劉文博
(山西省檢驗檢測中心 藥品檢驗技術(shù)研究所,山西太原 030031)
肌醇是微生物及動物生長的必要元素,可以從動物的心肌和肝臟中分離取得,主要以磷脂的形式存在,又稱肌醇磷脂[1]。肌醇可以代謝清除肝臟脂肪和膽固醇,預(yù)防動脈硬化,并且供給腦細(xì)胞營養(yǎng),促進(jìn)正常發(fā)絲的生長[2]。由于肌醇的食物營養(yǎng)強化作用,多應(yīng)用于運動功能飲品、嬰幼兒配方食物等保健食品中,此外在發(fā)酵和食品工業(yè)中,肌醇可用于多種菌種的培養(yǎng)和促進(jìn)酵母的增長等作用[3]。目前,肌醇的檢測范圍主要包括保健食品如功能性飲料及嬰兒配方奶粉等,檢測方法主要有微生物法、氣相色譜法、液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法和毛細(xì)管電泳法等,各種檢測方法有各自的特點與不適用性[4]。本研究結(jié)合實驗室現(xiàn)有設(shè)備條件,對GB 5009.196—2003[5]中氣相色譜法測定保健食品中的肌醇含量進(jìn)行方法學(xué)驗證,并探討了前處理過程中的關(guān)鍵點,旨在為今后相關(guān)部門開發(fā)出更為準(zhǔn)確精密、檢測范圍更廣的實驗方法提供參考。
樂虎功能性保健飲料(達(dá)利食品集團(tuán)有限公司);國家藥品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)肌醇(純度為99.6%,中國食品藥品檢定研究院);無水乙醇、正己烷、六甲基二硅氨烷、N,N-二甲基甲酰胺(均為分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);無水硫酸鈉(分析純,天津市申泰化學(xué)試劑有限公司);三甲基氯硅烷(化學(xué)純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);實驗用水為一級超純水。
GC-2010 氣相色譜儀(附氫火焰檢測器,日本島津公司);XS 105 微量天平(精度0.000 01g,瑞士梅特勒-托利多公司);KQ5200DE 數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);EV311 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(北京萊伯泰科儀器股份有限公司);101-1A 電熱鼓風(fēng)干燥箱(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)。
1.3.1 試劑溶液制備
肌醇標(biāo)準(zhǔn)溶液:將肌醇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)于100 ℃的電熱鼓風(fēng)干燥箱中干燥4 h,準(zhǔn)確稱量0.052 05 g 于100 mL 容量瓶中,以70%乙醇溶液溶解并定容至刻度,配成0.520 5 mg/mL 肌醇溶液。
硅烷化試劑:分別量取一定量的三甲基氯硅烷、六甲基二硅氨烷、二甲基甲酰胺,以1 ∶2 ∶8 的體積比混合,現(xiàn)配現(xiàn)用。
1.3.2 供試品溶液制備
準(zhǔn)確量取樂虎試樣2.0 mL 于三角瓶中,加入70%的乙醇溶液,使其含肌醇濃度為0.5 mg/mL,超聲波提取10 min 后,在3 000 r/min 的條件下離心5 min,取出上清液備用。
準(zhǔn)確量取1.0 mL 試樣上清液于旋蒸瓶中,加入5 mL 無水乙醇,于60 ℃下旋蒸濃縮至近干,反復(fù)3 次,直至旋蒸瓶中液體完全除去。之后再向旋蒸瓶中加入5.0 mL 硅烷化試劑,使用超聲波提取器混勻瓶中內(nèi)容物。再置于70 ℃水浴中加熱10 min,靜置待其冷卻后加入10 mL 純化水,再加入3.0 mL 正己烷,振搖1 min 后靜置10 min,在3 000 r/min 下離心5 min,以滴管取出正己烷層,加入少許無水硫酸鈉,小幅度振搖后放置,取上清液上機(jī)待測。
1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)系列制備
分別吸取0.2 mL、0.4 mL、1.0 mL、2.0 mL 和4.0 mL 濃度為0.520 5 mg/mL 的肌醇標(biāo)準(zhǔn)溶液于5 個10 mL 容量瓶中,以70%乙醇溶液溶解并定容至刻度,配成濃度為0.010 41 mg/mL、0.020 82 mg/mL、0.052 10 mg/mL、0.104 10 mg/mL 和0.208 20 mg/mL的肌醇標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。
準(zhǔn)確量取1.0 mL 上述肌醇標(biāo)準(zhǔn)系列溶液于旋蒸瓶中,按1.3.2 中步驟操作,得到肌醇標(biāo)準(zhǔn)衍生溶液,上機(jī)待測。
1.3.4 氣相色譜條件
色 譜 柱:BP-5 毛 細(xì) 管 柱(25 m×0.32 mm,0.25 μm);柱溫:恒溫190 ℃;進(jìn)樣口溫度:245 ℃;進(jìn)樣方式:分流進(jìn)樣,分流比為1 ∶50;進(jìn)樣量:1 μL;載氣:高純氮,流速為50 mL/min;檢測器:FID,空氣流量500 mL/min,氫氣流量40 mL/min,尾吹氣N2流量50 mL/min;色譜峰保留時間定性,峰面積外標(biāo)法定量。
