張新亞，張 建，盧 辰，薛 勇，羅志丹

(1.江蘇海洋大學(xué) 江蘇省海洋藥物活性分子篩選重點實驗室，連云港 222005；2.江蘇省海洋資源開發(fā)研究院(連云港)，連云港 222005)

新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)所引發(fā)的新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)是世界衛(wèi)生組織認定的全球大流行傳染病[1-3]，具有傳播速度快、感染范圍廣、防控難度大等特點，迄今仍在全球不斷蔓延，防控形勢依然十分嚴(yán)峻[4-6]。新冠病毒屬于單鏈正義RNA病毒，在復(fù)制過程中容易發(fā)生突變，目前研究者已經(jīng)收集了200多萬個新冠病毒基因組序列。盡管絕大多數(shù)基因突變都不會影響病毒的毒性和傳染性，但部分新冠病毒基因組上第23 403位的腺苷酸突變?yōu)轼B苷酸，導(dǎo)致新冠病毒S蛋白第614位的天冬氨酸變?yōu)楦拾彼?，這一突變可以增強蛋白酶對S蛋白的切割能力，從而促使病毒具有更強的感染能力[7]。此外，D614G突變改變了S蛋白甚至是整個病毒的免疫原性，進而降低了康復(fù)期血清對病毒的敏感性。攜帶該突變的新冠病毒毒株自2020年2月在歐洲出現(xiàn)后，很快成為全球主要流行毒株之一，并進一步演化出德爾塔等突變株。因此，如何在病毒核酸檢測時快速鑒定這些單核苷酸多態(tài)性(SNP)，一直是研究者關(guān)注的重要問題。

目前主流的核酸單個SNP檢測手段包括測序法和熒光定量PCR法[8-10]。其中測序法最為準(zhǔn)確，但耗時較長，不利于臨床快速檢測；熒光定量PCR法檢測RNA突變[11-14]，首先需要將模板RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后使用一對根據(jù)突變位點上下游設(shè)計的PCR引物，以及一條覆蓋突變位點的Taqman-MGB熒光探針進行熒光定量PCR，該方法需要的模板長度一般不低于100 nt，如果病毒核酸在提取和保存過程中受到破壞，碎片化程度較嚴(yán)重，則會嚴(yán)重影響檢出率。

連接酶檢測反應(yīng)(ligase detection reaction, LDR)是一種不依賴聚合反應(yīng)的檢測技術(shù)[15-17]。其原理為利用DNA連接酶催化兩條寡核苷酸單鏈之間形成磷酸二酯鍵時，要求缺口處的核苷酸必須形成互補雙鏈的特性，設(shè)計特異性連接探針。該方法直接針對SNP位點上下游設(shè)計探針，當(dāng)探針與SNP位點完全匹配的時候才能在連接酶作用下進行連接，連接產(chǎn)物可通過各種方法進行檢測。理論上LDR可檢測的片段長度只取決于探針與模板的配對區(qū)域長度，可以低到50 nt甚至更短。研究期望利用LDR技術(shù)，開發(fā)一種快速檢測碎片化新冠病毒S基因D614G突變的方法，為病原核酸檢測開辟新的思路。

1 材料和方法

1.1 材料

新冠病毒S基因質(zhì)粒購自通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司；TaqSYBR Green qPCR Premix、無縫克隆試劑盒和DNase I購自江蘇愚公生命科技有限公司；HiFiTaqDNA連接酶、T7 RNA聚合酶購自NEB。

1.2 方法

1.2.1 設(shè)計引物探針

利用連接酶反應(yīng)特性，針對突變位點兩側(cè)序列設(shè)計一對特異性的單鏈DNA探針。其中下游探針的5′部分與目標(biāo)突變位點上游序列反向互補，5′末端帶有自由磷酸基團，3′部分為通用序列；上游探針的5′部分為通用序列，3′部分與目標(biāo)突變后位點及其下游序列反向互補，其中3′末端堿基與突變后位點堿基互補(圖1)。然后設(shè)計一組PCR引物與探針的通用序列配對。

