口腔扁平苔蘚（oral lichen planus，OLP）是口腔黏膜病?？浦凶畛Ｒ姷募膊≈?，最新研究表明整體發(fā)病率在0.89%左右

。目前OLP 發(fā)病機(jī)制尚不明確，普遍認(rèn)為OLP 是機(jī)體內(nèi)在與外在因素聯(lián)合作用引發(fā)的疾病。在一些外在因素（病原體、藥物、牙科材料等）作用下，易感人群口腔黏膜病損部位的上皮細(xì)胞與抗原呈遞細(xì)胞活化，這些細(xì)胞分泌多種炎癥因子與趨化因子，激活T 淋巴細(xì)胞，形成持續(xù)存在的免疫炎癥反應(yīng)

。在OLP 患者的唾液、組織及頰黏膜拭子中發(fā)現(xiàn)了菌群失調(diào)的現(xiàn)象

，菌群失調(diào)可能在OLP 發(fā)生發(fā)展過程中起到重要作用

。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，OLP 組頰黏膜表面微生物菌落結(jié)構(gòu)與健康對(duì)照組相比發(fā)生顯著性改變，其中產(chǎn)黑普氏菌（

，

.

）在OLP 組頰黏膜表面構(gòu)成比顯著增加，且該菌能夠侵入到OLP 病損組織上皮層及固有層，并與巨噬細(xì)胞相互作用，提示

.

可能在OLP 的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用

。而口腔黏膜上皮角質(zhì)形成細(xì)胞作為抵抗外界入侵的第一道屏障，

.

與口腔上皮角質(zhì)細(xì)胞的相互作用并不清楚。

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序是對(duì)特定細(xì)胞在某一功能狀態(tài)下所能轉(zhuǎn)錄出來(lái)的所有RNA 的總和進(jìn)行高通量測(cè)序。通過新一代高通量測(cè)序，能夠全面快速地獲得某一物種特定組織或器官在某一狀態(tài)下的幾乎所有轉(zhuǎn)錄本序列信息。目前，對(duì)OLP 轉(zhuǎn)錄組研究并不完善，多集中于OLP 的癌變傾向

、OLP 的炎癥反應(yīng)過程

等。有關(guān)口腔共生菌作用下，口腔上皮角質(zhì)形成細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的改變目前尚無(wú)研究。因此本研究利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，研究原代人口腔角質(zhì)形成細(xì)胞（primary human oral keratinocytes，pHOKs）在

.

刺激下基因表達(dá)的改變，對(duì)差異表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEGs）進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并篩選其中的差異基因進(jìn)行驗(yàn)證，為探究DEGs 所參與的通路與OLP 的相關(guān)性提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

分別計(jì)算(xp1,yp1)、(xp2,yp2) 、(xp3,yp3)、(xp4,yp4)的距離差值d,取d(i)的最小值對(duì)應(yīng)的坐標(biāo)作為改進(jìn)灰狼算法的初始值,i的取值為1～4。

1 材料和方法

1.1 主要材料和儀器

人口腔角質(zhì)形成細(xì)胞系（human oral keratino?cyte，HOK）由陳謙明教授惠贈(zèng)

。

ATCC

25845

（ATCC，美國(guó)），OKM 培養(yǎng)基（Sciencell，美國(guó)），PBS（上海生工，中國(guó)），dispase酶（Sigma，美國(guó)），DMEM 培養(yǎng)基（Hyclone，美國(guó)），胎牛血清（WISENT，美國(guó)），RNAiso Plus（TaKaRa，中國(guó)），無(wú)水乙醇（上海生工，中國(guó)），氯仿（國(guó)藥，中國(guó)），異丙醇（國(guó)藥，中國(guó)），PrimeScript

