根管內(nèi)的持續(xù)性感染未得到消除是根管治療失敗的主要原因，主要由糞腸球菌等頑固性致病菌引起

。單獨(dú)使用機(jī)械儀器預(yù)備無(wú)法徹底清理根管系統(tǒng)，光動(dòng)力療法（photodynamic therapy，PDT）可殺滅根管內(nèi)細(xì)菌，在根管消毒、輔助控制根管感染中效果較好

。PDT 在根管內(nèi)發(fā)揮殺菌效果，需要激光、光敏劑、氧三個(gè)重要因素共同作用，即光敏劑在根管內(nèi)均勻擴(kuò)散后，通過(guò)激光一定波長(zhǎng)的照射，在氧氣的參與下，產(chǎn)生活性氧和單線態(tài)氧，從而起到殺菌作用

。受自身解剖結(jié)構(gòu)影響，根管內(nèi)部及牙本質(zhì)小管深處不可避免存在氧不足的情況，影響了PDT 治療效果

。常用光敏劑亞甲基藍(lán)（methylene blue，MB）的光照波長(zhǎng)為660 nm，對(duì)糞腸球菌殺菌效果較好，對(duì)MB 配方進(jìn)行改性后可進(jìn)一步提高PDT 殺菌能力，但目前對(duì)釋氧配方光敏劑的研究仍較少

。本研究擬在前期研究的基礎(chǔ)上，通過(guò)構(gòu)建單根管離體前牙糞腸球菌根管感染模型，觀察釋氧MB 配方的PDT 對(duì)根管內(nèi)糞腸球菌的殺菌效果，為臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料和方法

1.1 主要儀器和材料

糞腸球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC29212，ATCC，美國(guó)），腦?心浸液（brain heart infusion，BHI）（海博，中國(guó)），戊二醛溶液（上海生工，中國(guó)），PBS（上海生工，中國(guó)），1%次氯酸鈉（朗力生物，中國(guó)），生理鹽水沖洗液（雙鶴，中國(guó)），MB（Sigma，美國(guó)），全氟十氫化萘（Sigma，美國(guó)），H

O

（遂成，中國(guó)），Triton?X100（上海生工，中國(guó)），N?乙?；?L?色氨酸酰胺（N?acetyl?L?tryptophan amide，NATA）（Sigma，美國(guó)），1，3?二苯基異苯并呋喃（1，3?diphenylisobenzo?furan，DPBF）（Sigma，美國(guó)）。

掃描電鏡（S3400，日立，日本），ProTaper 機(jī)用馬達(dá)和銼（登士柏，瑞士），光動(dòng)力口腔治療儀（HHL?1 000，哌威，加拿大），液相色譜儀（LC?20A，島津，日本），分光光度計(jì)（UV?2600，島津，日本）。

1.2 不同配方MB 的光氧化活性和單線態(tài)氧產(chǎn)生速率測(cè)定

1.2.1 分組 參照文獻(xiàn)所述

，分為MB 組和釋氧MB 組，MB 組采用50 μmol/L MB 溶液，釋氧MB 組采用50 μmol/L MB 混合在釋氧乳液中（全氟十氫化萘∶H

O

∶Triton?X100=75∶24.5∶0.5）

。

1.2.2 光氧化活性測(cè)定 濃度為10 μmol/L 的熒光測(cè)定模型底物NATA與不同測(cè)試配方中的50 μmol/L MB 混合（總體積3 mL）。采用660 nm 波長(zhǎng)，30 mW功率輻照測(cè)試溶液誘導(dǎo)氧化劑的產(chǎn)生，激光盡量接近測(cè)試液體表面而不接觸。利用液相色譜儀測(cè)量NATA 濃度在290 nm 波長(zhǎng)隨著輻照時(shí)間增加的下降速率，NATA 濃度的下降速率代表了MB 或釋氧MB 的光氧化活性。檢測(cè)間隔為5 min，檢測(cè)20 min。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

