陳 怡 羅 文

(紹興文理學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，浙江 紹興 312000)

人的皮膚依次由表皮、真皮和皮下組織構(gòu)成，其中表皮又分為角質(zhì)層、透明層、顆粒層和基底層四層組織.黑素細(xì)胞存在于表皮基底層，呈樹(shù)狀突起，其細(xì)胞內(nèi)形成的黑色素通過(guò)樹(shù)狀突起運(yùn)輸?shù)浇琴|(zhì)層，形成皮膚的顏色和色素沉積.色素的形成一方面可以吸收紫外線，防止皮膚細(xì)胞遭受紫外線的損害，另一方面色素會(huì)使皮膚變黑并且形成色斑影響美觀.因此尋求既能保護(hù)皮膚細(xì)胞又具有美白作用的護(hù)膚品一直是人們不懈的追求.珍珠粉自古就是美容潤(rùn)膚之佳品，據(jù)李時(shí)珍的《本草綱目》記載：“珍珠涂面，令人潤(rùn)澤好顏色，涂手足，去皮膚逆臚，能化面去黯，令光澤潔白”.清末的慈禧太后，年過(guò)六十皮膚仍潤(rùn)澤柔滑，經(jīng)考證與她長(zhǎng)期內(nèi)服外用珍珠粉有關(guān)[1].現(xiàn)代典籍《中華人民共和國(guó)藥典》亦記載有珍珠具有潤(rùn)澤肌膚的功效[2].然而對(duì)于珍珠粉，人們只知道它具有美白潤(rùn)膚的效果，到底是珍珠粉中何種成分起到美白作用還了解甚少，因此本研究以人A375黑色素瘤細(xì)胞為模型，通過(guò)添加珍珠粉提取物，探究珍珠粉的美白作用.

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

細(xì)胞：人A375黑色素瘤細(xì)胞：購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞研究所；珍珠粉：購(gòu)自諸暨市山下湖珍珠有限公司；試劑：MTT細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒，多巴胺，DMEM培養(yǎng)基，胎牛血清(FBS)等試劑均購(gòu)自美國(guó)BBI公司.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 珍珠粉提取物的制備

配制pH 4.8的乙酸-乙酸鈉緩沖液， 將珍珠粉與緩沖液以1∶25(g∶mL)的比例混合，攪拌30 min后， 靜置12 h， 將反應(yīng)液離心5 min(5 000 r/min)，取上清液置于真空冷凍干燥機(jī)中凍干，即為珍珠粉總提取物；重復(fù)上述步驟，將上清液倒入透析袋中透析72 h，取透析液置于真空冷凍干燥機(jī)中凍干，即為珍珠粉蛋白提取物[3].

1.2.2 細(xì)胞增殖活性的測(cè)定

取A375細(xì)胞置于DMEM培養(yǎng)基中，添加10% FBS，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105個(gè)/mL，按每孔100 μL接種至96孔板，培養(yǎng)24 h.分別取珍珠粉總提取物和蛋白提取物配制成0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.8 mg/mL樣品，加入各孔板中，每組平行5次，對(duì)照組添加等量培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)12 h，24 h，36 h，48 h.培養(yǎng)結(jié)束前4 h加5 mg/mL的MTT10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，吸出培養(yǎng)液，每孔加入90 μL DMSO，將96孔板置于微孔板振蕩器震蕩10 min，490 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值[4].

1.2.3 酪氨酸酶活性的測(cè)定

取A375細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105個(gè)/mL，按每孔100 μL接種至96孔板，培養(yǎng)24 h后棄培養(yǎng)基，添加0.2 mg/mL珍珠粉總提取物和珍珠粉蛋白提取物，每組平行5次，繼續(xù)培養(yǎng)24 h.培養(yǎng)結(jié)束后，用pH 7.4的0.01M的PBS洗滌2次，棄上清液.每孔加1%Triton-X溶液90 μL，迅速置-80 ℃冰箱內(nèi)放置30 min，反復(fù)凍融兩次.37 ℃預(yù)熱，每孔加入0.5%多巴胺溶液50 μL，37 ℃下反應(yīng)1 h，490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值[5-7].

1.2.4 黑素含量的測(cè)定

取A375細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105個(gè)/mL，按每孔1 mL接種于24孔板，培養(yǎng)24 h后吸出培養(yǎng)液，加入0.2 mg/mL珍珠粉總提取物和珍珠粉蛋白提取物1 mL，每組平行5次.同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組，對(duì)照組添加培養(yǎng)液1 mL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h.培養(yǎng)結(jié)束后，用0.25%的胰蛋白酶進(jìn)行消化，將細(xì)胞收集入離心管中離心10 min(1 000 r/min)，傾去上清液，用PBS洗2次后，取下層沉淀，加1 mol/L氫氧化鈉溶液，37 ℃作用48 h，加入100 μL左旋多巴，490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值[5,7].

