婆婆聽了我的想法，考慮了一個晚上，最后鄭重地告訴我：“孩子，我尊重你的選擇，明天我們就去醫(yī)院檢查，如果沒什么問題，你就去外地，我跟你去，陪在你身邊照顧你！”

1 材料和方法

1.1 主要材料和試劑

胎牛血清（Gibco，美國）；α?MEM 完全培養(yǎng)液（Gibco，美國）；1%青鏈霉素雙抗（Gibco，美國）；嘌呤霉素（Biofroxx，德國）；含EDTA 的胰酶消化液（Millipore，美國）；HB?infusion TM 試劑盒（Thermo，美國）；載體質(zhì)粒（Promega，美國）；引物序列（Invit?rogen，美國）；Trizol（Invitrogen，美國）；RIPA 裂解液（Millipore，美國）；流式細(xì)胞儀（FACS Canto Ⅱ，BD，美國）；實(shí)時熒光定量PCR 儀（Prism

7500，ABI，美國）；高速冷凍離心機(jī)（CF1524R，Scilogex，美國）；凝膠成像儀（GelDoc MP，Bio?Rad，美國）。CCK?8 試劑盒（Biolite，中國）；β?半乳糖苷酶試劑盒（Biovision，美國）；CD29、CD34 抗體（Abcam，英國）。

(3) 工程處治方案。清除坡面浮石、危巖，在貫通性張拉裂縫后部設(shè)置被動網(wǎng)，對崖頂后部緩坡地段的小型落石進(jìn)行攔截；對崖頂傾倒體采用掛網(wǎng)噴混凝土和設(shè)置墊墩錨索進(jìn)行預(yù)加固，防止傾倒體在風(fēng)化和卸荷作用下穩(wěn)定性進(jìn)一步降低；在陡崖頂部錨固工程上部設(shè)置張口式導(dǎo)石網(wǎng)，對陡崖上部和陡崖坡面上分布的零星危巖進(jìn)行防護(hù)；在坡腳橋墩部位設(shè)置攔石墻，利用廢棄的G317國道形成落石槽，防止落石在坡腳直接沖擊橋墩，并作為導(dǎo)石網(wǎng)攔截落石的停積場地。

書中指出，雖然和西方相比，中國語言哲學(xué)對概念的重視是滯后的，然而，言、象、意作為中國古典哲學(xué)和詩學(xué)的核心范疇，其關(guān)系定位代表了中國古代的語言哲學(xué)和詩學(xué)理念。作者指出，當(dāng)中國古典詩歌被翻譯為具有很強(qiáng)名思維特征的英語時，如何處理言象意的關(guān)系十分關(guān)鍵。譯者必然會在翻譯中體現(xiàn)出象表述取向或者言表述取向。作者以葉維廉的詩歌“模子論”具體說明了譯者對中西詩歌之間異質(zhì)性特征的體認(rèn)，以及在目的語中的有效傳達(dá)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定

加入PBS 清洗，1 000 rpm 離心3 min，去上清，重復(fù)3 次后，加入5 μL CD29、CD34 抗體和100 μL PBS，室溫避光孵育30 min，補(bǔ)液至1 000 μL，流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.2 BMMSCs 表面標(biāo)志物鑒定 取P3 代細(xì)胞，PBS 沖洗3 次，加入0.25%胰酶消化。待顯微鏡下觀察到細(xì)胞懸浮變圓后，終止消化并適當(dāng)吹勻，轉(zhuǎn)移至干凈培養(yǎng)基中，1 000 rpm 離心5 min，棄去上清。

1.2.1 BMMSCs 原代細(xì)胞提取及傳代 本實(shí)驗(yàn)已取得四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（審批號：WCHSIRB?D?2018?024）。選取1月齡C57BL/6雄性小鼠，購于四川大學(xué)華西實(shí)驗(yàn)動物中心（合格證號：SCXK（川）2009?009），斷頸處死后置于75%酒精中浸泡3～5 min，取出后分離皮毛，小心剝離股骨及脛骨的肌肉組織，置于磷酸緩沖液（phos?phate buffer saline，PBS）中洗凈。去除骨骺兩端使其露紅，用1 mL 注射器吸取少量完全培養(yǎng)基，從一端輕柔沖洗骨髓腔，至骨頭呈半透明狀。使用0.22 μm 濾器過濾沖洗液，置于15 mL 離心管中，1 000 rpm 離心5 min，棄上清，加入5 mL 完全培養(yǎng)基重懸。置于培養(yǎng)箱（37 ℃，5% CO