陳豐連等[31]建立了以高效液相色譜法(HPLC)同時(shí)測(cè)定涼粉草藥材中熊果酸和齊墩果酸含量的方法，該方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、可靠。利用該方法可測(cè)定不同采收期、不同產(chǎn)地等不同批次的仙草熊果酸和齊墩果酸含量。冷桂華[32]利用反相高效液相層析法(RP-HPLC)測(cè)定了仙草不同部位的熊果酸和齊墩果酸含量，發(fā)現(xiàn)仙草葉的熊果酸和齊墩果酸含量均高于仙草莖和全仙草的含量；同一部位仙草的熊果酸含量明顯高于齊墩果酸含量，熊果酸含量約為齊墩果酸含量的2.5～2.8倍。

1.3 糞腸球菌根管感染模型的構(gòu)建

每組根管內(nèi)處理方法及細(xì)菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)方法同1.4 所述。實(shí)驗(yàn)及計(jì)算方法參考文獻(xiàn)

。

NATA 濃度的下降速率代表了光氧化活性。10 min（

= 3.570，

= 0.023）、15 min（

= 3.507，

=0.025）、20 min（

= 2.904，

= 0.044）時(shí)，釋氧MB 組NATA 濃度的下降速率高于MB 組下降速率（

＜0.05）（圖1a）。

1.4 光動(dòng)力療法對(duì)根管內(nèi)糞腸球菌的清除效果

取糞腸球菌根管感染的離體牙根30 個(gè)，隨機(jī)分為常規(guī)根管治療組、MB?PDT 治療組和釋氧MB?PDT 治療組，每組10 個(gè)離體牙根。同時(shí)另取10 個(gè)離體牙根不做任何處理，獲取根管內(nèi)樣本作為細(xì)菌測(cè)定基線。常規(guī)根管治療組采用1%次氯酸鈉溶液常規(guī)處理根管1 min；MB?PDT 治療組采用1%次氯酸鈉溶液處理根管后，注入50 μmol/L MB 溶液靜置1 min，采用光動(dòng)力治療儀照射1 min（660 nm，30 mW），重復(fù)此步驟1 次；釋氧MB?PDT 治療組采用1%次氯酸鈉溶液處理根管后，注入50 μmol/L MB 釋氧乳化溶液靜置1 min，采用660 nm 激光照射1 min，重復(fù)此步驟1 次。

最好的檢驗(yàn)方法當(dāng)然是試射，但不可能把所有炮彈都拿出去射了，所以存在一個(gè)抽樣檢查的問(wèn)題．類似的問(wèn)題很多，例如，工廠生產(chǎn)的產(chǎn)品在上市之前一般也需要技術(shù)部門(mén)做合格鑒定，工商部門(mén)也會(huì)對(duì)市場(chǎng)上的商品做合格檢查，但由于這些產(chǎn)品都有包裝，一旦打開(kāi)，這些產(chǎn)品就不能再賣了，所以不可能將所有產(chǎn)品都拆開(kāi)檢查．即使是不需要損壞產(chǎn)品包裝，也可能由于數(shù)量的龐大，很難對(duì)每件產(chǎn)品都做檢驗(yàn)，只能抽取部分產(chǎn)品做鑒定．在此基礎(chǔ)上引入簡(jiǎn)單隨機(jī)抽樣的概念．

利用無(wú)菌紙尖在根管內(nèi)取樣，靜置60 s 后，放入盛有1 mL 無(wú)菌水的無(wú)菌離心管中并充分振蕩10 s。將細(xì)菌樣本在BHI 肉湯培養(yǎng)基中37 ℃下培養(yǎng)。樣本在孵育24 h 后，分別檢測(cè)每個(gè)培養(yǎng)皿上菌落形成情況并進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)。將未處理樣本的細(xì)菌數(shù)作為計(jì)算基線，按下列公式計(jì)算各組細(xì)菌的清除率：

在此種背景下，農(nóng)業(yè)的發(fā)展方式需要轉(zhuǎn)變、要從供給入手改善供給結(jié)構(gòu)，這才有了農(nóng)產(chǎn)品供給側(cè)改革。但是在今后的農(nóng)業(yè)建設(shè)與發(fā)展中，供給側(cè)改革要想得到有效的推進(jìn)，除了國(guó)家的宏觀調(diào)控之外，農(nóng)民也得轉(zhuǎn)變發(fā)展觀念。通過(guò)施化肥、打農(nóng)藥、單純追求產(chǎn)量增長(zhǎng)的生產(chǎn)方式已經(jīng)不符合時(shí)代的潮流，農(nóng)民還要調(diào)整種植結(jié)構(gòu)，多生產(chǎn)綠色有機(jī)食品，滿足消費(fèi)者的需求來(lái)提升經(jīng)濟(jì)效益。