1.2.5 紫外線照射下A375細(xì)胞酪氨酸酶活性和黑色素含量的測(cè)定

將A375細(xì)胞分為四組，每組設(shè)五個(gè)平行.第一組即對(duì)照組：細(xì)胞無(wú)紫外線照射也添加珍珠粉提取物；第二組即實(shí)驗(yàn)組1：細(xì)胞進(jìn)行紫外線照射但不添加珍珠粉提取物；第三組即實(shí)驗(yàn)組2：細(xì)胞添加珍珠粉提取物后再進(jìn)行紫外線照射；第四組即實(shí)驗(yàn)組3：細(xì)胞進(jìn)行紫外線照射后再添加珍珠粉提取物.分光光度法測(cè)定細(xì)胞酪氨酸酶活性和黑色素的含量，方法同上.紫外燈發(fā)射的紫外線波長(zhǎng)為290 nm～390 nm，峰值為365 nm，燈管垂直下方30 cm處的紫外線指數(shù)為150 μW·cm-2，實(shí)驗(yàn)中紫外燈照射時(shí)間均為90 s.

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所測(cè)數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，數(shù)值以平均值±SD表示，組間比較采用單因素方差分析檢驗(yàn)(ANOVA)，P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 珍珠粉提取物的制備

經(jīng)乙酸-乙酸鈉緩沖液提取獲得珍珠粉總提取物和珍珠粉蛋白提取物如圖1所示，總提取物呈白色顆粒狀結(jié)晶，蛋白提取物呈淡黃色粉末狀顆粒.

珍珠粉總提取物 珍珠粉蛋白提取物

2.2 珍珠粉提取物對(duì)A375細(xì)胞增殖活性的影響

對(duì)于空白對(duì)照組，A375細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，如圖2A、圖2D所示，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞密度逐漸增加.當(dāng)添加珍珠粉總提取物和珍珠粉蛋白提取物時(shí)，細(xì)胞增殖活性隨著濃度的升高而下降，如表1所示：當(dāng)作用12 h、珍珠粉總提取物濃度為0.4 mg/mL、0.8 mg/mL時(shí)，細(xì)胞增殖活性降低，與空白對(duì)照組相比具有顯著性差異(P<0.05)；當(dāng)作用24 h、珍珠粉總提取物濃度為0.4 mg/mL、0.8 mg/mL時(shí)，與空白對(duì)照組相比，細(xì)胞增殖活性仍降低(P<0.05)，當(dāng)珍珠粉總提取物濃度為0.2 mg/mL、作用24 h時(shí)，細(xì)胞增殖活性O(shè)D值為(0.107±0.007)，與空白對(duì)照組相比差異不顯著；當(dāng)作用36 h、48 h時(shí)，隨著濃度的增加，細(xì)胞增殖活性繼續(xù)降低(P<0.01).

空白對(duì)照組 添加0.2 mg/mL 添加0.8 mg/mL 空白對(duì)照組 添加0.2 mg/mL 添加0.8 mg/mL

表1 珍珠粉提取物對(duì) A375 細(xì)胞增殖的影響

對(duì)于蛋白提取物，當(dāng)添加濃度為0.4 mg/mL、0.8 mg/mL時(shí)，抑制細(xì)胞的增殖，與對(duì)照組相比具有顯著性差異(P<0.05).當(dāng)添加濃度為0.1 mg/mL、0.2 mg/mL時(shí)，蛋白提取物對(duì)細(xì)胞增殖活性無(wú)影響.綜上所述，為了使珍珠粉提取物對(duì)A375細(xì)胞的增殖活性影響最小，故后續(xù)試驗(yàn)選取0.2 mg/mL的添加劑量和24 h作為最佳濃度和作用時(shí)間.

2.3 珍珠粉提取物對(duì)細(xì)胞酪氨酸酶和黑色素含量的影響

取0.2 mg/mL珍珠粉提取物作用于A375細(xì)胞24 h，細(xì)胞酪氨酸酶活性和黑色素含量如圖3所示：總提取物和蛋白提取物會(huì)增加酪氨酸酶活性，與對(duì)照組相比均有顯著性差異(P<0.05).總提取物和蛋白提取物會(huì)促使細(xì)胞產(chǎn)生黑色素.當(dāng)添加總提取物時(shí)，細(xì)胞黑色素含量OD值為(0.063±0.009)與對(duì)照組(0.051±0.012)相比具有顯著性差異(P<0.05)；當(dāng)添加蛋白提取物時(shí)，細(xì)胞黑色素含量OD值為(0.086±0.008)與對(duì)照組(0.051±0.011)相比差異極顯著(P<0.01).

