張麗武 覃 緯 王 麗

(廣西壯族自治區(qū)南溪山醫(yī)院產科,桂林市 541002，電子郵箱：923567063@qq.com)

下肢深靜脈血栓(lower extremity deep venous thrombosis，LEDVT)形成是剖宮產術后的一種常見并發(fā)癥，是世界范圍內導致妊娠死亡的常見原因之一[1-2]。雖然LEDVT發(fā)病率不高(每100名產婦約發(fā)生1～2例)，但由于LEDVT可引起產婦慢性疼痛、潰瘍、靜脈功能不全，嚴重影響產婦的生活質量，因此越來越受到婦產科醫(yī)師的重視。研究表明，妊娠期發(fā)生LEDVT的風險是非妊娠期的4～6倍，妊娠3個月后LEDVT發(fā)生風險開始升高，隨著妊娠進展LEDVT發(fā)生風險逐漸升高，剖宮產術后LEDVT發(fā)生風險達到最高，這提示妊娠過程造成的體內微環(huán)境變化是導致LEDVT發(fā)生的重要原因[3]。有研究表明，抗血栓藥物可有效地降低剖宮產術后LEDVT的形成[4-5]，但在產科中使用抗血栓藥物具有嚴格的限制。因此，臨床上迫切需要一種更常規(guī)、更簡便的治療策略以預防剖宮產術后LEDVT的發(fā)生。近年來，有學者發(fā)現(xiàn)空氣波壓力治療儀可用于治療各種原因引起的LEDVT，其機制可能與加快下肢靜脈血流速度、上調內源性纖溶因子水平、減少血流瘀滯有關[6]。本研究探討術中急性等容稀釋(acute normovolemic hemodilution，ANH)自體輸血聯(lián)合空氣波壓力治療對剖宮產術后產婦LEDVT形成的影響，并分析其與機體CD40/CD40配體(CD40 ligand,CD40L)系統(tǒng)、血漿D-二聚體、高敏C反應蛋白(high-sensitivity C-reactive protein,hs-CRP)水平之間的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2017年2月至2018年2月在我院行剖宮產術的300例產婦。納入標準：符合剖宮產手術指征，均為單胎妊娠，產次、年齡不限，對本研究知情同意并簽署知情同意書。排除標準：原發(fā)性下肢深靜脈瓣膜功能不全者，術前曾使用抗凝藥物治療及患有凝血功能障礙者，合并嚴重心、肝、腎疾病、腫瘤及自身免疫性疾病者。采用隨機數(shù)字表法將300例產婦分為對照組、稀釋組和聯(lián)合治療組，每組100例。3組產婦年齡、孕周、產前血紅蛋白、產前血細胞比容等一般資料的比較，差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)，具有可比性，見表1。本研究嚴格遵照醫(yī)學倫理學的基本原則，并經廣西壯族自治區(qū)南溪山醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審核批準。

表1 3組產婦一般資料的比較(x±s)

1.2 治療方案 3組產婦剖宮產術后均常規(guī)使用壓力襪預防LEDVT形成，對照組產婦術中采用貯存式自體輸血，稀釋組和聯(lián)合治療組產婦術中均采用ANH自體輸血，聯(lián)合治療組在術后當天開始使用空氣波壓力治療儀治療。

貯存式自體輸血：貯存式自體輸血的采血過程與異體獻血過程相似，一般在術前3天完成，按總血量的10%～15%采集自體血1次，約200～400 mL，完成采集后妥善儲存；常規(guī)完成剖宮產手術，在血流動力學不穩(wěn)定(血細胞比容<24%或血紅蛋白<80 g/L)時、失血量>300 mL時或手術主要步驟結束后回輸全部貯存的自體血。

ANH自體輸血：剖宮產手術開始前，采集產婦自體血300～400 mL，儲存于500 mL的儲血袋內，同時經另一條靜脈輸注等量(300～400 mL)6%膠體液萬汶(6%羥乙基淀粉130/0.4；德國費森尤斯卡比股份有限公司，批號：81ML707)；常規(guī)完成剖宮產手術，在血流動力學不穩(wěn)定(血細胞比容<24%或血紅蛋白<80 g/L)時、失血量>300 mL時或手術主要步驟結束后回輸全部自體血。

空氣波壓力治療：幫助產婦雙下肢穿戴好空氣波壓力治療儀(深圳原位醫(yī)療設備有限公司，型號：PCD-51)套筒，將套筒連接至主機，設備接通電源，將空氣波壓力治療儀的壓力設置為40 mmHg(5.33 kPa)?？諝獠▔毫χ委?0 mim/次，2次/d，連續(xù)治療3～5 d。

