何文學(xué) 鄒魯宏 張雪娟 于小旭 劉文值

(1 四川省攀枝花市中心醫(yī)院麻醉科，攀枝花市 617000，電子郵箱：3115529559@qq.com；2 貴州醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，貴陽(yáng)市 550000；3 攀枝花學(xué)院附屬醫(yī)院麻醉科，四川省攀枝花市 617000)

神經(jīng)病理性疼痛是因軀體感覺(jué)神經(jīng)系統(tǒng)損傷或疾病導(dǎo)致的一種難治性慢性疼痛，主要表現(xiàn)為異常性疼痛、自發(fā)痛以及痛覺(jué)過(guò)敏，甚至伴隨有感覺(jué)異常等[1]。持續(xù)存在的病理性疼痛通?？梢鹨钟簟⒔箲]等負(fù)性心理障礙，據(jù)統(tǒng)計(jì)，30%～60%的慢性疼痛患者合并有抑郁癥[2]；而負(fù)性心理障礙又可加重患者對(duì)疼痛的感知，使治療變得更為復(fù)雜。目前研究認(rèn)為，炎癥在抑郁癥的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用。無(wú)論是抑郁患者還是模型動(dòng)物，其外周血液、神經(jīng)系統(tǒng)中炎癥因子的表達(dá)均顯著上調(diào)，而各種抗炎治療均能很好地改善抑郁癥狀[3-4]。大量研究顯示，神經(jīng)病理性疼痛模型動(dòng)物的外周及中樞神經(jīng)系統(tǒng)中免疫細(xì)胞顯著增殖活化，且其相應(yīng)過(guò)表達(dá)的炎癥因子能夠促進(jìn)傷害性感覺(jué)神經(jīng)元的可塑性變化[5-6]。大腦海馬區(qū)不僅參與學(xué)習(xí)記憶過(guò)程，還對(duì)慢性應(yīng)激及傷害性刺激作出反應(yīng)，參與抑郁情緒及疼痛感受的發(fā)生和發(fā)展[7-8]。Laumet等[9]研究發(fā)現(xiàn)，外周神經(jīng)損傷小鼠海馬組織中過(guò)度增殖的小膠質(zhì)細(xì)胞所釋放出的白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-1可誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元發(fā)生繼發(fā)性改變及抑郁樣行為。由此可見(jiàn)，海馬中增殖的小膠質(zhì)細(xì)胞所介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥與疼痛、抑郁的發(fā)生密切相關(guān)。作為小膠質(zhì)細(xì)胞的特異性抑制劑，米諾環(huán)素逐漸被應(yīng)用于疼痛相關(guān)領(lǐng)域的研究。已有研究顯示，鞘內(nèi)注射米諾環(huán)素可抑制外周神經(jīng)損傷大鼠脊髓背角中小膠質(zhì)細(xì)胞的增殖及活化，從而改善疼痛的惡性進(jìn)展[10]?；谏鲜鲅芯拷Y(jié)果，本研究建立選擇性神經(jīng)損傷(spared nerve injury，SNI)大鼠模型，觀察大鼠的疼痛情況和抑郁樣行為，以及兩者與小膠質(zhì)細(xì)胞激活和神經(jīng)炎癥的關(guān)系；同時(shí)，分析海馬區(qū)注射米諾環(huán)素對(duì)SNI大鼠疼痛和抑郁樣行為的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 120只雄性 SD 大鼠(240～280 g,6～8周)購(gòu)自成都達(dá)碩科技有限公司[許可證號(hào) SCXK(川)2015-067]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)貴州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物學(xué)部倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(2016-1A)，動(dòng)物喂養(yǎng)及處理嚴(yán)格遵循貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例。所有大鼠飼養(yǎng)于西南醫(yī)科大學(xué)無(wú)特定病原體級(jí)動(dòng)物房，環(huán)境溫度設(shè)置為22℃～25℃，12 h/12 h晝夜更替，并給予充足的飲用水和飼料。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)前禁食、禁水8 h。