珍珠粉提取物對(duì)細(xì)胞酪 珍珠粉提取物對(duì)細(xì)胞

2.4 紫外照射下珍珠粉各提取物對(duì)細(xì)胞酪氨酸酶活性和黑色素含量的影響

在紫外照射下，細(xì)胞酪氨酸酶活性和黑色素含量如表2所示.對(duì)于珍珠粉總提取物，經(jīng)紫外線照射的實(shí)驗(yàn)組1、2、3與未有紫外線照射的對(duì)照組相比，細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶活性增大(P<0.05)，黑色素含量增多(P<0.05)，這說(shuō)明紫外線的照射，確實(shí)能夠促進(jìn)A375細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶活性，促進(jìn)黑色素的產(chǎn)生.然而實(shí)驗(yàn)組2、3與實(shí)驗(yàn)組1相比，細(xì)胞酪氨酸酶活性增大，具有顯著性差異(P<0.05)，而黑色素含量變化不明顯沒(méi)有顯著性差異，這說(shuō)明珍珠粉總提取物能夠刺激A375細(xì)胞酪氨酸酶的活性，但不會(huì)增加黑色素的產(chǎn)生.

對(duì)于珍珠粉蛋白提取物，經(jīng)紫外線照射的實(shí)驗(yàn)組1、2、3與未有紫外線照射的對(duì)照組相比，細(xì)胞酪氨酸酶活性增大，具有顯著性差異(P<0.05)，黑色素含量增多，差異顯著(P<0.05).然而添加珍珠粉蛋白提取物的實(shí)驗(yàn)組2、3與未添加珍珠粉蛋白提取物的實(shí)驗(yàn)組1相比，酪氨酸酶活性沒(méi)有顯著性差異，而黑色素含量卻減少，差異顯著(P<0.05).這說(shuō)明珍珠粉蛋白提取物在紫外線的照射下，并沒(méi)有增加細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶的活性，卻能夠抑制黑色素的生成，具有抵抗紫外線、美白的作用.

3 討論

3.1 酪氨酸酶及黑色素的形成機(jī)理

黑素細(xì)胞起源于胚胎神經(jīng)嵴，具有樹(shù)狀突起，屬于腺細(xì)胞[8].黑色素的合成必須有3種基本物質(zhì)：酪氨酸、酪氨酸酶和氧，可大體分為兩個(gè)階段，如圖4所示：第一階段是由酪氨酸酶催化酪氨酸形成L-多巴，L-多巴進(jìn)一步氧化生成多巴醌.第二階段以多巴醌為原料，一方面通過(guò)多巴醌轉(zhuǎn)變?yōu)槎喟蜕匦纬烧婧谒?，另一方面多巴醌可以轉(zhuǎn)變成谷胱甘肽多巴和半胱氨酰多巴，從而生成褪黑素.真黑素和褪黑素在細(xì)胞內(nèi)共同作用， 最終形成黑色素[9-11]. 形成的黑色素在皮膚內(nèi)被分解、溶解和吸收后穿越基底膜，被真皮層的嗜黑色素細(xì)胞吞噬后，通過(guò)淋巴液帶到淋巴結(jié)再經(jīng)血液循環(huán)從腎臟排出體外；黑色素也通過(guò)黑素細(xì)胞樹(shù)狀突起，向角質(zhì)形成細(xì)胞轉(zhuǎn)移，然后隨表皮細(xì)胞上行至角質(zhì)層，形成色素沉積和色斑[12-14].酪氨酸酶是酪氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)槎喟王拇呋瘎?，由酪氨酸酶相關(guān)蛋白-1和酪氨酸酶相關(guān)蛋白-2組成[15-16].霍仕霞等[17]發(fā)現(xiàn)，酪氨酸酶相關(guān)蛋白-1能氧化酪氨酸酶相關(guān)蛋白-2產(chǎn)生色素顆粒，加速真黑素的形成，進(jìn)而形成黑色素的沉積.

