王娟，程華，胡琛光，林斯，于飛，劉濤，劉朋朋

(1.河北農(nóng)業(yè)大學 河北野生動物健康研究中心，河北 保定 071000；2.河北農(nóng)業(yè)大學 生命科學學院，河北 保定 071000；3.河北省科學院 生物研究所，河北 石家莊 050081；4.北京華科泰生物技術股份有限公司，北京 101111；5.天津華科泰生物技術有限公司,天津 300405)

乳腺癌已居女性惡性腫瘤之首，統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示2018年全球女性乳腺癌新發(fā)病例達210萬例，約占女性腫瘤的25%，且發(fā)病趨向年輕化，嚴重威脅女性生命健康[1-3].人表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2，HER2)基因也被稱為ERBB2，是位于人體17號染色體長臂上的原癌基因，編碼分子質量為185 ku的跨膜蛋白，定位于細胞膜表面，由胞外配體結合結構域、跨膜結構域和胞內蛋白酪氨酸激酶結構域3部分構成，其可與EGFR、HER3結合形成異源二聚體或與自身結合形成同源二聚體，導致胞內酪氨酸激酶結構域自身磷酸化，激活下游PI3K/AKT、RAS/RAF、JAK/STAT3等信號通路，抑制細胞凋亡，促進腫瘤細胞的增殖和遷移.HER2陽性乳腺癌占所有類型乳腺癌的15%～20%，且其惡性程度更高，預后更差[4-6].因此HER2是乳腺癌患者重要的預后指標，也是抗HER2藥物治療的主要預測指標.

目前，免疫組織化學(IHC)和熒光原位雜交(FISH)技術是評價乳腺癌患者HER2表達的主要手段，然而對于乳腺癌HER2陽性患者的病程和治療效果動態(tài)監(jiān)控亟需開發(fā)更為簡便的方法[7].研究發(fā)現(xiàn)60.46%乳腺癌患者血清和組織HER2表達結果一致，提示血清HER2測定和組織學測定結果一致性較高，具有臨床應用價值[8-9].HER2蛋白胞外區(qū)(extracellular domain，ECD)通過基質金屬蛋白酶的作用脫落進入血液，即血清HER2 ECD，可通過免疫測定的方法進行定量檢測，因此血清HER2 ECD值可能作為檢測癌細胞復發(fā)和轉移以預測治療反應的潛在生物標志物[10-12].本研究建立了血清HER2蛋白磁微?；瘜W發(fā)光免疫檢測法，并對其性能和已上市的西門子公司生產(chǎn)的同類型試劑盒的等效性進行了評價，以期為臨床應用提供科學參考.

1 材料和方法

1.1 材料及樣本來源

HER2抗體、抗原由河北省科學院生物研究所制備；標記有鏈霉親和素(SA)的超順磁性磁微粒、牛血清白蛋白(BSA)以及堿性磷酸酶(AP)購自羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司；4-(N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷羧酸-N-琥珀酰亞胺酯(SMCC)及酯化生物素(B)來自西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、碳酸鈉、碳酸氫鈉、三羥甲基氨基甲烷(Tris)等購自國藥集團化學試劑北京有限公司；發(fā)光底物、洗滌液及磁微?；瘜W發(fā)光免疫分析儀(SAVANT-2020)由北京華科泰生物技術股份有限公司提供.乳腺癌患者及健康查體樣本于2021年1月至12月收集于華北煤炭總醫(yī)院，共100例.

1.2 檢測方法建立

1.2.1 校準品的配制

采用牛血清稀釋液將HER2抗原稀釋至300、100、30、10、3、0 ng/mL，標記為S5～S0，2～8 ℃保存.

1.2.2 生物素標記抗體的制備

取包被抗體1 mg(該抗體經(jīng)Protein A親和純化，純度>95%)，放入0.05 mol/L碳酸緩沖液透析30 min后與1 mg酯化生物素室溫攪拌1 h，隨后將其置于磷酸緩沖液透析過夜.按照體積比1∶1 000，用含質量分數(shù)為1% BSA的0.1 mol/L Tris-HCl緩沖液配制試劑R1.

1.2.3 堿性磷酸酶標記抗體

取標記抗體1 mg(該抗體經(jīng)Protein A親和純化，純度>95%)，放入0.05 mol/L碳酸緩沖液透析30 min，隨后采用SMCC常規(guī)標記方案進行AP的偶聯(lián).最終按照體積比1∶3000的比例用含質量分數(shù)為1% BSA的0.1 mol/L Tris-HCl緩沖液配制試劑R2.

1.2.4 磁微粒的配制

按照磁微粒供應商提供的操作指南，配制0.7 mg/mL的磁微粒試劑，標注為M.

1.3 性能及等效性分析

1.3.1 標準曲線的建立

采用西門子醫(yī)學診斷產(chǎn)品HER2蛋白測定試劑盒(化學發(fā)光法)為企業(yè)標準品賦值，隨后用制備的試劑進行測定并繪制4參數(shù)方程

其中，A為曲線上漸近線估值；D為曲線下漸近線估值；C為最大結合一半時對應的劑量；B為曲線的斜率.

