周 賢 許 濤

(湖北省武漢市第四醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，武漢市 430034，電子郵箱：413360716@qq.com)

膿毒癥是由宿主對感染反應(yīng)失調(diào)而引起的危及生命的器官功能障礙[1]。膿毒癥會(huì)引起神經(jīng)-內(nèi)分泌系統(tǒng)激活以及炎性介質(zhì)過度釋放，導(dǎo)致機(jī)體代謝紊亂，出現(xiàn)高分解代謝狀態(tài)以及胰島素抵抗，進(jìn)而導(dǎo)致高血糖狀態(tài)[2]。而長期高血糖狀態(tài)，會(huì)增加患者的病死率[3]。膿毒癥的胰島素抵抗不同于糖尿病患者的胰島素抵抗，膿毒癥的胰島素抵抗通常隨著應(yīng)激因素的消失而改善，一般僅持續(xù)數(shù)天到數(shù)周，有學(xué)者將這種現(xiàn)象稱為急性胰島素抵抗[4]。對于膿毒癥所致胰島素抵抗及高血糖，臨床上一般采用強(qiáng)化胰島素治療方案。但是部分臨床研究結(jié)果卻提示強(qiáng)化胰島素治療反而增加了低血糖事件的發(fā)生，進(jìn)而導(dǎo)致患者的病死率升高[5]。我們在臨床實(shí)踐中還觀察到，少部分重癥病例即使采用強(qiáng)化胰島素治療，其高血糖也難以控制。由此可見，對于膿毒癥重癥患者，探索能夠改善其急性胰島素抵抗的新方法具有重要臨床意義。有研究表明，炎癥因子在膿毒癥胰島素抵抗中發(fā)揮重要作用，而蛋白酪氨酸磷酸酶1B(protein tyrosine phosphatase 1B，PTP1B)是炎癥因子與代謝性疾病之間的關(guān)鍵紐帶[6]。為此，本文從胰島素受體前炎癥因子、受體后胰島素信號(hào)傳導(dǎo)通路以及葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白移位3個(gè)層面，探討大鼠PTP1B基因缺失對膿毒癥所致胰島素抵抗的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選擇40只(其中20只敲除PTP1B基因)56日齡健康雌性無特定病原體級(jí)SD大鼠，大鼠購自湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心(許可證號(hào)：SCXK2020-0018)，體重180～220 g，飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室條件下[光/暗周期為12/12 h(光照時(shí)間7：00～19：00)，溫度為21℃～24℃，濕度為40%～60%]，自由攝食和飲水。

1.2 主要儀器和試劑 DR-200B型酶標(biāo)儀(DIATEK公司)，QY-PO-VPT型血糖儀(三諾生物傳感公司)，TGL-16c型臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)，GNP9160型恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，DYY-6C型電泳儀(北京市六一儀器廠)，DYCZ-400D型轉(zhuǎn)移電泳儀槽(北京市六一儀器廠)，CX-21型普通光學(xué)顯微鏡(Olympus公司)，MicroPublisher成像系統(tǒng)(QImaging公司)。磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline，PBS；批號(hào)：AS1044)、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)凝膠制備試劑盒(批號(hào)：AS1012)、RIPA總蛋白裂解液(批號(hào)：AS1004)、二喹啉甲酸蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒(批號(hào)：AS1086)、增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒(批號(hào)：AS1059)、辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標(biāo)記羊抗兔IgG二抗(批號(hào)：AS1107)、CY3標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗(批號(hào)：AS-1109)均由ASPEN Biotechnology CO.,LTD生產(chǎn)；大鼠腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)ELISA試劑盒(批號(hào)：ELK1396)、大鼠胰島素ELISA 試劑盒(批號(hào)：ELK2370)均由ELK Biotechnology CO.,LTD生產(chǎn)；甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗體(批號(hào)：ab181602)由Abcam公司生產(chǎn)；蛋白激酶B(protein kinase B,Akt；批號(hào)：#4060)、磷酸化Akt(phosphorylated Akt,p-Akt；批號(hào)：#9272)由CST公司生產(chǎn)；葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(glucose transporter，GLUT)-2抗體(批號(hào)：GTX0254)由Gentex公司生產(chǎn)；抗熒光淬滅劑(批號(hào)：AS1089)由武漢阿斯本生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。