）中培養(yǎng)，24 h后進(jìn)行半換液，48 h 后全換液，此后2～3 d 換液1 次。倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞融合率達(dá)到80%～90%時，用0.25%的胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代，取第3 代細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 miR?155?5p 及Bmal1 過表達(dá)/干擾的BMMSCs穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的構(gòu)建及驗(yàn)證

一個月后，秀容月明投軍去了。他上了戰(zhàn)場，腦子里從沒有“怕”字，拿起筆，家書、文書、奏章，什么都能寫，還能給長官出謀劃策，有了功勞，也不自居。十五年間，他先從步兵做起，然后是小隊(duì)長、統(tǒng)領(lǐng)、統(tǒng)制、招討使，直至樞密副使，戰(zhàn)功赫赫，威震天下，百姓提起他，都叫他秀容元帥。

1.4 miR?155?5p 及Bmal1 過表達(dá)/干擾對BMMSCs增殖的影響

1.4.1 分組 共6組，①BMMSCs空白對照組（NC）；②轉(zhuǎn)染空病毒組（Vector）；③miR?155?5p 過表達(dá)組［miR?155?5p（+）］；④miR?155?5p 干擾組［miR?155?5p（?）］；⑤Bmal1 過表達(dá)組［Bmal1（+）］；⑥Bmal1 干擾組［Bmal1（?）］。

2.3.4 衰老相關(guān)基因P53、P16 的表達(dá) 正常培養(yǎng)與空病毒轉(zhuǎn)染后的BMMSCs，P16、P53 mRNA 的表達(dá)基本一致，病毒轉(zhuǎn)染對目標(biāo)基因的表達(dá)無影響。miR?155?5p 過表達(dá)后，BMMSCs 中P16、P53 mRNA 表達(dá)均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

＜0.01）；干擾miR?155?5p 的表達(dá)，P53、P16 mRNA 表達(dá)均顯著降低。

（1）淬火能否正常落入水槽問題 根據(jù)淬火設(shè)備的優(yōu)缺點(diǎn)，最終選用2#立噴淬火。在試吊期間，發(fā)現(xiàn)南立噴外環(huán)有5個外環(huán)管（4#、8#、9#、10#、19#）開度不夠大，阻礙管板落入。針對以上問題，制造廠會同維修人員一起研究問題解決方案，經(jīng)過1天時間，維修人員順利對5根外環(huán)管全部矯直，矯直后再次進(jìn)行試吊，管板可正常落入水槽（見圖3）。

取生長狀態(tài)良好的P3 代細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞融合度為40%～50%時進(jìn)行慢病毒轉(zhuǎn)染，miR?155?5p 過表達(dá)和干擾慢病毒的靶序列分別為5’?CGATACAC?GAAGATTAGCATGGC ? 3’，5’? AACGCTTCAC?GAATTTGCGT?3’；Bmal1 過表達(dá)慢病毒和Bmal1 干擾慢病毒的靶序列分別為5’?GAGCAGTAATTC?TAGGCGATCGCTCGAG?3’，5’?AGCGGCCGCTCCG?CAATTAGCG?3’（漢恒，中國）。12 h 后更換為新鮮的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，48 h 后加入1 μg/mL 嘌呤霉素（Biofroxx，德國）篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，并進(jìn)行傳代。qRT?PCR 檢測miR?155?5p 及Bmal1 的表達(dá)以驗(yàn)證慢病毒轉(zhuǎn)染的效果。用PBS 沖洗細(xì)胞2～3 次，每孔細(xì)胞加入500 μL Trizol 裂解液，分離提取RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，用qRT?PCR 儀檢測miR?155?5p 及Bmal1 基因的表達(dá)，引物序列見表1。

1.4.4 β?半乳糖苷酶實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞培養(yǎng)72 h 后分組制備細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)后，以1×10