1.2 試劑和儀器 腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)及IL-6檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：ab235662)、兔抗大鼠離子鈣接頭蛋白1(ionized calcium binding adaptor molecule 1，Iba-1)一抗(批號(hào)：ab178846)、β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)一抗(批號(hào)：ab8226)、羊抗兔綠熒光二抗(批號(hào)：ab150077)、羊抗兔含辣根過(guò)氧化酶的二抗(批號(hào)：ab6721)均購(gòu)自Abcam公司，米諾環(huán)素(批號(hào)：SJ-JC12792)購(gòu)自上海機(jī)純實(shí)業(yè)有限公司，4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI；批號(hào)：P0131)、熒光淬滅封片劑(批號(hào)：P0131-25ml)、RIPA裂解液(批號(hào)：P0013C)、二喹啉甲酸試劑(批號(hào)：P0009)均購(gòu)自碧云天公司，青霉素鈉(批號(hào)：69-57-8)購(gòu)自湖北威德利化學(xué)制藥有限公司。熱輻射儀(型號(hào)：PL-200)大鼠腦室給藥導(dǎo)管(型號(hào)：SL-23)、大鼠疲勞轉(zhuǎn)棒儀(型號(hào)：47750)、全自動(dòng)生化分析儀(型號(hào)：AltairTM240)、牙科水泥購(gòu)自上海玉研科學(xué)儀器有限公司，各種型號(hào)移液槍購(gòu)自Eppendorff公司，超低溫冷凍冰箱(型號(hào)：Thermo ScientificTMFormaTM900)購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司，顯影儀(型號(hào)：JP-K900)購(gòu)自上海嘉鵬科技有限公司，熒光顯微鏡(型號(hào)：BX53)購(gòu)自?shī)W林巴斯公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組 將120只大鼠進(jìn)行編號(hào)，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為4組，即Sham組、SNI組、SNI+1 μg Mino組、SNI+10 μg Mino組，每組30只。

1.4 建模及給藥方法

1.4.1 建立SNI模型：根據(jù)大鼠體重腹腔注射10%水合氯醛溶液(350 mg/kg)，待大鼠充分麻醉后開(kāi)始操作。除Sham組外，將其他3組大鼠沿右側(cè)后肢股骨外凹陷處切開(kāi)皮膚，順肌肉走形鈍性分離，暴露肌肉深層的坐骨神經(jīng)三分支，用4-0絲線將脛神經(jīng)及腓總神經(jīng)兩大神經(jīng)分支結(jié)扎，并將其從結(jié)扎點(diǎn)遠(yuǎn)心端剪斷，僅保留腓腸神經(jīng)。Sham組僅暴露坐骨神經(jīng)三分支，不損傷及結(jié)扎神經(jīng)。隨后逐層關(guān)閉手術(shù)切口，并涂撒青霉素鈉以預(yù)防感染。

1.4.2 側(cè)腦室置管及給藥：建立SNI模型或完成假手術(shù)后，立即將大鼠固定于腦立體定位儀，充分暴露顱骨，露出前囟點(diǎn)，追加10%水合氯醛溶液(200 mg/kg)維持麻醉。以前囟點(diǎn)為中心，于向右側(cè)旁開(kāi)1.5 mm、向后囟方向1.1 mm、深度為4.5 mm處埋注射導(dǎo)管，使用牙科水泥將導(dǎo)管固定于顱骨，完成右側(cè)腦室置管。于側(cè)腦室置管術(shù)后1 d、7 d，分別給予Sham組及SNI組大鼠側(cè)腦室內(nèi)注射0.01 mol/L 磷酸緩沖鹽溶液1 μL，分別給予SNI+1 μg Mino組、SNI+10 μg Mino組大鼠側(cè)腦室內(nèi)注射1 μg/μL、10 μg/μL米諾環(huán)素溶液(生理鹽水溶解)1 μL。

1.5 海馬組織取材 于側(cè)腦室置管術(shù)后1 d、3 d、7 d、14 d，各組隨機(jī)選取10只大鼠進(jìn)行相應(yīng)行為學(xué)檢測(cè)。完成行為學(xué)評(píng)估后再進(jìn)行以下海馬組織取材：于側(cè)腦室置管術(shù)后3 d、7 d，各組隨機(jī)選取6只大鼠海馬組織，采用ELISA檢測(cè)TNF-α及IL-6含量；于側(cè)腦室置管術(shù)后14 d，各組隨機(jī)選取18只大鼠海馬組織，再隨機(jī)取6只，分別進(jìn)行ELISA、蛋白免疫印跡法實(shí)驗(yàn)、免疫熒光染色。取材方法：腹腔注射10%水合氯醛溶液(350 mg/kg)麻醉大鼠，暴露心臟，用冷磷酸緩沖鹽溶液充分灌注后斷頭取腦，分離海馬組織。其間，大鼠的選取均采用隨機(jī)數(shù)字表法。