RT reagent?Kit Perfect Real Time（TaKaRa，中國(guó)），TB Green Pre?mix Ex Taq（TaKaRa，中國(guó)），BCA protein assay kit（Solarbio，中國(guó)），MYO1B 一抗（Santa Cruz，美國(guó)），β?Tubulin 一抗（Proteintech Biotechnology，中國(guó)），辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG（碧云天，中國(guó)），超敏ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒（碧云天，中國(guó)），實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（Thermo Fisher，美國(guó)），小型高速離心機(jī)（Eppendorf，美國(guó)），Bio?Rad 電泳系統(tǒng)（Bio?Rad，美國(guó)），多功能酶標(biāo)儀（Bio?Tek，美國(guó)）。

1.2 樣本的收集與處理

1.2.1 pHOKs 的分離與培養(yǎng) 本實(shí)驗(yàn)獲得同濟(jì)大學(xué)附屬口腔醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)（倫理審批號(hào)：2018?002）。組織來(lái)源于同濟(jì)大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔頜面外科智齒拔除術(shù)時(shí)取下的頰黏膜組織，把組織放到含10%雙抗PBS 中清洗三遍。隨后將組織放到0.25%中性蛋白酶（dispaseⅡ）中4 ℃過夜。第二天用無(wú)菌眼科鑷分離組織上皮，PBS 清洗2 次，0.25%含EDTA 的胰酶37 ℃震蕩消化4 min，用含10%FBS 的DMEM 培養(yǎng)基終止消化，離心，去上清，PBS 清洗沉淀2 次，用2 mL OKM 培養(yǎng)基重懸沉淀并鋪板于六孔板，培養(yǎng)于37 ℃、5%體積分?jǐn)?shù)CO

的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。

你說天底下竟有這么好玩的東西，無(wú)須自個(gè)兒露面（王爺小時(shí)候雖淘氣，人前卻是那樣的羞澀），只幕后把那些個(gè)花花綠綠的木偶肘在手上，張飛李逵關(guān)云長(zhǎng)，想怎樣就怎樣，稀里嘩啦猛打一氣，實(shí)在是太合小時(shí)候王爺那顆心了，恨不能直接跟著那戲班子就上臺(tái)去。

1.2.2 HOK 細(xì)胞培養(yǎng) HOK 細(xì)胞以5×10

個(gè)/mL 的細(xì)胞密度接種于12 孔板中，在添加了10%FBS 的DMEM 培養(yǎng)基中，37 ℃、5%體積分?jǐn)?shù)CO

的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待鏡下細(xì)胞密度達(dá)90%時(shí)用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.3

.

菌株培養(yǎng)與菌液制備 凍存于-80 ℃的

.

菌液于37 ℃化凍，均勻涂于基礎(chǔ)厭氧血平板，加厭氧袋置于密封袋，置于37 ℃孵箱復(fù)蘇；3 d 后挑取平板上黑褐色菌點(diǎn)于新鮮液體厭氧培養(yǎng)基中，蓋上并旋松管蓋，加厭氧袋置于密封袋中，置于37 ℃搖床。1 d 后測(cè)菌液OD

=1，以4 000 rpm離心3 min，棄上清，PBS 清洗3 次后，加1 mL PBS重懸菌液，最終菌液濃度為1×10

CFU/mL。

②菌液與HOK 細(xì)胞系共同培養(yǎng)：HOK 細(xì)胞吸去細(xì)胞上清液，PBS 輕柔洗滌細(xì)胞3 次，更換為不含F(xiàn)BS 的DMEM 培養(yǎng)基。

1.2.4 菌液與細(xì)胞共同培養(yǎng) ①菌液與pHOKs 共同培養(yǎng)：pHOKs 培養(yǎng)到第三代后用于實(shí)驗(yàn)，吸去細(xì)胞上清液，PBS 輕柔洗滌細(xì)胞3 次，更換為不含血清的DMEM 培養(yǎng)基，每孔加入10 μL 菌液，分別共培養(yǎng)4 h 和24 h 作為兩實(shí)驗(yàn)組，以未與菌液共培養(yǎng)的pHOKs 作為對(duì)照組，處理后的細(xì)胞于37 ℃、5%體積分?jǐn)?shù)CO

的細(xì)胞培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)相應(yīng)時(shí)長(zhǎng)，隨后提取細(xì)胞總RNA 用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

③對(duì)照組與共培養(yǎng)24 h 組之間得到的上調(diào)DEGs 富集于12 條KEGG 通路中，顯示其與白介素?17（interleukin?17，IL?17）信號(hào)通路、TNF 信號(hào)通路、金黃色葡萄球菌感染（

infec?tion）等相關(guān)（圖4b）。

1.3 CCK?8 法檢測(cè)細(xì)胞活性

通過CCK?8 法檢測(cè)

.