個/孔接種至6 孔板，去除細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS 洗滌后，每孔加入1 mL染色固定液，室溫下固定15 min。去除固定液，PBS 洗滌細(xì)胞3 次，每次3 min。去除PBS，每孔加入1 mL 染色工作液，用封口膜封住6 孔板，37 ℃孵育過夜。去除工作液，加入2 mL PBS 重懸，倒置顯微鏡下觀察。

1.4.5 qRT?PCR 檢測衰老相關(guān)基因的表達(dá) 細(xì)胞培養(yǎng)72 h后分組制備細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)后，以1×10

個/孔接種于12 孔板，加入PBS 洗滌2～3 次，每孔加入500 μL Trizol 裂解液，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cD?NA，使用qRT?PCR 儀檢測P16、P53 基因的表達(dá)，引物序列見表1。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

軟件應(yīng)用采用結(jié)合我們院咨詢項(xiàng)目和用戶應(yīng)用相結(jié)合的方法，典型工程包括武漢國際博覽中心會議中心綠建咨詢項(xiàng)目，上海虹橋商務(wù)區(qū)核心區(qū)一期綠建咨詢項(xiàng)目，揚(yáng)中園博園三館建筑設(shè)計(jì)和能效評價項(xiàng)目，無錫太湖國際博覽中心大酒店能效測評項(xiàng)目，徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病房樓能效測評項(xiàng)目，武進(jìn)影藝宮能效測評項(xiàng)目等。

2 結(jié) 果

2.1 BMMSCs 的培養(yǎng)和鑒定

P0 細(xì)胞培養(yǎng)12 h 后，鏡下可見部分貼壁，但大多為圓形，2 d 后呈現(xiàn)多形性，有圓形、紡錘形及不規(guī)則形態(tài)（圖1a）。5 d 后融合率達(dá)80%～90%，呈現(xiàn)較均一的梭形（圖1b）。傳代后，30 min 即可見P1 代細(xì)胞貼壁，2 d 后融合80%～90%，呈梭形（圖1c）。P3 代細(xì)胞中大多數(shù)造血干細(xì)胞已除盡，細(xì)胞呈漩渦狀生長（圖1d），胞體折光性較好，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

BMMSCs 表面標(biāo)志物CD29 陽性率93.08%、CD34 陽性率2.49%（圖1e、1f），分離培養(yǎng)的細(xì)胞來源于間充質(zhì)干細(xì)胞，而非造血干細(xì)胞來源。

2.2 miR?155?5p 及Bmal1 過表達(dá)/干擾的BMMSCs穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的構(gòu)建及驗(yàn)證

熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染后各組ZsGreen 綠色熒光表達(dá)情況，miR?155?5p 過表達(dá)/干擾組、Bmal1過表達(dá)/干擾組中，成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，可觀察到綠色熒光（圖2a），而轉(zhuǎn)染空病毒組和空白對照組未轉(zhuǎn)染病毒，鏡下無法觀察到綠色熒光。

qRT?PCR 檢測轉(zhuǎn)染后miR?155?5p 及Bmal1 的表達(dá)變化，與轉(zhuǎn)染空病毒組和空白對照組相比，miR?155?5p 及Bmal1 過表達(dá)組相應(yīng)基因mRNA 的相對拷貝數(shù)明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

＜0.01），miR?155?5p 及Bmal1 干擾組相應(yīng)基因mRNA的相對拷貝數(shù)明顯降低（圖2b），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

＜0.01）。上述結(jié)果表明慢病毒感染有效，穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系構(gòu)建成功。

銷售成本(主營業(yè)務(wù)成本)是利潤表中影響利潤總額的一項(xiàng)重要指標(biāo)。由于發(fā)出存貨計(jì)價方法的選擇，最終要轉(zhuǎn)入主營業(yè)務(wù)成本并直接影響當(dāng)期損益。

2.3 miR?155?5p 及Bmal1 過表達(dá)/干擾對BMMSCs增殖及衰老的影響

2.3.1 BMMSCs 增殖活性檢測結(jié)果 CCK?8 結(jié)果顯示，空病毒轉(zhuǎn)染的BMMSCs 與正常培養(yǎng)的BMMSCs，細(xì)胞增殖活性無明顯差異，可以證明慢病毒轉(zhuǎn)染本身對細(xì)胞增殖活性沒有影響。miR?155?5p 過表達(dá)的BMMSCs，增殖能力被抑制，增殖活性降低。相反，干擾miR?155?5p 的表達(dá)，細(xì)胞增殖活性明顯增強(qiáng)。Bmal1 過表達(dá)的BMMSCs，增殖能力顯著增強(qiáng)，干擾正常BMMSCs 中Bmal1 的表達(dá)，增殖活性降低（圖3）。