圖1 LDR-qPCR原理圖

1.2.2 獲取新冠病毒S基因RNA片段模板

以帶有野生型新冠病毒S基因的質(zhì)粒為模板，使用無縫克隆技術(shù)人工構(gòu)建D614G突變體。根據(jù)D614G突變位點的上下游合計50、100和200 bp的序列設(shè)計一組產(chǎn)物長度不同，但均帶有T7啟動子的引物，對野生型和突變體質(zhì)粒進行PCR擴增。以純化后的PCR產(chǎn)物為模板，使用T7 RNA聚合酶進行體外轉(zhuǎn)錄獲得長度不同的野生型和D614G突變體病毒RNA片段，經(jīng)DNase I消化去除DNA后，使用瓊脂糖凝膠電泳驗證。

1.2.3 建立LDR-qPCR反應(yīng)體系

使用體外轉(zhuǎn)錄獲得的新冠病毒S基因RNA片段為模板，配制表1所示的反應(yīng)體系進行LDR反應(yīng)，按照HiFiTaqDNA連接酶說明書推薦的程序：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火連接4 min，循環(huán)35次。隨后使用PCR引物對LDR產(chǎn)物進行熒光定量PCR檢測。

表1 LDR反應(yīng)體系

首先篩選LDR模板濃度，分別設(shè)置轉(zhuǎn)錄后原液、稀釋10、100倍等3個梯度；隨后篩選探針濃度，設(shè)置為0.1 μmol/L和0.01 μmol/L兩個梯度；然后篩選最適的探針與模板配對區(qū)長度，分別設(shè)置25、22、18、15、12和8 bp。篩選出較優(yōu)條件后，測試LDR-qPCR檢測不同長度病毒RNA片段的表現(xiàn)，片段長度設(shè)置為200、100和50 nt。

1.2.4 模擬樣本測試

提取Hela細胞總RNA；同時以帶有新冠病毒N基因的質(zhì)粒為模板進行體外轉(zhuǎn)錄獲得N基因RNA，并稀釋到與S基因RNA片段相同濃度。將不同濃度的S基因D614G與野生型模板分別與細胞總RNA、N基因RNA混合，模擬真實提取的組織RNA。使用LDR-qPCR體系進行檢測。

1.2.5 測試探針與模板不完全匹配檢測效果

以S基因D614G突變位點為中心，設(shè)計長度為50 nt，向上下游各移動5～10 nt、與探針不完全匹配的一組RNA片段(圖2)，使用上述的LDR-qPCR體系驗證檢測效果。

圖2 探針錯配原理圖

2 結(jié)果與分析

2.1 新冠病毒S基因RNA的獲取

以帶有野生型新冠病毒S基因的質(zhì)粒為模板，采用無縫克隆技術(shù)構(gòu)建D614G突變體，經(jīng)測序驗證正確。分別以野生型和突變體質(zhì)粒為模板，使用不同引物對擴增出含有S基因614位點，長度為200 bp、100 bp和50 bp的片段。經(jīng)T7 RNA聚合酶體外轉(zhuǎn)錄，成功獲得長度為200 nt、100 nt和50 nt的新冠病毒S基因RNA片段(圖3)。

M:DL2000 Plus Marker；泳道1、2為長度200 nt,轉(zhuǎn)錄前后片段；泳道3、4為長度100 nt,轉(zhuǎn)錄前后片段；泳道5、6為長度50 nt,轉(zhuǎn)錄前后片段。箭頭指示所獲得的RNA片段。

2.2 RNA模板與探針濃度篩選

長度為200 nt的野生型和D614G突變體S基因片段體外轉(zhuǎn)錄后RNA濃度均為50 pmol/L，取原液、10倍稀釋和100倍稀釋的RNA分別進行LDR-qPCR檢測，結(jié)果表明對50 pmol/L和5 pmol/L濃度的模板，突變體的Ct值顯著低于野生型，具有良好區(qū)分度；而對0.5 pmol/L的模板，盡管突變體和野生型Ct值之間也具有顯著性差異，但與5 pmol/L相比差值偏小，且突變體Ct值偏高[圖4(a)]。因此，以5 pmol/L的RNA作為后續(xù)實驗的模板濃度。比較工作濃度為0.1 μmol/L和0.01 μmol/L的探針檢測表現(xiàn)，結(jié)果表明兩個濃度的探針均有較好的區(qū)分效果[圖4(b)]。