刺激后HOK 細(xì)胞的活性。HOK 細(xì)胞與

.

共培養(yǎng)。共培養(yǎng)完成后，輕柔吸去細(xì)胞上清液，PBS 輕柔洗滌細(xì)胞3 次，每孔加入100 μL DMEM 培養(yǎng)基和10 μL CCK?8 溶液，避光反應(yīng)1 h。隨后在酶標(biāo)儀450 nm 處測(cè)定細(xì)胞上清液吸光度，相對(duì)細(xì)胞活力計(jì)算方法：（實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞吸光度/對(duì)照組細(xì)胞吸光度）×100%。

在清華,校長(zhǎng)可以享有公車,但他寧愿步行；校長(zhǎng)出差按規(guī)定可以乘坐飛機(jī),但他卻寧愿搭乘郵車,其目的無(wú)非是要為公家省些錢?？箲?zhàn)時(shí)期,清華、北大、南開三校合并成立“西南聯(lián)大”遷往內(nèi)地。云南省主席龍?jiān)频呐畠糊垏?guó)碧想進(jìn)清華附中讀書,結(jié)果卻未能如愿。龍?jiān)菩睦锊凰?因?yàn)樗麑?duì)戰(zhàn)時(shí)的“西南聯(lián)大”多有資助。但后來(lái)當(dāng)他打聽到梅貽琦的女兒梅祖芬也未被錄取時(shí),他不但怨氣全消,還深懷敬意。有這樣的人去管理學(xué)校,還有什么不放心的呢。

1.4 總RNA 的提取

將樣本送至上海晶能生物科技有限公司完成轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?；境绦?yàn)椋篟NA 片段化，逆轉(zhuǎn)錄成雙鏈DNA，加工雙鏈DNA 末端，PCR 擴(kuò)增。PCR 產(chǎn)物熱變性形成單鏈，單鏈DNA 環(huán)化得到單鏈環(huán)狀DNA 文庫(kù)，DNA 文庫(kù)用Illumina Nova 6000 測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，獲得高質(zhì)量的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。

1.5 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

將共培養(yǎng)完成后的細(xì)胞吸去上清，PBS 輕柔洗滌3 次，按試劑盒說明提取總RNA。測(cè)定RNA濃度。

1.6 測(cè)序結(jié)果的分析

對(duì)數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估，對(duì)所獲得的序列進(jìn)行基因注釋，用HTSeq 軟件計(jì)算各個(gè)基因的reads count。使用R 語(yǔ)言limma 包進(jìn)行DEGs 挑選。取log2（差異倍數(shù)）≥1 且

≤0.05 的基因篩選為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的DEGs。通過R 軟件的Pheatmap 包對(duì)DEGs 進(jìn)行聚類分析，用GO 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)DEGs 進(jìn)行生物學(xué)功能注釋，用KEGG Pathway 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)DEGs 進(jìn)行通路的注釋。利用R 語(yǔ)言富集常用包c(diǎn)lusterProfiler（版本3.18.0）對(duì)DEGs 做GO、KEGG pathway 的注釋富集分析。對(duì)DEGs 數(shù)量≥2，且統(tǒng)計(jì)

≤0.05 的注釋條目認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.7 qRT?PCR 驗(yàn)證差異表達(dá)基因

監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)還顯示，9月WTI原油均價(jià)為69.35美元/桶，環(huán)比上漲1.0%，同比漲幅42.6%；布倫特原油均價(jià)77.23美元/桶，環(huán)比上漲6.8%，同比漲幅41.9%；迪拜原油均價(jià)75.86美元/桶，環(huán)比上漲5.5%，同比漲幅45.5%；勝利原油均價(jià)67.96美元/桶，環(huán)比上漲5.0%，同比漲幅39.4%。上述四地原油9月平均價(jià)格為72.60美元/桶，環(huán)比上漲4.6%，同比漲幅42.4%。