1.3 分組與動(dòng)物模型的建立 采用隨機(jī)數(shù)字表，將20只敲除PTP1B基因的大鼠分為PTP1B(-/-)假手術(shù)組(n=10，進(jìn)行假手術(shù))和PTP1B(-/-)膿毒癥組(n=10，建立膿毒癥所致胰島素抵抗模型)，將其余20只野生型大鼠分為野生型假手術(shù)組(n=10，進(jìn)行假手術(shù))和野生型膿毒癥組(n=10，建立膿毒癥所致胰島素抵抗模型)。建模主要步驟如下[7]：使用腹腔注射氯胺酮75 mg/kg麻醉大鼠，麻醉成功后開腹后使用4號(hào)絲線結(jié)扎盲腸末端，再以手術(shù)針頭刺破腸壁，擠出少許糞便，然后將盲腸納入腹腔，逐層縫合腹壁，術(shù)畢腹腔內(nèi)注射3 mg/kg內(nèi)毒素(Sigma公司，批號(hào)：L2630)。假手術(shù)組的大鼠接受同樣的手術(shù)，但盲腸既不結(jié)扎也不穿刺，術(shù)畢腹腔內(nèi)注射3 mL/kg生理鹽水。大鼠在麻醉前6 h及術(shù)后24 h禁食不禁水。

1.4 胰島素抵抗指數(shù)的測定 于術(shù)后12 h取大鼠尾靜脈血標(biāo)本1 mL，采用血糖儀測大鼠空腹血糖值，采用ELISA法檢測大鼠空腹胰島素，按照試劑說明書進(jìn)行操作。計(jì)算穩(wěn)態(tài)模型評(píng)估胰島素抵抗(homeostasis model assessment-insulin resistance,HOMA-IR)指數(shù)，HOMA-IR指數(shù)=空腹血糖(mmol/L)×空腹胰島素(mIU/mL)/22.5。

1.5 血清炎癥因子的測定 于手術(shù)后24 h取大鼠尾靜脈血標(biāo)本1 mL，采用ELISA法測定大鼠血清炎癥因子TNF-α水平，按照試劑說明書進(jìn)行操作。

1.6 肝臟組織Akt磷酸化水平的檢測 術(shù)后24 h每只大鼠注射人胰島素(江蘇萬邦生化醫(yī)藥公司，批號(hào)：22112203)0.5 U/kg，使胰島素與胰島素受體結(jié)合，從而促進(jìn)胰島素信號(hào)通路及轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白移位。15 min 后處死大鼠，取大鼠肝右葉組織。采用蛋白免疫印跡試驗(yàn)檢測大鼠肝臟組織Akt與p-Akt表達(dá)水平，并根據(jù)灰度值計(jì)算p-Akt/Akt的比值，了解Akt磷酸化水平。取大鼠肝組織0.5 g，采用RIPA總蛋白裂解液提取總蛋白，采用二喹啉甲酸法測定總蛋白濃度。按照每泳道加入50 μg的蛋白樣品進(jìn)行上樣，采用10%的SDS-PAGE凝膠進(jìn)行蛋白電泳，完成電泳后進(jìn)行濕法轉(zhuǎn)膜，然后使用2%牛血清白蛋白溶液封閉1 h。在4℃條件下孵育一抗GAPDH(1∶10 000)、p-Akt(1∶1 000)、Akt(1∶2 000)過夜，用 TBST漂洗，室溫下孵育HRP標(biāo)記羊抗兔IgG二抗(1∶10 000)1 h，完成后再次用TBST漂洗。滴加配制的增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑盒工作液到膜上，暗室中曝光。根據(jù)光強(qiáng)度調(diào)整曝光條件，顯影、定影。掃描并存檔膠片，AlphaEaseFC軟件分析目標(biāo)帶的灰度值。