取糞腸球菌根管感染的離體牙根15 個(gè)，隨機(jī)分為常規(guī)根管治療組、MB?PDT 治療組和釋氧MB?PDT 治療組，每組5 個(gè)離體牙根，同時(shí)另取5 個(gè)離體牙根不做任何處理，獲取根管內(nèi)不同部位牙本質(zhì)小管內(nèi)樣本作為細(xì)菌測(cè)定基線。將牙根沿牙體長(zhǎng)軸縱向劈開(kāi)，將牙根三等份分為根上、根中、根下三段，采用小球鉆（直徑1 mm）在根上、根中、根下三段牙根部位的中心部位獲取深度1 000 μm 的牙本質(zhì)碎屑，為保證每個(gè)部位收集的牙本質(zhì)碎屑盡可能保持一致，應(yīng)在球鉆頭部剛好完全沒(méi)入根管內(nèi)壁時(shí)停止取樣，同時(shí)為了避免產(chǎn)熱過(guò)多，應(yīng)該間斷鉆磨，隨后用無(wú)菌水將碎屑轉(zhuǎn)移到離心管中并充分振蕩10 s。

1.5 光動(dòng)力療法對(duì)不同根管部位牙本質(zhì)小管內(nèi)糞腸球菌的清除效果

其中M 為基線細(xì)菌數(shù)，N 為處理后的細(xì)菌數(shù)。實(shí)驗(yàn)及計(jì)算方法參考文獻(xiàn)［9］。

糞腸球菌的根管感染模型構(gòu)建參考以往文獻(xiàn)報(bào)道

，具體如下。獲取上海市口腔醫(yī)院口腔頜面外科臨床拔除的63 個(gè)根尖發(fā)育完成、單根管離體牙（審批號(hào)：滬口防倫審［2020］014 號(hào)），將牙根表面清理干凈，修整牙體，保留牙根9 mm 的長(zhǎng)度。采用ProTaper 鎳鈦機(jī)械進(jìn)行常規(guī)根管預(yù)備，根管沖洗液交替沖洗根管，沖出碎屑。離體牙根清理完成后，121 ℃高溫高壓消毒20 min，殺滅牙根內(nèi)微生物。隨后，將滅菌后的離體牙根，置于糞腸球菌BHI 肉湯中進(jìn)行培養(yǎng)3 周，細(xì)菌濃度為10

CFU/mL，每3 d 更換1 次培養(yǎng)基。培養(yǎng)3 周后，取其中3 個(gè)樣本，采用高速渦輪手機(jī)沿牙體長(zhǎng)軸縱向磨除溝槽，用骨鑿沿溝槽將牙體縱向劈開(kāi)，用2.5%戊二醛固定后，脫水、干燥、噴金，隨后采用掃描電子顯微鏡觀察根管內(nèi)糞腸球菌的分布，確認(rèn)根管感染模型構(gòu)建成功。

1.2.3 單線態(tài)氧產(chǎn)生速率測(cè)量 濃度為100 μmol/L的單線態(tài)氧清除劑DPBF 與不同測(cè)試配方中的50 μmol/L MB 混合（總體積3 mL）。利用光度計(jì)測(cè)定DPBF 濃度在420 nm 波長(zhǎng)隨著輻照時(shí)間增加而降低的速率，分析不同配方MB 單線態(tài)氧產(chǎn)生的速率，檢測(cè)間隔為5 min，檢測(cè)20 min。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 各組光氧化活性和單線態(tài)氧產(chǎn)生速率