1.3 LEDVT診斷標準 所有產婦于術后2周進行LEDVT診斷，診斷標準參照中華醫(yī)學會制定的LEDVT相關標準[7]：有下肢疼痛、腫脹、軟組織張力突然增高等臨床表現(xiàn)，活動后癥狀逐漸加重，將患肢抬高可以緩解癥狀，在靜脈血栓發(fā)生部位常伴有壓痛，Neuhof征、Homans征陽性；多普勒超聲檢查提示患肢血管血流呈現(xiàn)出不完全或者消失的影像；X線靜脈造影觀察髂靜脈有充盈缺損和側支形成，有雙軌癥及盆腔內有側支開放，以及靜脈內部血流的缺損情況等。

1.4 觀察指標 (1)分別于手術當天及術后第3天采集產婦空腹靜脈血3 mL，置于乙二胺四乙酸抗凝管中，3 000 r/min離心10 min后收集血漿。采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測血漿中D-二聚體(試劑盒購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，批號：E-EL-H6145)、hs-CRP(試劑盒購自美國博士德生物工程有限公司，批號：EK7040)及可溶性CD40配體(soluble CD40 ligand,sCD40L)(試劑盒購自上海信裕生物科技有限公司，批號：xy-E10109)的水平。(2)分別于手術當天及術后第3天采集產婦空腹靜脈血5 mL，置于乙二胺四乙酸抗凝管中，用5 mL磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline，PBS)等倍稀釋后置于含5 mL淋巴細胞分離液的離心管中，2 000 r/min離心30 min，吸取白膜層，置于另一15 mL離心管中，加入2～3倍體積的無菌PBS，上下顛倒混勻，2 000 r/min離心10 min，棄上清，PBS洗滌沉淀兩次，將所得外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)置于無酶無菌1.5 mL EP管中用于后續(xù)實驗。采用蛋白免疫印跡試驗檢測PBMC中的CD40相對表達水平：提取PBMC中的蛋白并測定濃度，98℃變性5 min，冰上冷卻10 min，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳后使用半干轉膜系統(tǒng)進行轉膜，用含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液室溫封閉2 h。CD40一抗(Proteintech生物科技有限公司，批號：28158-1-AP)1∶600稀釋后4℃孵育16～18 h，TBST緩沖液洗滌3次，每次10 min；1∶3 000稀釋二抗(Proteintech生物科技有限公司，批號：PR30009)后室溫(20℃～25℃)孵育1 h，TBST緩沖液洗滌3次，每次10 min。加入高靈敏的LunimataTMCrescendo發(fā)光劑顯影，采用Bio-Rad ChemiDoc XRS+成像系統(tǒng)進行拍照分析，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH；Proteintech生物科技有限公司，批號：60004-1-Ig)基因為內參，采用灰度掃描法對CD40相對表達水平進行半定量分析。

1.5 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以(x±s)表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q法；計數(shù)資料以例數(shù)(百分比)表示，比較采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 3組產婦剖宮產術后LEDVT發(fā)生率的比較 對照組、稀釋組及聯(lián)合治療組產婦剖宮產術后LEDVT的發(fā)生率分別為9.0%(9/100)、2.0%(2/100)、1.0%(1/100)，3組產婦剖宮產術后LEDVT的發(fā)生率比較，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=9.896，P=0.007)，其中聯(lián)合治療組的LEDVT發(fā)生率低于對照組(均P<0.05)，而稀釋組和聯(lián)合治療組的LEDVT發(fā)生率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.2 3組產婦手術前后血漿D-二聚體、hs-CRP及sCD40L水平的比較 3組產婦手術當天血漿中D-二聚體、hs-CRP及sCD40L水平比較，差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)；術后第3天，3組產婦血漿D-二聚體、hs-CRP及sCD40L水平由高到低均為對照組、稀釋組、聯(lián)合治療組(均P<0.05)，且聯(lián)合治療組產婦血漿D-二聚體、hs-CRP及sCD40L水平，以及稀釋組產婦的血漿D-二聚體、sCD40L水平均低于手術當天，對照組產婦血漿hs-CRP及sCD40L水平均高于手術當天(均P<0.05)。見表2。

表2 3組產婦手術前后血漿D-二聚體、hs-CRP及sCD40L水平的比較(x±s)

2.3 3組產婦手術前后CD40相對表達水平的比較 手術當天，3組產婦外周血PBMC的CD40相對表達水平比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；術后第3天，3組產婦外周血PBMC的CD40相對表達水平比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，CD40相對表達水平由高到低為對照組、稀釋組、聯(lián)合治療組(均P<0.05)，且稀釋組與聯(lián)合治療組外周血PBMC的CD40相對表達水平均低于手術當天(均P<0.05)。見表3、圖1。

表3 3組產婦PBMC中CD40相對表達水平的比較(x±s)