1.8 Western Blot 驗(yàn)證差異表達(dá)基因

使用含1 mmol/L PMSF 的RIPA 裂解液提取HOK 細(xì)胞總蛋白，BCA 試劑盒測(cè)蛋白濃度。7.5%的SDS?PAGE 凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，封閉液室溫下封閉1 h，一抗孵育，4 ℃過夜，洗膜后加二抗，室溫孵育1 h，增強(qiáng)型化學(xué)法顯色，Im?ageQuant LAS 4000 mini 顯影。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用GraphPadPrism 8.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析并繪制統(tǒng)計(jì)圖。多組數(shù)據(jù)間比較采用單因素方差分析（one?way analysis of variance，ANOVA），以Tukey 進(jìn)行兩兩比較，

＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2.4 疾病相關(guān)基因的高通量測(cè)序分析 將提取的患兒外周血全基因組DNA送至北京德易東方轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心進(jìn)行與腦發(fā)育異常相關(guān)的所有已知基因全外顯子及相應(yīng)剪切位點(diǎn)的高通量測(cè)序分析。

2 結(jié) 果

2.1 P.m 對(duì)HOK 細(xì)胞活力的影響

在倒置相差顯微鏡下可觀察到完整的HOK 單層細(xì)胞（圖1a），HOK 細(xì)胞與

.

共培養(yǎng)后，細(xì)胞密度降低，對(duì)培養(yǎng)皿底的黏附能力降低；部分細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，由原本大而扁平的多角形形態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楸鈭A形或圓形，部分細(xì)胞的細(xì)胞核發(fā)生了核固縮，顯示出空泡變性和細(xì)胞裂解，細(xì)胞邊界不清晰（圖1b，10 μL 菌液與HOK 細(xì)胞共培養(yǎng)8 h 后鏡下圖）。

對(duì)共培養(yǎng)后HOK 細(xì)胞的細(xì)胞活力檢測(cè)結(jié)果（圖1c、1d）表明，

.

會(huì)降低HOK 細(xì)胞活力，在時(shí)間梯度組中，共培養(yǎng)4 h后細(xì)胞活力降低到68.38%±12.30%（

＜0.001），共培養(yǎng)6 h 后細(xì)胞活力降低至38.97% ± 1.05%（

＜0.001），共培養(yǎng)8 h 后細(xì)胞活力降低至27.44% ± 0.30%（

＜0.001）；在濃度梯度組 中10 μL 組 細(xì) 胞 活 力 下 降 至60.33% ± 3.93%（

＜0.001），20 μL 組細(xì)胞活力下降至44.9% ±2.77%（

＜0.001），30 μL 組 細(xì) 胞 活 力 下 降 至29.02%±2.46%（

＜0.001）。

②加強(qiáng)示范區(qū)建設(shè)。借鑒歐盟經(jīng)驗(yàn)，對(duì)一些重大技術(shù)難題，如降雨——徑流分析、臨界預(yù)警指標(biāo)的確定方法、預(yù)警信息發(fā)布等，宜選擇具有不同自然地理特征的小流域，建立山洪災(zāi)害防治小流域示范區(qū)，開展專項(xiàng)研究，并作為一項(xiàng)長(zhǎng)期任務(wù)持續(xù)開展下去。通過不斷探索，提出上述重大技術(shù)難題的解決方案，完善后向全國(guó)推廣。

2.2 P.m 共培養(yǎng)后pHOK 細(xì)胞差異表達(dá)基因及聚類分析

聚類分析結(jié)果顯示，對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組的基因簇明顯分開，提示對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組間在整體基因表達(dá)上存在明顯差異（圖2a）。在本次測(cè)序所獲取的全部基因中，pHOK 與

.