1.6 行為學(xué)的評(píng)估

1.6.1 熱縮足反射潛伏期：于實(shí)驗(yàn)前1 d，鞘內(nèi)置管術(shù)后3 d、7 d、14 d，各組隨機(jī)選取10只大鼠進(jìn)行熱縮足反射潛伏期檢測(cè)。將大鼠置于底部有鐵絲網(wǎng)的玻璃箱(40 cm×40 cm×40 cm)內(nèi)適應(yīng)30 min后，打開(kāi)熱輻射儀，設(shè)置溫度為52℃，調(diào)整光線對(duì)準(zhǔn)足底(光源距離足底約10 cm)，當(dāng)右足出現(xiàn)縮足、舔足動(dòng)作時(shí)停止照射，并記錄從開(kāi)始照射至出現(xiàn)上述動(dòng)作的時(shí)間，即為熱縮足反射潛伏期(paw withdrawal thermal latency,PWTL)。間隔5 min后重復(fù)檢測(cè)1次，共檢測(cè)3次，取平均值為最終檢測(cè)值。

1.6.2 轉(zhuǎn)棒疲勞實(shí)驗(yàn)：于實(shí)驗(yàn)前1 d、鞘內(nèi)置管術(shù)后1 d和7 d鞘內(nèi)給藥30 min后，各組隨機(jī)選取10只大鼠進(jìn)行轉(zhuǎn)棒疲勞實(shí)驗(yàn)，以評(píng)估藥物對(duì)大鼠運(yùn)動(dòng)功能的影響。將大鼠放置在靜止的轉(zhuǎn)棒儀，設(shè)置轉(zhuǎn)速?gòu)?1 r/min 開(kāi)始，并在3 min內(nèi)逐漸勻加速至40 r/min，記錄大鼠在棒上所停留的時(shí)間。休息20 min后重復(fù)測(cè)量，每只大鼠檢測(cè)3次，取平均值為最終測(cè)量值。

1.6.3 糖水偏好實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)前給予1%糖水適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，于實(shí)驗(yàn)前1 d、鞘內(nèi)置管術(shù)后7 d及14 d，各組隨機(jī)選取10只大鼠進(jìn)行糖水偏好實(shí)驗(yàn)。測(cè)試時(shí)，將大鼠單籠喂養(yǎng)，同時(shí)放入1%蔗糖水和飲用純水各一瓶，間隔6 h調(diào)換位置。24 h后，按照糖水和純水的消耗量計(jì)算糖水偏好百分比。糖水偏好百分比 = 糖水消耗量/(糖水消耗量 + 純水消耗量)× 100%。

1.6.4 游泳實(shí)驗(yàn)：于實(shí)驗(yàn)前1 d、鞘內(nèi)置管術(shù)后7 d及14 d，各組隨機(jī)選取10只大鼠進(jìn)行強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)，將受試大鼠放入水深為 30 cm 的圓形玻璃容器中(高50 cm，直徑100 cm)，水溫25℃。記錄 5 min 內(nèi)大鼠的活動(dòng)狀態(tài)，并計(jì)算大鼠累計(jì)不動(dòng)時(shí)間。不動(dòng)的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)為大鼠在水中停止掙扎，或僅有輕微的肢體運(yùn)動(dòng)，或呈現(xiàn)漂浮狀態(tài)。

1.7 海馬組織相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)

1.7.1 蛋白免疫印跡法檢測(cè)Iba-1的表達(dá)：于鞘內(nèi)置管術(shù)后14 d，獲取海馬組織，采用眼科剪將整個(gè)海馬組織剪碎后，使用RIPA裂解液充分裂解、勻漿，高速離心機(jī)離心(18 000 r/min，15 min)獲取上清液，采用二喹啉甲酸法檢測(cè)樣品中總蛋白濃度。按照說(shuō)明書(shū)(上海羽哚生物科技有限公司，批號(hào)：YLY1168)配置濃縮膠及分離膠，向上樣孔中滴加待測(cè)樣品，設(shè)置好電泳儀參數(shù)后開(kāi)始十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳。待電泳結(jié)束后，將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜；5%脫脂奶粉封閉后充分漂洗，將膜轉(zhuǎn)移到含Iba-1、β-actin一抗稀釋緩沖液(1∶1 000)中，4℃冰箱孵育過(guò)夜；次日，將膜取出漂洗后放入含辣根過(guò)氧化酶的二抗稀釋液(1∶2 000)中，常溫下孵育1 h。孵育完畢后用ECL液顯影，上機(jī)曝光、拍照，采用ImageJ 軟件分析目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量，即在ImageJ中計(jì)算出Iba-1及β-actin蛋白條帶的整合光密度值(integrated optical density，IOD)，Iba-1的相對(duì)表達(dá)量=Iba-1的IOD/β-actin的IOD。