在1.3.4 色譜條件下,28 min 內(nèi)能完成標(biāo)準(zhǔn)溶液與供試品溶液中肌醇的在線分析,標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖如圖1,肌醇色譜峰尖銳對稱,與溶劑峰、雜質(zhì)峰能較好地分離,可以準(zhǔn)確地進(jìn)行分析檢測。
圖1 肌醇標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖
2.2.1 水分對實驗的影響
向兩份樂虎飲料中添加相同含量的肌醇標(biāo)準(zhǔn)溶液,其中一份在旋蒸過程中水分揮發(fā)不完全,另一份完全蒸干水分,測定比較兩者的回收率,考察實驗中水分的完全除去與否對測定結(jié)果的影響。結(jié)果顯示,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)過程中水分未完全揮發(fā)的回收率為84.5%,水分揮發(fā)完全的回收率為100.1%,表明前處理中水分的完全除去與否對實驗回收率影響較大。原因可能是當(dāng)旋蒸過程中水分揮發(fā)不完全,部分肌醇溶于水中未被提取出來,因此實驗過程中應(yīng)確保烘干水分,可在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后再將三角瓶放入烘箱中在75 ℃下烘干1 ~2 h,確保試樣中不含水分。
2.2.2 乙醇濃度對實驗的影響
向兩份樂虎飲料中添加相同含量的肌醇標(biāo)準(zhǔn)溶液,其中一份在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)時使用無水乙醇,另一份使用95%乙醇,測定比較兩者的回收率,考察實驗中乙醇濃度對測定結(jié)果的影響。結(jié)果顯示,旋蒸過程中使用無水乙醇時回收率為102.6%,使用95%乙醇時回收率為99.6%,均在國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 27404—2008[6]要求的95%~105%范圍內(nèi),表明旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)過程中所用乙醇的濃度對實驗結(jié)果影響并不大。
將肌醇標(biāo)準(zhǔn)系列溶液分別進(jìn)樣于氣相色譜儀中,測定相對應(yīng)的峰面積,以峰面積為y軸,以進(jìn)樣濃度為x軸,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計算出線性回歸方程為y=1 615 898x-2 159,相關(guān)系數(shù)r=1,表明肌醇在0.010 41 ~0.208 2 mg/mL 呈現(xiàn)良好線性關(guān)系。吸取0.01 mL 2.2.2 中的樂虎飲料加標(biāo)溶液于10 mL 容量瓶中,用甲醇定容,搖勻,以氣相色譜進(jìn)樣量5 μL作為檢測限,進(jìn)樣量10 μL 作為定量限,測得該方法的檢出限為0.20 μg/mL,定量限為0.98 μg/mL。
準(zhǔn)確稱取18 份0.25 g 的樂虎飲料試樣(經(jīng)本方法測得肌醇本底含量為0.098 mg)平均分為3 份,按照低、中、高3 種濃度水平分別加入0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL 濃度為0.8 μg/mL 的肌醇標(biāo)準(zhǔn)中間液,按照1.3 實驗方法將每種濃度水平進(jìn)行6 平行測試,計算方法的回收率與重復(fù)性RSD,結(jié)果見表1。樂虎飲料試樣中肌醇在0.083 3 ~0.124 9 mg 添加水平下,回收率在96.0%~104.7%,重復(fù)性RSD為1.37%~2.67%,表明本方法準(zhǔn)確度與重復(fù)性較好。
表1 肌醇的加標(biāo)回收率與重復(fù)性實驗結(jié)果
將濃度為53.865 ng/mL 的肌醇標(biāo)準(zhǔn)衍生溶液分別于0 h、2 h、6 h、12 h、24 h 和36 h 時按照1.3.4色譜條件進(jìn)行在線分析,考察方法的穩(wěn)定性,測得峰面積(uV·min)分別為10 905、10 728、11 221、11 256、11 329 和11 533,計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.63%,表明肌醇衍生待測液在36 h 內(nèi)基本穩(wěn)定,可以滿足多批次處理、儀器連續(xù)進(jìn)樣的需求。
本研究對國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.196—2003 中肌醇含量的測定方法進(jìn)行了驗證,并探討了旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)過程中水分揮發(fā)程度及乙醇濃度對實驗結(jié)果的影響。結(jié)果表明,旋蒸過程中水分必須完全除去,而乙醇濃度對實驗結(jié)果影響不大。通過對方法的線性關(guān)系、檢出限、定量限、加標(biāo)回收率、重復(fù)性及穩(wěn)定性進(jìn)行考察,該方法符合GB 5009.196—2003 與GB/T 27404—2008 中的相關(guān)要求,可以滿足當(dāng)前食品檢測實驗室高通量、快速、準(zhǔn)確的檢測需求。