共培養(yǎng)4 h 組與對(duì)照組間有1 788 個(gè)基因的表達(dá)存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，共培養(yǎng)24 h 組與對(duì)照組間有1 832 個(gè)基因的表達(dá)存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

無(wú)償獻(xiàn)血采血護(hù)理質(zhì)量關(guān)系到采血質(zhì)量以及獻(xiàn)血者的健康安全,需要引起足夠的重視,對(duì)于干擾和妨礙采供血的風(fēng)險(xiǎn)因素,應(yīng)采取有效的護(hù)理干預(yù)和風(fēng)險(xiǎn)控措施,進(jìn)而提高采供血質(zhì)量,為臨床醫(yī)療應(yīng)用提供支持。因此,在無(wú)償獻(xiàn)血采血護(hù)理工作當(dāng)中,應(yīng)著重加強(qiáng)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和控制。深入到采血過程的各個(gè)步驟、環(huán)節(jié)進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估,從中發(fā)現(xiàn)安全隱患[2]。

②對(duì)照組與共培養(yǎng)4 h 組之間得到的下調(diào)DEGs 富集于19 個(gè)生物過程條目中，如上皮發(fā)育（epidemis development）、皮 膚 發(fā) 育（skin develop?ment）、上皮細(xì)胞分化調(diào)節(jié)（regulation of epithelial cell differentiation）等；富集于1 個(gè)細(xì)胞成份條目中，即角質(zhì)化包膜（cornified envelope）（圖3b）。

2.3 P.m 共培養(yǎng)后pHOK 細(xì)胞差異表達(dá)基因GO 富集分析

對(duì)各組上調(diào)的DEGs 和下調(diào)的DEGs 進(jìn)行GO富集分析結(jié)果顯示：①對(duì)照組與共培養(yǎng)4 h 組之間得到的上調(diào)DEGs 富集于604 個(gè)生物過程（biologi?cal process，BP）條目中，如細(xì)胞對(duì)脂多糖的反應(yīng)（cellular response to lipopolysaccharide）、對(duì)細(xì)菌來(lái)源分子的反應(yīng)（response to molecule of bacterial ori?gin）、生物刺激的細(xì)胞反應(yīng)（cellular response to biot?ic stimulus）等；富集于12 個(gè)細(xì)胞成分（cellular com?ponent，CC）條目中，如細(xì)胞頂端部分（apical part of cell）、收縮纖維（contractile fiber）、肌節(jié)（sarcomere）等；富集于18 個(gè)分子功能（molecular function，MF）條目中，如細(xì)胞因子活性（cytokine activity）、受體配體活性（receptor ligand activity）、信號(hào)受體激活因子活性（signaling receptor activator activity）等（圖3a）。

逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再以實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。以GAPDH為內(nèi)參。肌球蛋白1B（myosin1B，MYO1B）正義鏈：5’?GGAGACCATGGCCA AAATGG?3’，MYO1B 反義鏈：5’?GGTCAAAGCGCT TCTTGAGG?3’；GAPDH正義鏈：5’?GGACCTGACC TGCCGTCTAG?3’，GAP?DH 反義鏈：5’?GTAGCCCA GGATGCCCTTGA?3’。

pHOK 與

.

共培養(yǎng)4 h 組相較對(duì)照組中表達(dá)上調(diào)基因?yàn)?77 個(gè)，表達(dá)下調(diào)基因?yàn)?16 個(gè)；共培養(yǎng)24 h 組相較對(duì)照組中表達(dá)上調(diào)基因?yàn)? 012 個(gè)，表達(dá)下調(diào)基因?yàn)?28 個(gè)，兩處理組與對(duì)照組間有1 090 個(gè)共同差異表達(dá)基因（common differentially expressed genes，cDEGs）（圖2b～2d，表1）。