(a)RNA模板濃度篩選；(b)LDR探針濃度篩選。** 表示差異達到顯著水平(P<0.01)。

2.3 探針模板配對區(qū)長度篩選

LDR探針由模板配對區(qū)和通用擴增區(qū)兩部分組成，容易形成引物二聚體從而干擾qPCR結(jié)果，因此需要測試探針中模板配對區(qū)長度對結(jié)果的影響。每一側(cè)探針都分別設(shè)置15、18、22和25 nt的模板配對區(qū)，分別對野生型和突變體模板進行檢測。結(jié)果表明，包含有18、22、25 nt模板配對區(qū)的探針，對D614G突變體有良好的區(qū)分度(圖5)。后續(xù)實驗中繼續(xù)使用具有25 nt模板配對區(qū)的LDR探針。

** 表示差異達到顯著水平(P<0.01)；ns表示無顯著性。

2.4 不同長度RNA模板檢測

LDR體系為檢測碎片化片段提供了獨特的優(yōu)勢，理論上其可檢測片段長度只取決于上下游探針的模板配對區(qū)長度之和。圍繞D614G位點上下游構(gòu)建了200、100和50 nt等3種長度的病毒RNA片段模板，用同樣的探針進行了測試。結(jié)果表明，3種長度的突變體Ct值均顯著低于突變體(圖6)，表明本方法至少可以檢測到50 nt片段中所包含的點突變，而普通熒光定量PCR對這個長度的模板是無能為力的。

** 表示差異達到顯著水平(P<0.01)。

2.5 模擬真實提取樣本檢測

實驗室不具備操作高危病原微生物的條件，因此將提取的細胞總RNA(3 000 ng/μL)、體外轉(zhuǎn)錄獲得的新冠病毒N基因RNA與S基因片段混合，模擬提取的患者樣本來驗證本方法的分辨率。結(jié)果表明，當(dāng)5 pmol/L的S基因RNA混入到其他RNA中時，突變體和野生型的Ct值仍然保留顯著差異(圖7)，說明方法具有足夠的分辨率。

** 表示差異達到顯著水平(P<0.01)。

2.6 探針-模板不完全匹配測試

上述實驗所模擬的是較為理想的情況，即LDR探針的模板配對區(qū)恰好可以與病毒RNA片段完全匹配。但事實上，碎片化的病毒RNA片段往往還不足以與探針恰好完全匹配。為了模擬這種情況，設(shè)計了一組與探針不完全匹配的病毒RNA片段(圖8)來驗證本方法的可行性。結(jié)果表明，即使模板與LDR探針錯位達到10 nt，突變體和野生型的Ct值依然有6～8個循環(huán)的差別，足以進行區(qū)分。換言之，檢測長度下限至少為40 nt。

(a)模板區(qū)50 nt與探針區(qū)(50 nt)完全匹配；(b)模板區(qū)50 nt相對探針區(qū)(50 nt)向上游移動5 nt；(c)模板區(qū)50 nt相對探針區(qū)(50 nt)向上游移動10 nt；(d)模板區(qū)50 nt與相對探針區(qū)(50 nt)右移向下游移動5 nt；(e)模板區(qū)50 nt與相對探針區(qū)(50 nt)向下游移動10 nt；(f)NTC(不加模板)。

3 討論

目前主流的SNP快速檢測方法使用的Taqman-MGB探針熒光定量PCR法，需要考慮SNP位點在探針上的位置和附近的序列特征，如果SNP位點附近存在特殊結(jié)構(gòu)，則可能無法設(shè)計出有效的探針；探針必須與引物相隔一定距離，所需模板長度一般要求不低于100 nt，在檢測碎片化病毒基因時受到限制。而LDR技術(shù)直接針對SNP位點側(cè)翼序列設(shè)計探針，無需考慮序列特征，設(shè)計簡單方便；而且可檢測片段長度理論上只取決于上下游探針的模板配對區(qū)長度之和，可以檢測的片段長度可以低于50 nt。研究建立的方法所需模板最低長度僅為40 nt，遠低于普通探針法熒光定量PCR所需的模板長度，在檢測碎片化模板上具有較大優(yōu)勢。

目前LDR反應(yīng)第一步依賴探針和模板之間的自由結(jié)合，效率相對偏低，而且連接酶說明書所用循環(huán)反應(yīng)程序是針對雙鏈DNA模板設(shè)置的，未針對單鏈RNA模板進行優(yōu)化，后續(xù)還需要進一步優(yōu)化。此外，研究檢測LDR產(chǎn)物使用熒光定量PCR，操作較為繁瑣，而且LDR探針上額外加入熒光定量PCR擴增所需通用序列，使得探針長度偏長，容易產(chǎn)生引物二聚體影響檢測效果。后續(xù)可以考慮采用其他檢測手段加以改進。