1.7.2 免疫熒光法檢測(cè)Iba-1的表達(dá)：于鞘內(nèi)置管術(shù)后14 d，獲取海馬組織，將整個(gè)海馬組織用4%多聚甲醛溶液固定后，再轉(zhuǎn)移至30%蔗糖溶液充分脫水。固定12 h，將樣品用OCT包埋，放入-80℃冰箱加速冷卻。待樣品凝固后，迅速轉(zhuǎn)入冰凍切片機(jī)切片，切片厚度設(shè)置為10 μm。使用組化筆在切片組織周圍畫(huà)圈，滴加封閉通透液(含0.3%Triton X-100的10%山羊血清)，室溫處理1h。充分洗滌，滴加Iba-1(1∶200)一抗，4℃條件下濕盒中孵育過(guò)夜。次日晨，避光孵育熒光二抗(1∶1 000)。充分漂洗后，使用DAPI進(jìn)行核染色，抗淬滅劑封片，在熒光顯微鏡下拍照，采用ImageJ軟件對(duì)圖像結(jié)果進(jìn)行分析。以Iba-1的表達(dá)情況評(píng)價(jià)小膠質(zhì)細(xì)胞的增殖情況。

1.7.3 ELISA檢測(cè)炎癥因子的含量：于鞘內(nèi)置管術(shù)后3 d、7 d、14 d，采用ELISA檢測(cè)海馬組織中炎癥因子的含量。將整個(gè)海馬組織樣品充分勻漿、離心(18 000 r/min，15 min)，根據(jù)TNF-α及IL-6試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，并使用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)各組海馬組織樣本中TNF-α、IL-6的表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 米諾環(huán)素對(duì)SNI大鼠疼痛程度和運(yùn)動(dòng)功能的影響 術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)，SNI組、SNI+1 μg Mino組、SNI+10 μg Mino組、Sham組大鼠的PWTL依次延長(zhǎng)(均P<0.05)，然而各組大鼠在疲勞轉(zhuǎn)棒上所停留的時(shí)間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見(jiàn)表1和表2。

表1 不同時(shí)間點(diǎn)4組大鼠PWTL的比較(x±s,s)

表2 不同時(shí)間點(diǎn)4組大鼠轉(zhuǎn)棒疲勞實(shí)驗(yàn)結(jié)果的比較(x±s,s)

2.2 米諾環(huán)素對(duì)SNI大鼠抑郁樣行為的影響 術(shù)后7 d及14 d，與Sham組相比，SNI組、SNI+1 μg Mino組、SNI+10 μg Mino組大鼠糖水偏好百分比降低，同時(shí)強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間延長(zhǎng)(均P<0.05)。術(shù)后14 d，與SNI組相比，SNI+1 μg Mino組、SNI+10 μg Mino組大鼠強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間縮短，且糖水偏好百分比增加(均P<0.05)，但SNI+1 μg Mino組、SNI+10 μg Mino組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3和表4。

表3 不同時(shí)間點(diǎn)4組大鼠糖水偏好實(shí)驗(yàn)結(jié)果的比較(x±s,%)

表4 不同時(shí)間點(diǎn)4組大鼠強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果的比較(x±s,s)

2.3 米諾環(huán)素對(duì)SNI大鼠海馬小膠質(zhì)細(xì)胞的影響 免疫熒光染色結(jié)果提示，SNI組大鼠海馬區(qū)Iba-1表達(dá)增加，即小膠質(zhì)細(xì)胞明顯增殖，而SNI+1 μg Mino組、SNI+10 μg Mino組大鼠海馬區(qū)的Iba-1表達(dá)相對(duì)SNI組減弱，即小膠質(zhì)細(xì)胞的增殖受到抑制，見(jiàn)圖1。免疫印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示，其他3組大鼠海馬組織Iba-1蛋白的相對(duì)表達(dá)量均高于Sham組(均P<0.05)；SNI組，SNI+1 μg Mino組、SNI+10 μg Mino組大鼠的海馬組織Iba-1蛋白的相對(duì)表達(dá)量依次降低(均P<0.05)，見(jiàn)表5和圖2。