③對(duì)照組與共培養(yǎng)24 h 組之間得到的上調(diào)DEGs 富集的GO 通路與4 h 組在分子功能富集條目相似度高（圖3c）。

④對(duì)照組與共培養(yǎng)24 h 組之間得到的下調(diào)DEGs 富集于84 個(gè)生物過程條目中，如化學(xué)突觸傳遞的調(diào)節(jié)（modulation of chemical synaptic transmis?sion）、跨突觸信號(hào)的調(diào)節(jié)（regulation of trans?synap?tic signaling）、神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)（neurotransmitter trans?port）等；富集于21 個(gè)細(xì)胞成份條目中，如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔（endoplasmic reticulum lumen）、神經(jīng)元與神經(jīng)元突觸（neuron to neuron synapse）、突觸后密集區(qū)（post?synaptic density）等；在MF 條目中沒有具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的富集（圖3d）。

2.4 P.m 共培養(yǎng)后pHOK 細(xì)胞差異表達(dá)基因KEGG通路富集分析

①對(duì)照組與共培養(yǎng)4 h 組之間得到的上調(diào)DEGs 富集于33 條KEGG 通路中，顯示其與細(xì)胞因子與細(xì)胞因子受體相互作用（cytokine?cytokine re?ceptor interaction）、病毒蛋白與細(xì)胞因子和細(xì)胞因子受體相互作用（viral protein interaction with cyto?kine and cytokine receptor）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）信號(hào)通路等相關(guān)（圖4a）。

②對(duì)照組與共培養(yǎng)4 h 組之間得到的下調(diào)DEGs 在KEGG 通路數(shù)據(jù)庫(kù)中沒有得到具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的富集條目。

7 投稿方式 投稿請(qǐng)發(fā)電子郵件(郵件主題寫第一作者姓名和文題)，本刊E-mail：zacaoxuebao@163.com或zckx@jaas.ac.cn。審稿時(shí)間一般為20天左右，特別優(yōu)秀的稿件可加快處理。錄用通知將通過電子郵件通知作者，投稿后請(qǐng)注意查看E-mail。

為分別探究

.

對(duì)HOK 細(xì)胞系在時(shí)間梯度和濃度梯度共培養(yǎng)后造成的影響，設(shè)置時(shí)間梯度共培養(yǎng)組和濃度梯度共培養(yǎng)組，以未與菌液共培養(yǎng)的HOK 細(xì)胞作為對(duì)照組。時(shí)間梯度組每孔加入10 μL 菌液，各組共培養(yǎng)體系最終菌液濃度為5 ×10

CFU/mL，分別培養(yǎng)4 h、6 h、8 h；濃度梯度組每孔分別加入10 μL、20 μL、30 μL 菌液，各實(shí)驗(yàn)組體系中最終菌液濃度分別為：5×10

CFU/mL、10×10

CFU/mL、15×10

CFU/mL，共 培 養(yǎng)4 h。 用DMEM 培養(yǎng)基補(bǔ)足液體量，對(duì)照組只添加基礎(chǔ)DMEM 培養(yǎng)基，使各組共培養(yǎng)體系最終液體的量相同，總體積2 mL，以便計(jì)算菌液濃度。將處理后的細(xì)胞在37 ℃、5%CO

的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隨后吸去上清，PBS 輕柔洗細(xì)胞3 次，待后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

④對(duì)照組與共培養(yǎng)24 h 組之間得到的下調(diào)DEGs 在KEGG 通路數(shù)據(jù)庫(kù)中沒有得到具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的富集條目。

2007年，醫(yī)院將建于1892年的巴洛克式建筑舊址改造為醫(yī)院歷史紀(jì)念館，成為醫(yī)院文化的匯聚地，后被定為省市愛國(guó)主義教育基地、對(duì)外文化交流基地。

2.5 差異表達(dá)基因肌球蛋白1B 的驗(yàn)證

在本次轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果中，MYO1B 是共培養(yǎng)4 h 組、共培養(yǎng)24 h 組共有的DEG。

將相同濃度（5×10

CFU/mL）的

.

與HOK 細(xì)胞共培養(yǎng)不同時(shí)長(zhǎng)（0、4 h、6 h、8 h），MYO1B 的mRNA 表達(dá)和蛋白表達(dá)在4、6、8 h 均顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

＜0.005）。

將不同濃度的

.