1.4.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 細(xì)胞培養(yǎng)72 h后分組制備細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，約1×10

個/mL。1 000 rpm 離心5 min 后，棄去培養(yǎng)液。用PBS 洗滌，1 000 rpm 離心5 min，棄去上清，加入70%乙醇，于4 ℃下固定2 h，離心棄去固定液，加入3 mL PBS 重懸5 min。使用400 目篩網(wǎng)過濾后，1 000 rpm離心5 min，去上清。用1 mL PI 染液染色，4 ℃避光30 min，上機(jī)檢測。

2.3.2 凋亡率 miR?155?5p 過表達(dá)的BMMSCs，細(xì)胞早期凋亡率為11.69%，相比空病毒轉(zhuǎn)染的BMMSCs 的凋亡率3.15%，明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

＜0.01）。干擾miR?155?5p 的表達(dá)，可以減少細(xì)胞的早期凋亡，BMMSCs 凋亡率為2.05%，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。過表達(dá)Bmal1的BMMSCs，早期凋亡率顯著降低，約為0.97%，而Bmal1 表達(dá)受到干擾的細(xì)胞，早期凋亡現(xiàn)象明顯，凋亡率15.28%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖4）。

2.3.3 β?半乳糖苷酶活性檢測結(jié)果 β?半乳糖苷酶在衰老細(xì)胞中活性顯著增加。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過表達(dá)miR?155?5p 后，衰老細(xì)胞增多，β?半乳糖苷酶顯色反應(yīng)明顯，干擾miR?155?5p 表達(dá)后，衰老相關(guān)的β?半乳糖苷酶活性降低。

過表達(dá)Bmal1 后，BMMSCs 中β?半乳糖苷酶活性降低，反之，干擾Bmal1 表達(dá)，BMMSCs 衰老特征顯著，β?半乳糖苷酶活性增加（圖5）。

1.4.2 CCK?8 檢測細(xì)胞增殖活性 分組制備細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)后，細(xì)胞以1×10

個/孔接種至96 孔板，培養(yǎng)2～4 h（37 ℃，5%體積分?jǐn)?shù)CO

）后，每孔加入10 μL CCK?8，輕敲培養(yǎng)板輔助混勻，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，測定450 nm 吸光度。

Bmal1 的效應(yīng)與miR?155?5p 相反，即過表達(dá)Bmal1 后，衰老相關(guān)基因的表達(dá)被抑制，P16、P53 mRNA 表達(dá)水平降低；干擾Bmal1 的表達(dá)，P16、P53 mRNA 表達(dá)水平明顯升高（圖6）。

3 討 論

提取小鼠BMMSCs 的方法有密度梯度離心法、全骨髓貼壁法、流式細(xì)胞儀法

。本實(shí)驗(yàn)采用全骨髓貼壁法，此法簡單且對細(xì)胞損傷小，但早期提取的細(xì)胞中多有雜細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，換液并傳代至第三代后，BMMSCs 純度較高（＞90%），可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，與其他BMMSCs 的相關(guān)研究結(jié)果基本一致

。BMMSCs 表面可表達(dá)生長因子、細(xì)胞因子及黏附因子受體，包括CD29、CD44、Sca?1 等，而不表達(dá)造血細(xì)胞的表面標(biāo)志物，如CD34、CD14等

。為了排除細(xì)胞中過多的雜細(xì)胞對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，使用流式細(xì)胞儀對CD29 及CD34 進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示培養(yǎng)的P3 代細(xì)胞為高純度的BMMSCs。

本課題組前期研究表明，Bmal1 在小鼠BMMSCs 中受到miR?155?5p 的負(fù)向調(diào)控，生物信息學(xué)網(wǎng)站的初步預(yù)測以及雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)均驗(yàn)證了miR?155?5p 與Bmal1 的靶向關(guān)系