圖2 4組大鼠海馬組織中Iba-1蛋白的表達(dá)情況

表5 4組海馬組織Iba-1蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較(x±s)

圖1 4組大鼠海馬組織免疫熒光染色結(jié)果(×50)

2.4 米諾環(huán)素對(duì)SNI大鼠海馬組織神經(jīng)炎癥的影響 各時(shí)間點(diǎn)，SNI組大鼠海馬組織中TNF-α、IL-6的含量均高于Sham組(組P<0.05)，而SNI+10 μg Mino組和SNI+1 μg Mino組大鼠的TNF-α、IL-6含量均低于SNI組(均P<0.05)；在術(shù)后14 d，SNI+10 μg Mino組的IL-6含量均低于SNI+1 μg Mino組(均P<0.05)。見(jiàn)表6和表7。

表6 4組海馬組織中TNF-α表達(dá)水平的比較(x±s,pg/mL)

表7 4組海馬組織中IL-6水平的比較(x±s,pg/mL)

3 討 論

痛覺(jué)敏化是神經(jīng)病理性疼痛模型動(dòng)物的典型表現(xiàn)，而對(duì)熱刺激的耐受性顯著降低是痛覺(jué)敏化的具體呈現(xiàn)形式[11]。PWTL是反映受測(cè)動(dòng)物足底對(duì)熱刺激的耐受時(shí)間，因此本研究選擇該指標(biāo)評(píng)價(jià)SNI大鼠的疼痛情況。結(jié)果顯示，與Sham組大鼠相比，SNI組大鼠從術(shù)后3 d開(kāi)始PWTL值即明顯降低，并持續(xù)至術(shù)后14 d，這表明SNI大鼠出現(xiàn)了神經(jīng)病理性疼痛。嚙齒類動(dòng)物對(duì)于甜味有天然喜好，當(dāng)糖水偏好百分比顯著降低時(shí)，說(shuō)明受試動(dòng)物喪失快感。而快感喪失是抑郁的典型表現(xiàn)，故糖水偏好實(shí)驗(yàn)是目前評(píng)價(jià)動(dòng)物抑郁樣行為的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)之一。此外，絕望情緒也是抑郁的持續(xù)情感狀態(tài)之一，在強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中抑郁動(dòng)物會(huì)表現(xiàn)出典型的“不動(dòng)狀態(tài)”，通過(guò)記錄動(dòng)物不動(dòng)狀態(tài)的持續(xù)時(shí)間能充分評(píng)估其抑郁程度。因此，本研究采用糖水偏好實(shí)驗(yàn)和游泳實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)各組大鼠的抑郁樣行為。結(jié)果表明，與Sham組大鼠相比，在術(shù)后7 d、術(shù)后14 d，SNI組大鼠的糖水偏好百分比降低，強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間延長(zhǎng)，提示SNI大鼠出現(xiàn)明顯的抑郁樣行為。