（10 μL 組、20 μL 組、30 μL組最終菌液濃度分別為：5×10

CFU/mL、10×10

CFU/mL、15×10

CFU/mL）刺激HOK 細(xì)胞4 h 后MYO1B 的表達(dá)均顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

＜0.005）（圖5）。

3 討 論

細(xì)菌微生物的菌群失調(diào)可能是OLP 發(fā)生發(fā)展的原因之一。本課題組前期發(fā)現(xiàn)

.

在OLP 患者頰黏膜表面構(gòu)成比增加最為顯著，而口腔上皮角質(zhì)形成細(xì)胞作為口腔黏膜抵御外界入侵的第一道防線，可能直接受

.

刺激影響。在與

.

共培養(yǎng)后，HOK 細(xì)胞在鏡下可保持完整的細(xì)胞形態(tài)并形成完整的單層細(xì)胞，

.

的刺激會(huì)降低HOK 細(xì)胞的活力，對(duì)HOK 細(xì)胞造成損傷；在對(duì)OLP 患者的口腔角質(zhì)形成細(xì)胞進(jìn)行體外分離培養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn)較正常人群相比，OLP 患者的口腔角質(zhì)形成細(xì)胞的細(xì)胞活力明顯降低，細(xì)胞形態(tài)也發(fā)生明顯變化

，本課題組建立的

.

?HOK 細(xì)胞共培養(yǎng)模型與之相似，推測(cè)

.

損傷HOK 細(xì)胞可能與OLP 臨床中發(fā)生上皮層糜爛和潰瘍有關(guān)。

玉米膜下滴灌高產(chǎn)栽培技術(shù)是覆蓋、灌溉、高產(chǎn)技術(shù)相結(jié)合的綜合技術(shù)。為了合理實(shí)施該技術(shù)，需要在種植初期進(jìn)行一系列的前期準(zhǔn)備工作，在正式實(shí)施中，中后期滴灌管網(wǎng)的布設(shè)和田間管理尤為重要，加強(qiáng)灌區(qū)灌溉管理。積極開展化肥和施肥管理，從多個(gè)方面進(jìn)行病蟲害防治，提高玉米產(chǎn)量。

目前認(rèn)為免疫失調(diào)在OLP 發(fā)病過程中起到重要作用

，多個(gè)學(xué)者報(bào)道的OLP 組織高通量測(cè)序結(jié) 果

顯 示 其 多 富 集 在 與 免 疫 相 關(guān) 的GO 與KEGG 通路如趨化因子活躍、細(xì)胞因子活躍和原發(fā)性免疫缺陷等免疫炎癥相關(guān)通路，以及與上皮發(fā)育分化、神經(jīng)受體配體作用和代謝相關(guān)的通路如表皮分化復(fù)合體

、激活神經(jīng)元的受體配體交互和酪氨酸代謝

等。有文獻(xiàn)報(bào)道OLP 組織中Toll樣受體?4（toll like receptor?4，TLR?4）的明顯高表達(dá)

，且存在多種細(xì)胞因子表達(dá)改變，如腫瘤壞死因 子α（tumor necrosis factor?α，TNF?α）表 達(dá) 升高

，白介素?23（interleukin?23，IL?23）和IL?17 過表達(dá)等

。為探究

.

對(duì)pHOK 短時(shí)間作用及較長(zhǎng)時(shí)間作用的影響，并探究

.

刺激與OLP 發(fā)生發(fā)展之間的關(guān)聯(lián)，本研究進(jìn)一步將

.

與pHOK 共培養(yǎng)后4 h和24 h進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，研究結(jié)果顯示，

.

刺激pHOK 細(xì)胞后，炎癥相關(guān)通路如IL?17 信號(hào)通路、腫瘤壞死因子信號(hào)通路、Toll 樣受體通路、細(xì)胞因子與細(xì)胞因子受體互作等在兩處理組中均明顯富集，其他KEGG 通路如上皮發(fā)育、跨突觸信號(hào)調(diào)節(jié)等也有較明顯富集，而這些通路與既往報(bào)道的OLP 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的富集通路有明顯重合。

本 研 究 結(jié) 果 顯 示，

.