。為了進(jìn)一步探索二者對BMMSCs 增殖、衰老和凋亡的影響，構(gòu)建了miR?155?5p 及Bmal1 過表達(dá)/干擾的慢病毒，對BMMSCs 進(jìn)行轉(zhuǎn)染并用1 μg/ mL 嘌呤霉素篩選出了穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。

miR?155 宿主基因位于B 細(xì)胞整合簇（B?cell integration cluster，BIC）基因的外顯子部分

，miR?155?5p 由其編碼產(chǎn)生，在腫瘤形成、炎癥發(fā)展、機(jī)體免疫等方面發(fā)揮重要作用

。研究表明，miR?155?5p 參與調(diào)控了細(xì)胞的成骨和破骨

。

哺乳動物近日鐘基因的核心組成包括Bmal1（brain and muscle arnt?like 1）、Per（period）、Clock（circadian locomotor output cycles kaput）、Cry（cryp?tochrome）以及維甲酸受體相關(guān)孤兒受體α（reti?noid acid receptor related orphan receptor α，Rorα）和核受體Rev?erbα

，以上近日鐘基因可以通過振蕩器系統(tǒng)形成自我調(diào)節(jié)的負(fù)反饋網(wǎng)絡(luò)來調(diào)控生物節(jié)律，而生物節(jié)律的紊亂不可避免地會導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)衰老情況。輪班工作、睡眠不足和禁食都可能導(dǎo)致近日節(jié)律紊亂，繼而導(dǎo)致骨改建失調(diào)，如連續(xù)24 周暴露在光照中的小鼠會出現(xiàn)早期骨質(zhì)疏松的特征

。骨的增齡性改變源于BMMSCs 增殖能力和成骨分化能力的下降，并伴隨成脂向分化的增加。不僅如此，多種骨、牙周重塑相關(guān)基因和骨代謝標(biāo)志物受到近日節(jié)律的影響，呈節(jié)律性表達(dá)

。研究發(fā)現(xiàn)，哺乳動物核心近日鐘基因Bmal1和Per2 參與BMMSCs 成骨分化能力和增殖能力的調(diào)控。本課題組的前期研究初步揭示了Bmal1 與骨衰老表型的關(guān)系，并且發(fā)現(xiàn)miR?155?5p 在衰老小鼠中可能參與了Bmal1 的負(fù)向調(diào)控

。然而miR?155?5p 對BMMSCs 增殖能力的影響，以及在衰老改變中扮演的角色，至今尚無文獻(xiàn)報道。

CCK?8 實(shí)驗(yàn)表明，miR?155?5p 過表達(dá)的BMMSCs 細(xì)胞增殖及代謝能力受到抑制，活性降低。相反，干擾miR?155?5p 的表達(dá)，細(xì)胞增殖活性明顯增強(qiáng)。Bmal1 過表達(dá)的BMMSCs，增殖能力顯著增強(qiáng)，干擾BMMSCs 中Bmal1 的表達(dá)，其增殖活性降低。流式凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過表達(dá)miR?155?5p 的BMMSCs，測得的凋亡率遠(yuǎn)高于正常培養(yǎng)的細(xì)胞，而過表達(dá)Bmal1 的BMMSCs，凋亡率顯著降低，說明二者在影響B(tài)MMSCs 增殖、凋亡過程中的調(diào)控效應(yīng)相反。研究顯示，Bmal1 敲除的小鼠會出現(xiàn)早衰現(xiàn)象如毛發(fā)稀少、骨質(zhì)疏松，而恢復(fù)Bmal1 的表達(dá)后，早衰現(xiàn)象明顯緩解

，本研究的β?半乳糖苷酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了Bmal1 對骨衰老的抑制作用。P53 是一種序列特異性DNA 結(jié)合蛋白，參與細(xì)胞周期調(diào)控、DNA 修復(fù)、細(xì)胞凋亡和應(yīng)激反應(yīng)等，研究表明，衰老的啟動和激活需依賴P53

。P16 基因是細(xì)胞衰老進(jìn)程中的關(guān)鍵效應(yīng)物，其蛋白是蛋白激酶?4（cyclin?dependentkinase 4，CDK4）的抑制因子，可通過p16?cyclin D/CDK?Rb 途徑調(diào)控細(xì)胞周期，影響細(xì)胞壽命及端粒長度