圖4 黑色素形成機(jī)理圖

黑色素的合成也受細(xì)胞外多種生理刺激物的影響，如促黑素細(xì)胞激素，雌激素和紫外線等[18].黑色素可吸收或反射紫外線UVA，保護(hù)深部組織免受輻射損傷[19].UVB輻照是誘導(dǎo)皮膚色素沉著的強(qiáng)烈外源性刺激因子，它除了能夠促使角質(zhì)形成細(xì)胞合成分泌多種神經(jīng)肽和促炎因子間接刺激黑素細(xì)胞合成分泌黑素外，還能夠促進(jìn)黑素小體從黑素細(xì)胞至角質(zhì)形成細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程[20-21].雖然黑色素能對(duì)皮膚起到光保護(hù)作用，但其在皮膚中蓄積產(chǎn)生的色素斑點(diǎn)會(huì)不同程度地影響美觀[22]，因此人們一直在尋求美白護(hù)膚的產(chǎn)品.

3.2 珍珠粉提取物對(duì)酪氨酸酶及黑色素的作用

本研究結(jié)果表明：在無(wú)紫外線照射下，添加珍珠粉提取物，A375細(xì)胞的酪氨酸酶活性和黑色素含量增加，這說(shuō)明珍珠粉提取物具有刺激A375細(xì)胞產(chǎn)生更多的酶和黑色素的潛能，以抵抗外界帶來(lái)的不良反應(yīng)如紫外線的傷害.當(dāng)有紫外線照射后，A375細(xì)胞中的酪氨酸酶和黑色素含量增加，這一結(jié)果與常建民[23]的研究結(jié)果相一致，即紫外線可以刺激細(xì)胞產(chǎn)生黑色素，從而保護(hù)細(xì)胞免受輻射傷害，然而當(dāng)給予珍珠粉提取物后，這一結(jié)果發(fā)生了改變.對(duì)于珍珠粉總提取物，無(wú)論是紫外線照射前添加還是照射后添加，A375細(xì)胞的酪氨酸酶活性都增加(P<0.05)，這說(shuō)明珍珠粉總提取物中含有刺激酪氨酸酶活性的物質(zhì)成分，但是A375細(xì)胞中的黑色素含量并未明顯增加(P>0.05)，這說(shuō)明珍珠粉總提取物中含有抑制黑色素合成的物質(zhì)成分.酪氨酸酶活性的升高，確實(shí)能促使酪氨酸轉(zhuǎn)變成多巴和多巴醌，但多巴醌會(huì)轉(zhuǎn)變成多巴色素和谷胱甘肽多巴與半胱氨酰多巴，前者即多巴色素在酪氨酸酶的進(jìn)一步催化下形成色素顆粒，而后者即谷胱甘肽多巴與半胱氨酰多巴確能生成褪黑素，只有當(dāng)色素顆粒含量多于褪黑素時(shí)，才能最終形成黑色素，因而單純的酪氨酸酶活性的升高不能直接說(shuō)明黑色素的含量就一定增加.

同樣，對(duì)于珍珠粉蛋白提取物，無(wú)論在紫外線照射前還是照射后添加，A375細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶活性并未有顯著變化(P>0.05)，而黑色素含量確在減少，這說(shuō)明珍珠粉蛋白提取物中也存在抑制黑色素合成的物質(zhì)成分.

珍珠粉蛋白提取物是在珍珠粉總提取物的基礎(chǔ)上，經(jīng)過(guò)透析后獲得的.與珍珠粉總提取物相比，珍珠粉蛋白提取物缺少鈣離子等礦物質(zhì).研究表明[24]，細(xì)胞外鈣離子對(duì)皮膚屏障功能的形成至關(guān)重要，在皮膚屏障破壞時(shí)，若能將鈣離子濃度恢復(fù)至正常生理范圍，受損的皮膚和皮膚屏障功能可更為迅速地恢復(fù).因而認(rèn)為珍珠粉總提取物中的鈣離子或其他礦物質(zhì)使酪氨酸酶活性升高，但提取物中的某種成分會(huì)抑制黑色素的合成.透析后由于鈣等離子流失，使得珍珠粉蛋白提取物作用紫外線照射后的A375細(xì)胞后，細(xì)胞中的酪氨酸酶活性未有改變，但抑制黑色素合成的成分還在，因而黑色素的含量下降，從而實(shí)現(xiàn)美白作用.對(duì)于珍珠粉中抑制黑色素合成的成分到底是什么以及珍珠粉提取物尤其是蛋白提取物如何刺激多巴醌，進(jìn)而影響色素顆粒和褪黑素含量的改變有待研究，并且為什么珍珠粉提取物必須在紫外線作用下才能實(shí)現(xiàn)美白作用也仍需進(jìn)一步探究.