無血管鈣化組(均P<0.05)，見表4。

表4 兩組患者血清Th17和Treg相關(guān)細胞因子水平的比較(x±s,ng/L)

2.4 AACS與miR-21、miR-155-5p及代謝指標的相關(guān)性 在行MHD的尿毒癥患者中，AACS與外周血miR-155-5p 相對表達水平，以及血清磷、鈣、BMP-2、iPTH水平均呈正相關(guān)，與外周血miR-21相對表達水平呈負相關(guān)(均P<0.05)，見表5。

表5 AACS與miR-21、miR-155-5p及代謝指標的相關(guān)性

2.5 外周血miR-21、miR-155-5p相對表達水平與Th17/Treg比值的相關(guān)性 在行MHD的尿毒癥患者中，外周血miR-21相對表達水平與Th17/Treg比值呈負相關(guān)(r=-0.505，P<0.05)，外周血miR-155-5p相對表達水平與Th17/Treg比值呈正相關(guān)(r=0.523，P<0.05)。

3 討 論

研究表明，尿毒癥患者經(jīng)MHD治療后死亡率仍然很高，死亡原因主要是心血管相關(guān)并發(fā)癥，而血管鈣化是心血管病致死的重要病理變化，也是MHD患者死亡的獨立危險因素[8，10]。血管鈣化的發(fā)生機制復雜，可能與鈣磷不平衡、軟骨分化、血管彈性蛋白退化等有關(guān)[11]。BMP-2為血管鈣化促動劑，iPTH是體內(nèi)調(diào)節(jié)鈣、磷代謝的肽類激素，本研究結(jié)果顯示，血管鈣化組患者血清磷、鈣、BMP-2、iPTH水平均高于無血管鈣化組患者(均P<0.05)，說明在行MHD的尿毒癥患者中，發(fā)生血管鈣化者體內(nèi)存在鈣磷失衡，這與姜瑞豐等[12]報告的結(jié)果相似。相關(guān)性分析顯示，AACS與血清磷、鈣、BMP-2、iPTH水平均呈正相關(guān)(均P<0.05)，表明血磷、血鈣、BMP-2、iPTH水平與血管鈣化密切相關(guān)。本研究還顯示，血管鈣化組患者的血清CRP、TNF-α水平均高于無血管鈣化組患者(均P<0.05)。研究顯示，行血液透析的尿毒癥患者體內(nèi)微炎癥因子水平異常，與血管鈣化有關(guān)[5]。由此可見發(fā)生血管鈣化的患者機體的炎癥反應(yīng)較無血管鈣化患者嚴重。

微小RNA能調(diào)節(jié)多數(shù)基因，miR-21、miR-155-5p在多種疾病中分別發(fā)揮抗炎和促炎作用，因此在炎癥反應(yīng)中均具有重要調(diào)節(jié)作用[13-14]。研究表明，過敏性紫癜患兒miR-21表達水平降低，對IL-10有調(diào)節(jié)作用[15]；在脂多糖誘導的人腎皮質(zhì)近曲小管上皮細胞炎癥反應(yīng)中，miR-21表達水平降低，過表達miR-21可減輕炎癥反應(yīng)[16]。而有學者發(fā)現(xiàn)，膿毒癥心肌損傷患者血清miR-155-5p表達水平升高，miR-155-5p對膿毒癥患者心肌損傷有一定的診斷價值[17]；慢性腎臟病患者血漿miR-155-5p表達水平升高[18]。本研究結(jié)果顯示，血管鈣化組患者外周血miR-155-5p相對表達水平高于無血管鈣化組患者，而外周血miR-21相對表達水平低于無血管鈣化組患者；相關(guān)性分析顯示，行MHD的尿毒癥患者AACS與外周血miR-155-5p相對表達水平呈正相關(guān)，與外周血miR-21相對表達水平呈負相關(guān)(P<0.05)。以上結(jié)果提示miR-21、miR-155-5p與行MHD的尿毒癥患者發(fā)生血管鈣化有關(guān)，然而其作用機制尚不清楚。

Treg、Th17分別是較為重要的抗炎細胞、促炎細胞，前者分泌IL-10、TGF-β等抗炎因子并發(fā)揮抑制炎癥、免疫調(diào)節(jié)的作用，后者主要通過分泌IL-17 等細胞因子以促進炎癥反應(yīng)與免疫反應(yīng)的發(fā)生，Th17/Treg失衡可促進動脈粥樣硬化及心血管事件的發(fā)生[19]。本研究結(jié)果顯示，與無血管鈣化組患者相比，血管鈣化組患者PBMC中的Th17水平和Th17/Treg比值均升高，而PBMC中Treg水平降低，同時血清促炎細胞因子IL-17、IL-6水平升高，而血清抗炎細胞因子IL-10、TGF-β水平降低，這說明在行MHD的尿毒癥患者中，發(fā)生血管鈣化的患者存在Th17/Treg失衡，機體可能處于微炎狀態(tài)。Zheng等[20]的研究表明，在胃癌切除患者中miR-21可通過程序性死亡受體-1/程序性死亡受體-1配體途徑參與Th17/Treg細胞失衡的調(diào)節(jié)。唐橋斐等[21]研究發(fā)現(xiàn)，在變應(yīng)性鼻炎小鼠模型中，miR-155-5p過表達可加重小鼠鼻炎癥狀，并促進Th17相關(guān)細胞因子的表達，抑制Treg相關(guān)細胞因子的表達；而沉默miR-155-5p表達后，小鼠鼻炎癥狀評分顯著下降，Th17/Treg免疫失衡得到緩解。以上研究表明miR-21、miR-155-5p對Th17/Treg平衡具有調(diào)節(jié)作用。本研究的相關(guān)性分析顯示，外周血miR-21相對表達水平與Th17/Treg比值呈負相關(guān)，外周血miR-155-5p相對表達水平與Th17/Treg比值呈正相關(guān)(均P<0.05)。由此我們推測，在行MHD的尿毒癥患者中，miR-21、miR-155-5p水平表達異?？赡軐е耇h17/Treg失衡，從而引起血管鈣化。

綜上所述，在行MHD的尿毒癥患者中，發(fā)生血管鈣化的患者外周血miR-21呈低表達，而外周血miR-155-5p呈高表達；兩者的異常表達與血管鈣化的發(fā)生關(guān)系密切，而作用機制可能與兩者異常表達引起的Th17/Treg失衡有關(guān)，但具體作用機制仍需進一步研究。