。qRT?PCR 檢測不同慢病毒轉(zhuǎn)染后P53、P16 基因表達(dá)水平的變化，闡釋了miR?155?5p 和Bmal1 對BMMSCs 衰老調(diào)控的相反作用。本實(shí)驗(yàn)揭示了Bmal1 及miR?155?5p 在BMMSCs中對細(xì)胞增殖、衰老的影響，增加Bmal1 的表達(dá)水平，細(xì)胞增殖活性明顯增強(qiáng)，衰老相關(guān)基因表達(dá)下降；干擾Bmal1 的表達(dá)，細(xì)胞增殖能力減弱，衰老相關(guān)基因表達(dá)水平升高，BMMSCs 衰老特征顯著，miR?155?5p 在上述過程中的效應(yīng)與Bmal1 相反。結(jié)合前期研究，課題組認(rèn)為miR?155?5p 可能作為Bmal1 的上游調(diào)控因子，通過影響近日節(jié)律基因Bmal1 的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控BMMSCs 的增殖、衰老、凋亡，從而影響骨代謝。

周一，美國市場開市，中國還是假期，看到了雷曼破產(chǎn)，中投風(fēng)控部工作人員，挨個打電話給自己的分布在全球的投資經(jīng)理，尤其是幫助中投管理貨幣市場基金的經(jīng)理，詢問在他們的投資組合里，是否有雷曼的債券？果然，Primary的基金經(jīng)理回復(fù)，他們資產(chǎn)池中有4%的倉位在雷曼債券上。該基金全稱Reserve Primary Fund，在其持有人名單上，中投公司旗下的Stable Investment是最大持有人，持有份額折合市值約54億美元。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)探究了miR?155?5p 和Bmal1在小鼠BMMSCs 中對細(xì)胞增殖、凋亡和衰老的影響，結(jié)合課題組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，推測二者可能存在相互調(diào)控機(jī)制，后續(xù)將通過動物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證，并深入探究miR?155?5p 的上游調(diào)控因子及Bmal1下游的相關(guān)信號通路，完善miR?155?5p、Bmal1 在小鼠BMMSCs 中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，加深對骨衰老的理解。

[1] Yuan B, Li J, Zhao H, et al. Global population aging, national de?velopment level,and vulnerability to the pandemic[J].Risk Manag Healthc Policy,2021,14:705?717.doi:10.2147/RMHP.S292440.

[2] Xiao YZ,Yang M,Xiao Y,et al.Reducing hypothalamic stem cell senescence protects against aging?associated physiological decline[J]. Cell Metab, 2020, 31(3): 534?548. doi: 10.1016/j.cmet.2020.01.002.

[3] 左新慧,李君,韓祥禎,等.低氧誘導(dǎo)因子?1α 對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化與血管生成相關(guān)因子的影響[J].口腔疾病防治,2021,29(7):449?455.doi:10.12016/j.issn.2096?1456.2021.07.003.Zuo XH, Li J, Han XZ, et al. Effects of hypoxia inducible factor ?1α on osteogenic differentiation and angiogenesis related factors of bone marrow mesenchymal stem cells[J]. J Prev Treat Stomatol Dis,2021,29(7):449?455.doi: 10.12016/j.issn.2096?1456.2021.07.003.

[4] Hu H, Wang D, Li L, et al. Role of microRNA?335 carried by bone marrow mesenchymal stem cells?derived extracellular vesi?cles in bone fracture recovery[J].Cell Death Dis, 2021,12(2):156.doi:10.1038/s41419?021?03430?3.

[5] Burr DB. Changes in bone matrix properties with aging[J]. Bone,2018,120:85?93.doi:10.1016/j.bone.2018.10.010.

[6] Tomita T,Wadhwa R,Kaul SC,et al.Withanolide derivative 2,3?dihydro?3β?methoxy withaferin?a modulates the circadian clock

interaction with RAR?related orphan receptor α (RORa)[J]. J Nat Prod,2021,84(7):1882?1888.doi:10.1021/acs.jnatprod.0c01276.