在神經(jīng)病理性疼痛等各種慢性疼痛狀態(tài)下，膠質(zhì)細(xì)胞(包括外周的施萬(wàn)細(xì)胞、衛(wèi)星細(xì)胞，以及中樞的小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞)在背根神經(jīng)節(jié)、三叉神經(jīng)節(jié)、脊髓及大腦中所介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥是維持疼痛外周敏化及中樞敏化的關(guān)鍵所在[12]。其中，小膠質(zhì)細(xì)胞在慢性疼痛中的作用一直是研究的焦點(diǎn)。受到刺激后，小膠質(zhì)細(xì)胞增殖活化，并由神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞變成神經(jīng)炎癥細(xì)胞，分泌IL-6、TNF-α等炎癥因子以促進(jìn)神經(jīng)炎癥進(jìn)展[13-14]。脊髓背角的結(jié)構(gòu)改變，如興奮性突觸數(shù)量增多和肽能C纖維增生等，是慢性疼痛的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，而這些形態(tài)學(xué)改變都有賴于小膠質(zhì)細(xì)胞的增殖活化[15-16]。既往研究表明，前扣帶回、前額葉皮質(zhì)等區(qū)域的小膠質(zhì)細(xì)胞在慢性疼痛中被顯著激活，提示大腦中的小膠質(zhì)細(xì)胞在疼痛的發(fā)生和發(fā)展中起著重要的作用[17]。此外，大腦中小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞等固有免疫細(xì)胞所介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥還極大地推動(dòng)了帕金森、阿爾茲海默病、抑郁癥等疾病的發(fā)生[18]。在慢性應(yīng)激誘導(dǎo)的小鼠抑郁模型中，用米諾環(huán)素抑制海馬區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，可改善抑郁癥狀及神經(jīng)退變，說(shuō)明海馬小膠質(zhì)細(xì)胞與抑郁密切相關(guān)[19]。而Albertini等[20]用脂多糖誘導(dǎo)小鼠海馬小膠質(zhì)細(xì)胞活化及TNF-α等炎癥因子釋放后，正常的小鼠在短期內(nèi)即出現(xiàn)抑郁樣行為，進(jìn)一步證實(shí)了海馬區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞及神經(jīng)炎癥與抑郁的發(fā)生有直接關(guān)系?；谏鲜鲎C據(jù)，我們進(jìn)一步探究了SNI大鼠的疼痛和抑郁樣行為與海馬區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)炎癥的關(guān)系。本研究結(jié)果顯示，與Sham組大鼠相比，SNI組大鼠海馬組織中小膠質(zhì)細(xì)胞明顯增殖，且小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物Iba-1的表達(dá)量及炎癥因子IL-6、TNF-α含量均延長(zhǎng)，說(shuō)明海馬中小膠質(zhì)細(xì)胞及其介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥可能參與SNI大鼠痛覺(jué)敏化和抑郁樣行為的發(fā)生。

目前學(xué)者們發(fā)現(xiàn)，米諾環(huán)素除了具有殺菌的作用，還參與蛋白水解、血管生成以及腫瘤代謝等生理及病理過(guò)程[21]。研究表明，通過(guò)鞘內(nèi)注射米諾環(huán)素可使各類慢性疼痛得到明顯緩解，其潛在機(jī)制是抑制脊髓中小膠質(zhì)細(xì)胞活化及TNF-α等炎癥因子釋放[22-24]。本研究中，給予側(cè)腦室注射米諾環(huán)素后，SNI大鼠在術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)的PWTL均增加，且10 μg劑量的米諾環(huán)素的作用效果更為明顯，提示米諾環(huán)素可以緩解SNI引起的神經(jīng)病理性疼痛，且這一作用可能具有一定的劑量依賴性。此外，SNI大鼠在接受側(cè)腦室注射米諾環(huán)素后，糖水偏好百分比升高、強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間縮短，說(shuō)明米諾環(huán)素可以改善SNI大鼠的抑郁樣行為，但增加用藥劑量可能并不會(huì)增強(qiáng)這一作用。本研究結(jié)果還顯示，側(cè)腦室注射米諾環(huán)素后，SNI大鼠的海馬組織中小膠質(zhì)細(xì)胞增殖受到抑制，Iba-1的表達(dá)量及IL-6、TNF-α含量均降低，這提示作為小膠質(zhì)細(xì)胞抑制劑，米諾環(huán)素可能通過(guò)抑制海馬區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞的激活及炎癥因子的釋放從而發(fā)揮鎮(zhèn)痛、抗抑郁的作用，同時(shí)進(jìn)一步證實(shí)海馬小膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)炎癥在神經(jīng)病理性疼痛的放大以及抑郁中起著重要的作用。不僅如此，轉(zhuǎn)棒疲勞試驗(yàn)結(jié)果提示，米諾環(huán)素對(duì)受試大鼠的運(yùn)動(dòng)功能無(wú)明顯影響，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)所使用的米諾環(huán)素劑量相對(duì)安全。

綜上所述，SNI大鼠不僅出現(xiàn)神經(jīng)病理性疼痛，還合并抑郁樣行為，而兩者均與海馬區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞的激活和神經(jīng)炎癥有著密切的聯(lián)系。此外，側(cè)腦室注射小膠質(zhì)細(xì)胞抑制劑米諾環(huán)素可改善SNI大鼠疼痛及抑郁樣行為。