那么如何帶動(dòng)那些因病、因殘致貧，或者沒(méi)有勞動(dòng)能力的重點(diǎn)貧困戶實(shí)現(xiàn)脫貧？為解決這一問(wèn)題，石柱縣進(jìn)一步探索了基金收益扶貧模式，即縣財(cái)政通過(guò)整合各類涉農(nóng)資金，建立起1億元的資產(chǎn)收益扶貧專項(xiàng)基金，由縣國(guó)有資產(chǎn)監(jiān)管中心委托興農(nóng)擔(dān)保公司負(fù)責(zé)管理。該基金的申請(qǐng)對(duì)象為農(nóng)民合作社及參與產(chǎn)業(yè)扶貧的各類企業(yè)，而收益對(duì)象為重點(diǎn)貧困戶，按照每帶動(dòng)一戶重點(diǎn)貧困戶5萬(wàn)元的標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算申請(qǐng)借用額度，借用時(shí)限最長(zhǎng)為5年。

DPBF 濃度的下降速率代表了單線態(tài)氧產(chǎn)生的速率。5 min（

= 6.453，

= 0.003）、10 min（

=9.166，

= 0.001）、15 min（

= 15.600，

＜0.001）、20 min（

= 10.180，

= 0.001）時(shí)，釋氧MB 組中DPBF 的下降速率高于MB 組中下降速率（

＜0.05）（圖1b）。

2.2 糞腸球菌感染根管模型的建立

經(jīng)過(guò)3 周的培養(yǎng)，采用掃描電子顯微鏡觀察根管壁表面，可以見(jiàn)到根管表面大量圓形的糞腸球菌附著，并侵入到牙本質(zhì)小管內(nèi)部，說(shuō)明根管感染模型成功建立（圖2）。

2.3 各組根管內(nèi)糞腸球菌清除率

當(dāng)代網(wǎng)絡(luò)教學(xué)資源五花八門(mén)，為了促進(jìn)網(wǎng)絡(luò)教育的不斷創(chuàng)新和改革，學(xué)校和社會(huì)應(yīng)該做好網(wǎng)絡(luò)教育的先鋒和引路者，教師有責(zé)任將自己的知識(shí)無(wú)償傳授給學(xué)生，為了能讓學(xué)生更好地吸收知識(shí)，引導(dǎo)學(xué)生完成自主性學(xué)習(xí)，提供給學(xué)生質(zhì)量?jī)?yōu)于市面的以取利為目的的網(wǎng)絡(luò)教學(xué)機(jī)構(gòu)或者教學(xué)平臺(tái)，學(xué)校有義務(wù)為教師的網(wǎng)絡(luò)教學(xué)活動(dòng)提供平臺(tái)，社會(huì)也同樣有義務(wù)為地方網(wǎng)絡(luò)教育過(guò)程提供支持與相關(guān)所有的服務(wù)。

常規(guī)根管治療組根管內(nèi)糞腸球菌清除率為（90.43±1.43）%，MB?PDT治療組為（95.95±0.77）%，釋氧MB?PDT 治療組為（98.57 ± 1.19）%，三組根管內(nèi)糞腸球菌的清除率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

=16.5，

＜0.05），釋氧MB?PDT 組糞腸球菌清除率高于MB?PDT 治療組和常規(guī)根管治療組，MB?PDT 治療組高于常規(guī)根管治療組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

＜0.05）。

2.4 不同根管部位牙本質(zhì)小管內(nèi)糞腸球菌清除率

三組根管不同部位（根上、根中、根下段）牙本質(zhì)小管內(nèi)糞腸球菌清除率如表1 所示。根上段，三組清除率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

= 33.7，

＞0.05）；根中段，釋氧MB?PDT 組清除率高于常規(guī)根管治療組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

＜0.05）；根下段，MB?PDT 治療組清除率高于常規(guī)根管治療組，釋氧MB?PDT 組高于常規(guī)根管治療組和MB?PDT 治療組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

＜0.05）。

利用Msatcommander軟件對(duì)廣西地不容的unigene序列進(jìn)行SSR位點(diǎn)搜索。篩選標(biāo)準(zhǔn)：?jiǎn)螇A基重復(fù)不予統(tǒng)計(jì)，二堿基至少重復(fù)6次、三至四堿基至少重復(fù)5次、五至六堿基至少重復(fù)3次。

3 討 論

糞腸球菌是一種革蘭氏陽(yáng)性兼性厭氧菌，在根管內(nèi)可形成生物膜，在牙本質(zhì)小管內(nèi)的潛行深度可達(dá)1 000 μm，能夠在較為惡劣的條件下生存，可以耐受根管內(nèi)pH 值、溫度和氧張力的巨大變化，具有較強(qiáng)的耐藥性