[7] He Y, Lin F, Chen Y, et al. Overexpression of the circadian clock gene Rev?erbα affects murine bone mesenchymal stem cell prolif?eration and osteogenesis[J].Stem Cells Dev, 2015, 24(10): 1194?1204.doi: 10.1089/scd.2014.0437.

[8] He Y, Chen Y, Zhao Q, et al. Roles of brain and muscle ARNT?like 1 and Wnt antagonist Dkk1 during osteogenesis of bone mar?row stromal cells[J]. Cell Prolif, 2013, 46(6): 644 ? 653. doi:10.1111/cpr.12075.

[9] Dexheimer PJ,Cochella L.MicroRNAs:from mechanism to organ?ism[J]. Front Cell Dev Biol, 2020, 8: 409. doi: 10.3389/fcell.2020.00409.

[10] Ambros V. The functions of animal microRNAs[J]. Nature. 2004,431(7006):350?355.doi: 10.1038/nature02871.

[11] 張成曉雪.小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中miR?155?5p 與Bmal1 的交互作用及對Hippo通路的影響[D].成都:四川大學(xué),2020.Zhang CXX.The interaction between miR?155?5p and Bmal1 and their influence on Hippo pathway in bone marrow stem cells of mice[D].Chengdu:Sichuan University,2020.

[12] Oryan A, Kamali A, Moshiri A, et al. Role of mesenchymal stem cells in bone regenerative medicine: what is the evidence?[J].CellsTissuesOrgans,2017,204(2):59?83.doi:10.1159/000469704.

[13] Tateishi K, Ando W, Higuchi C, et al. Comparison of human se?rum with fetal bovine serum for expansion and differentiation of human synovial MSC: potential feasibility for clinical applications[J]. Cell Transplant, 2008, 17(5): 549?557. doi: 10.3727/0963689 08785096024.

[14] Wang Y, Wang JW, Li Y, et al. Bone marrow?derived mesenchy?mal stem cells improve rat islet graft revascularization by upregu?lating ISL1[J]. Stem Cells, 2021, 39(8): 1033?1048. doi: 10.1002/stem.3378.

[15] Chen M, Wang F, Xia H, et al. MicroRNA?155: regulation of im?mune cells in sepsis[J]. Mediators Inflamm, 2021: 8874854. doi:10.1155/2021/8874854.

[16] Gottwein E,Mukherjee N,Sachse C,et al.A viral microRNA func?tions as an orthologue of cellular miR?155[J]. Nature, 2007, 450(7172):1096?1099.doi:10.1038/nature05992.

[17] Li B. MicroRNA regulation in osteogenic and adipogenic differen?tiation of bone mesenchymal stem cells and its application in bone regeneration[J]. Curr Stem Cell Res Ther, 2018,13(1): 26?30. doi:10.2174/1574888X12666170605112727.

[18] Khokhar M,Roy D,Bajpai NK,et al.Metformin mediates microR?NA?21 regulated circulating matrix metalloproteinase?9 in diabet?ic nephropathy: an in?silico and clinical study[J]. Arch Physiol Biochem,2021:1?11.doi:10.1080/13813455.2021.1922457.

[19] Ukai?Tadenuma M, Yamada RG, Xu H, et al. Delay in feedback repression by cryptochrome 1 is required for circadian clock func?tion[J]. Cell, 2011, 144(2): 268?281. doi: 10.1016/j.cell.2010.12.019.

[20] Lucassen EA,Coomans CP,van Putten M,et al.Environmental 24?hr cycles are essential for health[J].Current Biology, 2016,26(14):1843?1853.doi:10.1016/j.cub.2016.05.038.

[21] Redmond J, Fulford AJ, Jarjou L, et al. Diurnal rhythms of bone turnover markers in three ethnic groups[J]. J Clin Endocrinol Metab,2016,101(8):3222?3230.doi:10.1210/jc.2016?1183.

[22] Ong ALC, Ramasamy TS. Role of Sirtuin1?p53 regulatory axis in aging, cancer and cellular reprogramming[J]. Aging Res Rev,2018,43:64?80.doi:10.1016/j.arr.2018.02.004.

[23] He S, Sharpless NE. Senescence in health and disease[J]. Cell,2017,169(6):1000?1011.doi: 10.1016/j.cell.2017.05.015.