與pHOK 共 培 養(yǎng)4 h 組GO 通路明顯富集在細(xì)胞頂端部分（apical part of cell）和頂端質(zhì)膜（apical plasma membrane）這兩個(gè)細(xì)胞成分中。單個(gè)上皮細(xì)胞之間的空間密封由頂端連接復(fù)合物（apical junctional complex）執(zhí)行，其包含緊密連接、黏附連接和橋粒

。細(xì)胞黏附建立后，緊密連接通過其蛋白質(zhì)組分將空間密封起來(lái)

。本課題組推測(cè)，在

.

刺激pHOK 細(xì)胞早期，pHOK 細(xì)胞的細(xì)胞頂端部分和頂端質(zhì)膜的頂端連接復(fù)合物成分合成加強(qiáng)，以增強(qiáng)細(xì)胞間緊密連接，抵抗外界細(xì)菌侵入。

本研究結(jié)果顯示，MYO1B 是pHOK 與

.

共培養(yǎng)4 h、24 h 組均上調(diào)表達(dá)的差異基因。MYO1B 即肌球蛋白1B，肌球蛋白是一種以ATP 調(diào)節(jié)的方式結(jié)合到肌動(dòng)蛋白的蛋白質(zhì)，與肌動(dòng)蛋白的結(jié)合促進(jìn)肌球蛋白水解ATP，從而為肌動(dòng)蛋白絲的運(yùn)動(dòng)提供動(dòng)力

。肌動(dòng)?肌球蛋白的收縮是細(xì)胞骨架改變的形式之一，肌動(dòng)蛋白?肌球蛋白環(huán)也是組成細(xì)胞緊密連接的重要部分，肌動(dòng)蛋白?肌球蛋白環(huán)在維持上皮極性和上皮屏障功能中發(fā)揮了重要作用

。Lv 等

報(bào)道，肌球蛋白ⅡA（myosin?ⅡA）調(diào)控缺氧低糖腦內(nèi)皮細(xì)胞的緊密連接，抑制肌球蛋白ⅡA 可減弱claudin?5 和ZO?1 等緊密連接蛋白的形態(tài)變化；Omelchenko 等

報(bào)道，在整體遷移的細(xì)胞中，肌球蛋白ⅨA（myosin?ⅨA）的敲除導(dǎo)致肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的改變，細(xì)胞?細(xì)胞間黏附被破壞，導(dǎo)致細(xì)胞分散。以上這些實(shí)驗(yàn)表明，肌球蛋白家族通過細(xì)胞骨架與緊密連接調(diào)節(jié)了上皮細(xì)胞屏障。本研究結(jié)果顯示，

.

濃度梯度對(duì)MYO1B 表達(dá)的影響更為明顯，提示菌群數(shù)量的失衡對(duì)緊密連接有較大影響。這與本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)在OLP患者頰黏膜表面菌群失調(diào)相印證。此外，文獻(xiàn)報(bào)道MYO1B 參與了舌部鱗狀細(xì)胞癌等多種腫瘤的發(fā)展與轉(zhuǎn)移，且預(yù)示了較差的預(yù)后以及隱匿性淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移

。提示MYO1B 可能參與了OLP 惡變。

綜上，本研究對(duì)與

.

共培養(yǎng)4 h 和24 h 的pHOK 細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，研究發(fā)現(xiàn)

.

和pHOK 共培養(yǎng)過程中IL?17 信號(hào)通路、腫瘤壞死因子信號(hào)通路、Toll 樣受體通路等KEGG 通路明顯富集，對(duì)脂多糖的反應(yīng)、對(duì)細(xì)菌來(lái)源分子的反應(yīng)、細(xì)胞頂端部分等GO 通路明顯富集，提示

.

對(duì)口腔角質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組存在重要影響，其中MYO1B 可能在細(xì)菌?細(xì)胞相互作用中發(fā)揮了重要作用。本研究為進(jìn)一步揭示OLP 的發(fā)病機(jī)制提供了相關(guān)的研究基礎(chǔ)。

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