1.3.2 空白限(limit of blank,LoB)評價

參照CLSI EP17-A2:2018(US)《Protocols for Determination of Limits of Detection and Limits of Quantitation;Approved Guideline》，建立廠家試劑盒LoB.LoB由空白樣本結果確定，設置Ⅰ類錯誤水平α和Ⅱ類錯誤水平β為5%，利用質量濃度為0的校準品進行重復性研究(n=180).取3個批次試劑分別對5個0值校準品重復檢測，每天重復檢測2次，連續(xù)檢測6 d.若空白值呈正態(tài)分布，則LoB=μB+1.645 σB,其中，μB和σB分別為空白樣品檢測的均值和標準差.若空白值呈非正態(tài)分布，則LoB為第95百分位數(shù)(PctB)值，即0.95×Bn+0.5位置的結果.其中Bn為檢測的重復次數(shù).

1.3.3 外源性干擾

參照CLSI EP07-A2:2018(US)《Interference Testing in Clinical Chemistry;Approved Guideline》進行實驗.分別在10、100 ng/mL HER2的模擬血清樣本中添加順鉑、環(huán)磷酰胺、鹽酸阿霉素、依托泊苷、甲氨蝶呤等藥物，計算模擬樣本的回收率，檢測其潛在干擾性.

1.3.4 內源性干擾

參照CLSI EP07-A2:2018(US)《Interference Testing in Clinical Chemistry;Approved Guideline》進行實驗.分別在10、100 ng/mL HER2的模擬血清樣本中添加結合膽紅素、未結合膽紅素、甘油三酯、血紅蛋白、膽固醇等干擾物質，計算模擬樣本的回收率，檢測其潛在干擾性.

1.3.5 精密度

參照CLSI EP05-A3:2014(US)《Evaluation of Precision of Quantitative Measurement Methods;Approved Guideline》進行實驗.擬采用5×5的精密度驗證方案，利用單因素方差分析試劑精密度.

1.3.6 回收率

取300 ng/mL的HER2標準品，加入到質量濃度接近于5 ng/mL的陰性樣本中且標準品和陰性樣本的體積比不大于1∶9，重復測定3次，取平均值并計算回收率.

1.3.7 分析特異性

分析特異性實驗參照 CLSI EP07-A2:2018(US)《Interference Testing in Clinical Chemistry;Approved Guideline》進行，分析人表皮生長因子受體(EGFR 或HER1)與該試劑的交叉反應率.

1.3.8 穩(wěn)定性

將成品試劑盒置于2～8 ℃條件下保存，期間以12、24、36、48、60周為周期，將回收實驗、批內重復性、LoB作為驗收條件，根據(jù)結果判斷試劑盒穩(wěn)定性.

1.3.9 一致性評價

采用本研究制備的試劑盒與西門子醫(yī)學HER2蛋白測定試劑盒(化學發(fā)光法)平行檢測100例臨床樣本，擬用Passing-Bablok回歸進行相關性分析，采用Bland-Altman對樣本偏倚進行分析，對本研究制備的試劑盒與市場已有產(chǎn)品進行一致性評價.

2 結果

2.1 標準曲線

將樣本的質量濃度作為橫坐標，檢測發(fā)光值作為縱坐標，用4參數(shù)方程擬合繪制標準曲線，曲線方程為

相關系數(shù)r為0.999 6，表明發(fā)光值和校準品質量濃度在0～300 ng/mL里具有很好的相關性(圖1).

圖1 磁微?；瘜W發(fā)光法檢測HER2蛋白標準曲線Fig.1 Standard curve of the magnetic particles chemiluminescence immunoassay detection of HER2 protein

2.2 LoB

采用IBM SPSS Statistics 25中Kolmogorov-Smirnov和Shapiro-Wilk檢驗法對空白樣本檢測結果進行正態(tài)性檢驗，鑒于樣本量小于5 000，則按照Shapiro-Wilk檢驗結果呈非正態(tài)分布(P<0.05)，使用非參數(shù)法計算LoB.第95百分位數(shù)(PctB)值為180×(95/100)+0.5=171.5，即LoB=X171+0.5(X172-X171)，X171與X172是第171和第172的觀測值.對180個檢測結果由小到大進行排序，得到X171=0.48 ng/mL，X172=0.48 ng/mL，即空白限LoB=0.48 ng/mL(表1).

表1 LoB正態(tài)性檢驗Tab.1 LoB normal test

2.3 外源性干擾

在10 ng/mL和100 ng/mL HER2的模擬血清樣本中添加表2藥物，平均回收率<5%，表明該試劑具有很好的抗藥物干擾能力.

表2 外源性干擾Tab.2 Exogenous interference

2.4 內源性干擾

在10 ng/mL和100 ng/mL HER2的模擬血清樣本中添加表3內源性物質，平均回收率<5%，表明該試劑同時具有很好的抗內源性干擾能力.

表3 內源性干擾Tab.3 Endogenous interference

2.5 精密度

對HER2質量濃度為10 ng/mL和100 ng/mL的質控品L/H以及質量濃度約為14 ng/mL和70 ng/mL混合血清樣本S1/S2進行檢測，結果如表4所示，批間與批內CV均小于8%，證明該試劑有較高的精密度.