1.7 GLUT-2轉(zhuǎn)移情況的檢測 免疫熒光技術(shù)檢測GLUT-2向肝細(xì)胞膜轉(zhuǎn)移情況。取大鼠剩余肝右葉組織標(biāo)本并制作石蠟切片備用，石蠟切片預(yù)處置后置于3%過氧化氫溶液中，室溫下避光孵育10 min，再用5%牛血清白蛋白封閉20 min。滴加一抗GLUT-2抗體(1∶100)，4℃過夜。將切片用PBS洗滌3次，每次5 min。去除PBS，滴加CY3標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗(1∶50)，37℃孵育50 min。每張切片加50～100 μL的4,6-聯(lián)脒-2苯基吲哚染液，室溫避光孵育5 min。染色后將切片放入PBS中洗3次，每次5 min。滴加適量的抗熒光淬滅劑于組織上，蓋玻片覆蓋，熒光顯微鏡下觀察。GLUT-2免疫熒光染色后紅染為陽性。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，正態(tài)分布的計(jì)量資料以(x±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠的胰島素抵抗情況 野生型假手術(shù)組與PTP1B(-/-)假手術(shù)組大鼠的HOMA-IR指數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；野生型膿毒癥組、PTP1B(-/-)膿毒癥組大鼠的HOMA-IR指數(shù)分別高于野生型假手術(shù)組、PTP1B(-/-)假手術(shù)組大鼠(均P<0.05)；PTP1B(-/-)膿毒癥組大鼠的HOMA-IR指數(shù)低于野生型膿毒癥組(均P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠胰島素抵抗情況的比較(x±s)

2.2 各組大鼠的血清炎癥因子水平 野生型假手術(shù)組與PTP1B(-/-)假手術(shù)組大鼠血清TNF-α水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；野生型膿毒癥組、PTP1B(-/-)膿毒癥組大鼠血清TNF-α水平分別高于野生型假手術(shù)組、PTP1B(-/-)假手術(shù)組(均P<0.05)；PTP1B(-/-)膿毒癥組血清TNF-α水平低于野生型膿毒癥組(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠血清TNF-α比較(x±s，pg/mL)

2.3 各組大鼠肝組織中的p-Akt/Akt表達(dá) 野生型假手術(shù)組與PTP1B(-/-)假手術(shù)組大鼠肝組織p-Akt/Akt比值差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)；野生型膿毒癥組、PTP1B(-/-)膿毒癥組大鼠肝組織p-Akt/Akt比值分別低于野生型假手術(shù)組、PTP1B(-/-)假手術(shù)組(均P<0.05)；PTP1B(-/-)膿毒癥組肝組織和p-Akt/Akt比值均高于野生型膿毒癥組(均P<0.05)。見表3和見圖1。

表3 各組大鼠肝組織中Akt蛋白磷酸化水平的比較(x±s)

圖1 各組大鼠p-Akt、Akt蛋白表達(dá)情況

2.4 各組大鼠肝細(xì)胞GLUT-2轉(zhuǎn)移情況 野生型假手術(shù)組與PTP1B(-/-)假手術(shù)組中，GLUT-2蛋白在肝細(xì)胞漿和肝細(xì)胞膜上均有表達(dá)，且在膜上表達(dá)明顯；野生型膿毒癥組的GLUT-2蛋白大部分表達(dá)在肝細(xì)胞漿中，肝細(xì)胞膜上表達(dá)少；PTP1B(-/-)膿毒癥組的 GLUT-2蛋白在肝細(xì)胞漿和肝細(xì)胞膜上均有表達(dá)，但在膜上的表達(dá)較野生型假手術(shù)組與PTP1B(-/-)假手術(shù)組明顯減少，較野生型膿毒癥組明顯增多。見圖2。

圖2 各組大鼠肝細(xì)胞膜GLUT-2表達(dá)情況(免疫熒光染色，×400)

3 討 論

PTP1B是由PTPN1基因編碼的蛋白質(zhì)，由435個(gè)氨基酸組成。人體內(nèi)總共有100多種蛋白酪氨酸磷酸酶，而PTP1B是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的哺乳動(dòng)物蛋白酪氨酸磷酸酶[8]。PTP1B的C端富含脯氨酸將其定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，N端為N-乙?；琢虬彼幔鹬呋Y(jié)構(gòu)域的作用[9]。PTP1B的催化結(jié)構(gòu)域與胰島素受體結(jié)合，通過去磷酸化信號(hào)分子終止胰島素信號(hào)傳導(dǎo)，對胰島素信號(hào)傳導(dǎo)通路起到負(fù)性調(diào)節(jié)的作用。催化結(jié)構(gòu)域的點(diǎn)突變不會(huì)影響PTP1B的整體活性，但是可以干擾PTP1B與胰島素受體的結(jié)合，使胰島素受體不能去磷酸化，從而影響胰島素信號(hào)傳導(dǎo)通路[10]。既往有關(guān)研究表明，在敲除PTP1B基因之后實(shí)驗(yàn)大鼠的表型與壽命均正常，但是可以抵抗高脂肪喂養(yǎng)誘導(dǎo)的肥胖發(fā)生，并且胰島素的敏感性顯著增強(qiáng)[11]。此外，有研究顯示，體內(nèi)細(xì)胞炎癥因子可以誘導(dǎo)PTP1B蛋白的過度表達(dá)，表明炎癥因子水平與PTP1B的表達(dá)密切相關(guān)[12]。