圖1 3組產婦手術前后外周血PBMC中CD40的表達情況

3 討 論

LEDVT形成是導致產婦死亡的重要原因，因此，部分醫(yī)院對高危產婦采取抗血栓治療。在英國和日本的醫(yī)院，所有剖宮產產婦均要經過嚴格的LEDVT風險評估并強烈推薦使用低分子肝素鈉；而在美國的醫(yī)院，空氣波壓力治療則廣泛應用于預防剖宮產術后LEDVT的形成[8-9]。本研究觀察ANH自體輸血聯(lián)合空氣波壓力治療對剖宮產術后產婦LEDVT形成的影響。結果顯示，聯(lián)合治療組剖宮產術后的LEDVT發(fā)生率均低于對照組(均P<0.05)，這提示ANH自體輸血聯(lián)合空氣波壓力治療可有效地降低剖宮產術后LEDVT的發(fā)生率。ANH自體輸血通過采血后擴容對血液具有一定的稀釋作用，稀釋后的血液具有黏稠度低、機體組織攝氧量高等優(yōu)點，可預防剖宮產術后LEDVT的形成；空氣壓力波治療儀通過氣囊從腳尖至大腿根部序貫進行反復充氣與放氣，加快下肢深靜脈血液回流速度，改善局部微循環(huán)，從而起到預防LEDVT形成的作用。本研究中稀釋組和聯(lián)合治療組剖宮產術后的LEDVT發(fā)生率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，可能與稀釋組產婦術后遵醫(yī)囑盡早床上活動、家屬協(xié)助肢體按摩及盡早下床活動有關。

血漿D-二聚體是一種反映機體纖溶活性的特異性降解產物，可反映機體的凝血狀態(tài)；hs-CRP是一種重要的炎癥標記物，檢測其濃度對炎癥疾病的干預及預后具有指示作用[10-11]。本研究結果顯示，術后第3天，3組產婦血漿D-二聚體及hs-CRP水平由高到低均為對照組、稀釋組、聯(lián)合治療組(均P<0.05)，且聯(lián)合治療組患者的血漿D-二聚體、hs-CRP水平，以及稀釋組的血漿D-二聚體水平均低于手術當天，而對照組的血漿hs-CRP水平高于手術當天(均P<0.05)。這表明ANH自體輸血聯(lián)合空氣波壓力治療可以影響機體的凝血功能和炎癥狀態(tài)，明顯降低產婦血漿的D-二聚體及hs-CRP水平，稀釋血液可以減少循環(huán)中的兒茶酚胺、皮質醇濃度，有利于減輕炎癥應激反應程度。

CD40屬于腫瘤壞死因子受體超家族成員，是一種Ⅰ型膜蛋白，以三聚體的形式表達于各種細胞的膜表面，編碼基因位于第20號染色體上。CD40的配體CD40L同樣表達于多種細胞，并且在體內微環(huán)境發(fā)生改變時被激活并由細胞膜表面分泌入血，并與細胞膜表面的CD40結合，激活包括核轉錄因子κB在內的多條下游信號通路，最終導致促凝、促炎等關鍵基因的表達上調[12-13]。研究發(fā)現(xiàn)，部分ST段抬高的心肌缺血患者采用經皮冠狀動脈穿刺治療后，局部循環(huán)呈現(xiàn)高凝狀態(tài)，采用依諾肝素預防治療可有效地降低血栓事件的發(fā)生率同時伴有sCD40L水平的明顯下調[14]。在未去除CD40及CD40L的野生型小鼠模型中，血管緊張素Ⅱ升高導致的高血壓常伴有動脈內血栓形成加速及靜脈內大量白細胞聚集，而去除CD40及CD40L的小鼠模型能夠抵抗靜注血管緊張素Ⅱ造成的高凝及炎癥狀態(tài)[15]。本研究結果顯示，術后第3天，3組產婦血漿的sCD40L水平及外周血PBMC的CD40相對表達水平由高到低均為對照組、稀釋組、聯(lián)合治療組(均P<0.05)，且聯(lián)合治療組、稀釋組產婦的血漿sCD40L水平及外周血PBMC的CD40相對表達水平均低于手術當天(均P<0.05)，這提示ANH自體輸血聯(lián)合空氣波壓力治療可明顯降低機體CD40/CD40L系統(tǒng)水平。已有研究表明，CD40L和sCD40L屬于腫瘤壞死因子超家族成員，是具有促凝和促炎雙重作用的分子，CD40/CD40L系統(tǒng)水平是與炎癥和凝血有關的一種信號通路，ANH自體輸血聯(lián)合空氣波壓力治療可能通過減輕炎癥應激反應、改善凝血功能及局部微循環(huán)等機制，降低產婦CD40/CD40L系統(tǒng)水平[16]。

綜上所述，ANH自體輸血聯(lián)合空氣波壓力治療能有效地降低剖宮產術后產婦血漿D-二聚體、hs-CRP、sCD40L水平和外周血PBMC的CD40相對表達水平，預防LEDVT的形成。但是本研究所納入的臨床樣本量有限，后期仍需要在大規(guī)模樣本中進行研究。