表4 精密度分析Tab.4 Accuracy analysis

2.6 回收率

回收率結果為98.21%，在90%～110%內符合預期標準.

2.7 分析特異性

與質量濃度最大為10 000 ng/mL的人皮生長因子受體(EGFR或HER1)交叉反應率為0.05%，可以忽略不計.

2.8 穩(wěn)定性

穩(wěn)定性測試結果如表5所示，在60周內HER2試劑的回收率、空白限和重復性均滿足性能指標，證明該試劑具有較好的穩(wěn)定性，在規(guī)定的儲存條件下有效期大于48周.

表5 穩(wěn)定性驗證Tab.5 Stability verification

2.9 等效性評價

分別應用本研究建立的HER2/neu診斷方法與西門子公司生產(chǎn)的ADVIA Centaur HER2診斷試劑盒對來自于臨床的100個樣本進行檢測，相關性和偏倚性分析結果顯示，相關系數(shù)r=0.995，樣本平均偏倚為-0.2 ng/mL(圖2，3),證明所開發(fā)試劑與西門子公司生產(chǎn)的HER2檢測試劑盒檢測結果具有很好的一致性.

ρ1.SAVANT測定值；ρ2.ADVIA Centaur測定值.圖2 HER2蛋白結果相關性分析Fig.2 Correlation analysis of HER2 protein

ρ.ADVIA Centaur和SAVANT測定均值.圖3 HER2蛋白結果偏倚分析Fig.3 Bias analysis of HER2 protein

3 討論

血清腫瘤標志物是罹患腫瘤時存在于機體血液中的糖類、酶類以及激素等多種類型的特異性反應產(chǎn)物，正常情況下機體血液中無表達或僅有少量表達，發(fā)生腫瘤時血液含量明顯升高，因此血液中腫瘤標志物的種類和含量對于腫瘤的早期篩查、診斷以及腫瘤的預后跟蹤監(jiān)測和復發(fā)轉移具有重要意義[2,13].

研究發(fā)現(xiàn)，HER2基因在15%～20%的乳腺癌細胞中過表達，而且HER2陽性乳腺癌患者惡性程度更高，預后更差[14].目前基于組織學方法的HER2檢測方法有IHC和FISH等，然而對于HER2陽性乳腺癌患者的病程和治療效果動態(tài)監(jiān)控亟需開發(fā)更為簡便的方法[7,15].研究人員對乳腺癌患者治療前后和不同分期的血清和組織樣本進行回顧性研究，發(fā)現(xiàn)早期乳腺癌患者血清HER2均為陰性，血清HER2升高或降低超過20%不僅與疾病進展有關，而且與治療效果有關[8,16].對不同分期原發(fā)性乳腺癌患者血清和組織樣本研究，發(fā)現(xiàn)血清HER2水平與腫瘤組織中HER2胞內段/胞外段高度一致，提示臨床上通過檢測腫瘤病人血清中的HER2蛋白水平作為腫瘤診斷以及治療方案制定的標準是具有科學依據(jù)的，其變化趨勢可作為腫瘤患者預后的評估指標[17-20].此外，檢測血清中HER2蛋白水平可以避免組織活檢對患者的傷害，同時對復發(fā)性或轉移性的腫瘤進行動態(tài)監(jiān)測以輔助判斷疾病進程或治療效果.

為了開展試劑的研發(fā)工作，本研究首先建立了HER2蛋白試劑盒的檢測方法.在生物素標記抗體的制備中，本課題組對所使用的抗體經(jīng)Protein A和Westorn blot方法進行了鑒定，并對檢測條件進行工藝篩選.此外，該試劑盒從檢測方法的建立到分析性能評估、等效性分析均符合國家藥監(jiān)局的要求，并參考了大量的CLSI文件.檢測結果顯示本試劑盒準確度、重復性良好，且在線性范圍0～300 ng/mL內，相關系數(shù)r均不低于0.990 0，線性范圍廣，靈敏度高，且與西門子公司生產(chǎn)的HER2檢測試劑盒檢測結果具有很好的一致性.表皮生長因子受體家族包括4個成員：HER1受體、HER2受體、HER3受體和HER4受體，為了評估該試劑盒的特異性，測定了與質量濃度最大為10 000 ng/mL的人表皮生長因子受體(EGFR或HER1)的交叉反應率，結果為0.05%，表明該試劑盒的特異性良好.

本研究開發(fā)的試劑盒采用目前市面上主流的磁微粒化學發(fā)光法，與進口廠家進行試劑一致性分析，均具有較好的相關性，且該試劑盒結合全自動化學發(fā)光分析儀，可實現(xiàn)樣本的隨到隨檢，可降低總的檢測成本.

綜合以上評估，本試劑盒具有檢測時間短、操作簡便、自動化程度高、重復性和準確度高、特異性好等特點，應用和推廣前景巨大，但尚需收集相關臨床數(shù)據(jù)以評估其臨床效能，為進一步優(yōu)化血清HER2蛋白檢測提供參考，為提升乳腺癌的診療效果提供技術支撐.