本研究采用大鼠進(jìn)行盲腸結(jié)扎穿孔聯(lián)合腹腔內(nèi)內(nèi)毒素注射建立膿毒癥致胰島素抵抗大鼠模型，可以觀察到野生型膿毒癥組大鼠的HOMA-IR指數(shù)較野生型假手術(shù)組增加，提示建模成功；而PTP1B(-/-)膿毒癥組大鼠的HOMA-IR指數(shù)較野生型膿毒癥組降低，這說明PTP1B基因的缺失可以一定程度上改善膿毒癥大鼠的胰島素抵抗。此外，野生型膿毒癥組大鼠的血清TNF-α水平較野生型假手術(shù)組增加，而PTP1B(-/-)膿毒癥組大鼠的血清TNF-α水平低于野生型膿毒癥組，這說明膿毒癥發(fā)生時(shí)大鼠體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生大量炎性因子，而PTP1B基因的缺失可能影響炎性因子的釋放，從而可抑制機(jī)體的炎癥反應(yīng)。

膿毒癥的主要病理生理學(xué)特點(diǎn)是全身炎癥反應(yīng)綜合征，膿毒癥患者體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生大量炎性因子，例如由單核-巨噬細(xì)胞或者損傷組織釋放的促炎性介質(zhì)TNF-α、白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-1、IL-6、IL-10等；這些炎癥因子大量釋放并形成逐漸放大的“瀑布樣”鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，最終導(dǎo)致失控的全身炎癥反應(yīng)，同時(shí)這些炎性因子還可以改變胰島素信號(hào)通路的傳導(dǎo)，其可能的機(jī)制是與胰島素競爭靶細(xì)胞膜上的胰島素受體[13]。而胰島素在靶細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮生理作用主要取決于葡萄糖的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，而這一過程需要借助于GLUT[14]。GLUT通常在細(xì)胞膜與細(xì)胞質(zhì)之間循環(huán)，在胰島素與靶細(xì)胞膜上的胰島素受體結(jié)合之后，細(xì)胞質(zhì)中的GLUT移位到細(xì)胞膜上，從而發(fā)揮其生理作用。GLUT的移位受到胰島素信號(hào)傳導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)，其中的經(jīng)典通路是磷脂酰肌醇3-激酶/Akt通路，胰島素與胰島素受體結(jié)合之后激活該通路，可以促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白向細(xì)胞膜移位[15]，而Akt的磷酸化是該信號(hào)傳導(dǎo)通路的關(guān)鍵限速步驟之一。在本研究中，野生型膿毒癥組大鼠肝組織的p-Akt/Akt以及GLUT-2蛋白在肝細(xì)胞膜上的表達(dá)均較野生型假手術(shù)組減少，而PTP1B(-/-)膿毒癥組大鼠的上述指標(biāo)均較野生型膿毒癥組增加。這表明PTP1B基因缺失可提高膿毒癥大鼠Akt磷酸化水平(p-Akt/Akt)，進(jìn)而增強(qiáng)胰島素傳導(dǎo)信號(hào)，同時(shí)可促進(jìn)GLUT轉(zhuǎn)運(yùn)至肝細(xì)胞膜，從而增強(qiáng)胰島素在靶細(xì)胞內(nèi)的生理作用。

綜上所述，在大鼠中PTP1B基因缺失可以改善膿毒癥所致的胰島素抵抗，其可能機(jī)制是減輕細(xì)胞外的炎癥因子水平從而緩解對胰島素受體的競爭效應(yīng)以及改變細(xì)胞內(nèi)的胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。本研究結(jié)果或可為PTP1B抑制劑治療膿毒癥所致胰島素抵抗提供一定的理論基礎(chǔ)。