莫超然，周麗麗，霍東升，閆旭升，賈建新，楊占君

(1.包頭醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院，內(nèi)蒙古包頭 014040；2.包頭醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室)

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一種常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其主要病理特征是中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的進(jìn)行性丟失以及具有異常蛋白質(zhì)聚集的路易小體的形成[1-2]。PD臨床癥狀包括運(yùn)動癥狀如靜止性震顫、運(yùn)動遲緩、肌強(qiáng)直、姿勢和步態(tài)異常和非運(yùn)動癥狀如睡眠障礙、感覺障礙、認(rèn)知/精神障礙、自主神經(jīng)功能障礙等[3-5]。PD的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，可能與神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺的“自動氧化”對多巴胺能神經(jīng)元的毒性損傷作用有關(guān)[6]。香青蘭是唇形科青蘭屬一年生草本，全草入藥，具有廣泛的藥理作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)TFDM對PD模型小鼠運(yùn)動障礙具有改善作用。因此，本研究擬探討TFDM改善PD模型小鼠運(yùn)動功能障礙的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1試劑 TFDM由包頭醫(yī)學(xué)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心提供。1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP)購自Sigma有限公司；所有抗體均購自Affinity Biosciences有限公司；BCA蛋白定量試劑盒、RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Thermo有限公司；熒光定量檢測試劑盒購自美國天根生化科技有限公司；引物購自上海生工生物工程有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)動物 100只(22±2)g 8周齡SPF級雄性C517BL/6J 小鼠，購自北京維通利華有限公司[SCXK (京) 2019-0010]。實(shí)驗(yàn)動物均飼養(yǎng)在內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院 SPF 級動物房中[SYXK( 京) 2017-0033]，室溫(22±1)℃，晝夜循環(huán)12 h，小鼠可自由進(jìn)食、飲水。實(shí)驗(yàn)動物遵循我國《實(shí)驗(yàn)動物護(hù)理和使用指南》和“3R”原則執(zhí)行，動物實(shí)驗(yàn)獲內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所動物實(shí)驗(yàn)倫理審查委員會批準(zhǔn)(2016-033)。

1.3動物分組及干預(yù) 將100只8周齡雄性C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為對照組(control)20只、觀察組80只。觀察組小鼠采用腹腔注射MPTP(30 mg/kg·d)，連續(xù)7天，制備PD模型，結(jié)束后觀察小鼠體重及行為能力以判斷造模成功。觀察組小鼠再分為模型組(model)，TFDM低劑量組(TFDM-L)，中劑量組(TFDM-M)，高劑量組(TFDM-H)各20只。第8天開始，基于課題組前期實(shí)驗(yàn)研究將TFDM-L、TFDM-M和TFDM-H組動物分別給予TFDM 10、20和30 mg/(kg·d)灌胃治療[10]，連續(xù)4周。對照組和模型組小鼠給予等體積生理鹽水。觀察小鼠一般情況及死亡情況，自由飲水和進(jìn)食。實(shí)驗(yàn)室溫度為22～24 ℃，相對濕度為45 %～50 %。

1.4行為學(xué)檢測 最后一次給藥前3天在相同時間段進(jìn)行行為學(xué)訓(xùn)練，每天1次。最后一次給藥結(jié)束后，與訓(xùn)練時間一致的情況下將各組小鼠進(jìn)行行為學(xué)檢測。

1.4.1轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)前將小鼠置于疲勞儀的旋轉(zhuǎn)棒上，給予30 s適應(yīng)環(huán)境。啟動疲勞儀，使轉(zhuǎn)桿轉(zhuǎn)速達(dá)到26 r/min，紅外裝置在300 s內(nèi)記錄小鼠從轉(zhuǎn)棒上落下時在轉(zhuǎn)棒上移動的時間，作為小鼠轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)的下落潛伏期。即小鼠第一次從轉(zhuǎn)棒上掉下來的時間。每只小鼠檢測3次跌落潛伏期，每次間隔至少30 min，取平均值為小鼠跌落潛伏期，評估小鼠的運(yùn)動協(xié)調(diào)性。

1.4.2曠場實(shí)驗(yàn) 曠場是一塊帶有視頻檢測系統(tǒng)的方形藍(lán)色塑料板，連接到計算機(jī)軟件以傳輸實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，將小鼠置于中心位置并面向同一方向，啟動軟件在5 min內(nèi)跟蹤小鼠的距離。