。由于根管結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性以及糞腸球菌的特點(diǎn)，常規(guī)根管治療方法仍然存在一定的局限性，無(wú)法完全清除根管內(nèi)的糞腸球菌感染

。PDT 作為一種新型的根管消毒方法，具有諸多優(yōu)點(diǎn)

：可以殺傷病原微生物而不對(duì)正常的人體細(xì)胞產(chǎn)生影響；沒(méi)有激光治療產(chǎn)熱過(guò)多損傷牙周組織的問(wèn)題；光譜殺菌，無(wú)耐藥性；殺菌能力較為安全高效（無(wú)次氯酸鈉的毒性）等。但是根管內(nèi)氧不足的特點(diǎn)大大影響了PDT 的根管消毒能力。改善根管內(nèi)的氧環(huán)境，可以更好提高PDT在根管消毒中的作用。研究發(fā)現(xiàn)，利用氧載體混合H

O

釋氧的配方，提高了根管消毒效果

。本研究采用了離體牙糞腸球菌根管感染模型，利用此配方進(jìn)一步研究了PDT 在根管消毒中的作用。

本研究中，釋氧MB 組中的氧化活性及單線態(tài)氧的產(chǎn)生能力均強(qiáng)于MB 組，提示該配方進(jìn)一步改善了反應(yīng)中的內(nèi)在氧環(huán)境，對(duì)后續(xù)PDT 治療中進(jìn)一步提高殺滅微生物的效果具有重要意義，與前期研究結(jié)果一致

。研究發(fā)現(xiàn)，PDT 與1%次氯酸鈉聯(lián)用可以起到較好的效果

，同時(shí)重復(fù)兩次PDT 治療的效果要明顯優(yōu)于單次PDT 治療的效果，殺菌率可以有效提高到95%左右

。因而，本研究在應(yīng)用1%次氯酸鈉根管消毒的基礎(chǔ)上，采用了兩次PDT 治療進(jìn)行研究。結(jié)果顯示，MB?PDT 治療組的糞腸球菌清除率（95.95 ± 0.77）%高于常規(guī)根管治療組，釋氧MB?PDT 治療組的糞腸球菌的清除率（98.57±1.19）%得到進(jìn)一步提高；表明改善根管內(nèi)氧環(huán)境后，提高了PDT 治療對(duì)根管內(nèi)糞腸球菌的殺菌能力。

糞腸球菌可以潛伏至牙本質(zhì)小管內(nèi)1 000 μm的深度，常規(guī)根管消毒采用的次氯酸鈉等消毒溶液的滲透能力無(wú)法達(dá)到此深度

，同時(shí)因?yàn)楦芙Y(jié)構(gòu)形態(tài)的復(fù)雜性（如根下段根管分歧、側(cè)枝等），進(jìn)一步影響了根管消毒效果

。PDT 治療中，MB溶液能更好滲透進(jìn)入牙本質(zhì)小管深層

，以及自由氧在根管內(nèi)不同位置充分釋放均是其發(fā)揮消毒作用的關(guān)鍵因素。因而本研究進(jìn)一步研究了釋氧MB 應(yīng)用于PDT 治療在根上、根中、根下不同部位的清除效果差異。結(jié)果顯示，各組根上段糞腸球菌清除率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在根中段，釋氧MB?PDT 組的糞腸球菌清除率高于常規(guī)根管治療組，但與MB?PDT 治療組無(wú)明顯差異；在根下段，MB?PDT治療組的糞腸球菌清除率（91.94 ± 2.47）%高于常規(guī)根管治療組（85.44 ± 1.43）%，釋氧MB?PDT 組糞腸球菌清除率（97.87 ± 1.14）%高于MB?PDT 治療組。提示釋氧PDT 主要改善了根下段內(nèi)氧環(huán)境，并進(jìn)一步提高了PDT 對(duì)根管內(nèi)糞腸球菌的輔助清除效果。

綜上，PDT 可以輔助根管治療，提高常規(guī)根管治療中根管內(nèi)糞腸球菌清除率，釋氧PDT 通過(guò)提高根管內(nèi)自由氧的含量，可進(jìn)一步提高PDT 的殺菌能力，且對(duì)于根下段部分效果更加明顯。

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