1.4.3爬桿實(shí)驗(yàn) 該裝置由一根鐵棒(高50 cm，直徑1 cm)和頂部的泡沫球組成，全部用紗布包裹以防止老鼠打滑。試驗(yàn)前，將小鼠置于攀爬桿頂部，記錄小鼠從雙上肢接觸鐵桿平臺開始向下爬至底部所需的時間[7]。

1.5指標(biāo)檢測 行為學(xué)檢測結(jié)束后次日，每組隨機(jī)選取10只小鼠，斷頭取腦，冰上迅速分離取出腦組織分離中腦，至于-80 ℃冰箱保存。剩余10只小鼠用10 %水合氯醛(10 mg/kg)麻醉，經(jīng)左心室4 %多聚甲醛緩沖液灌注固定后，取腦組織分離中腦，置于4 %多聚甲醛中浸泡固定。

1.5.1尼氏染色觀察各組小鼠中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元形態(tài)變化：石蠟切片經(jīng)二甲苯、梯度乙醇脫蠟至水后蒸餾水沖洗。置入尼氏染液中37 ℃恒溫孵育10 min，蒸餾水再次洗滌2次，95 %乙醇浸泡5 s，最后梯度乙醇、二甲苯脫水透明即可封片采集圖像。

1.5.2RT-PCR法檢測mRNA表達(dá)：使用Trizol試劑從腦組織中提取總RNA。按照cDNAFirstStrandSynthesisKit的說明將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。按照TalentqPCRPreMix(SYBRGreen)Kit和RochelightCycler96實(shí)時熒光定量PCR儀器檢測系統(tǒng)的說明，通過實(shí)時定量PCR檢測Ct值。qPCR執(zhí)行如下：95 ℃下3 min，然后是40個循環(huán)，95 ℃下5 s和60 ℃下30 s。β-actin用作內(nèi)源對照。PCR引物由生物工程有限公司設(shè)計和合成，見表1。

表1 引物序列

1.5.3Western blot法檢測蛋白表達(dá)：取中腦黑質(zhì)區(qū)腦組織加入蛋白裂解液以及蛋白酶抑制劑充分裂解后離心取上清得到總蛋白原液。蛋白質(zhì)濃度通過牛血清白蛋白(BCA)法測定。加入蛋白質(zhì)上樣緩沖液，在金屬浴中100 ℃煮沸5 min使蛋白質(zhì)變性。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。5 %脫脂奶粉，加入一抗，4 ℃孵育過夜。使用了針對β-actin(1∶1000)、TH(1∶1000)、VMAT2(1∶500)和DAT(1∶500)的抗體。洗滌印跡以去除多余的抗體后，將它們與相應(yīng)的二抗(1∶1000)孵育1.5 h，孵育后洗滌。最后通過超敏化學(xué)發(fā)光液曝光，然后收集并通過ImageJ進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1TFDM對各組小鼠的運(yùn)動能力的影響 曠場實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組小鼠的運(yùn)動距離明顯降低(P<0.05)；給予TFDM處理后小鼠的運(yùn)動距離顯著增加，并呈劑量依賴性(P<0.05)(圖1A)。爬桿實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組小鼠爬桿時間明顯增加(P<0.05)，TFDM處理后，中、高低劑量組顯著降低小鼠的爬桿時間(P<0.05)(圖1B)。轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組小鼠的跌落潛伏期比對照組明顯減短(P<0.05)，TFDM處理后，中、高劑量組小鼠的跌落潛伏期顯著增加(P<0.05)(圖1C)。

圖1 TFDM對各組小鼠的運(yùn)動能力的影響

2.2TFDM對中腦黑質(zhì)區(qū)神經(jīng)元的影響 對照組小鼠黑質(zhì)區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞完整，核仁明顯，胞質(zhì)邊界清晰，Nissl小體呈藍(lán)色(圖2A)。模型組神經(jīng)元細(xì)胞體萎縮、細(xì)胞核固結(jié)和深染色、核仁模糊、尼氏體減少(圖2B)。經(jīng)TFDM處理后，中、高劑量組神經(jīng)元結(jié)構(gòu)逐漸清晰，核仁明顯，較模型組有明顯改善(圖2D和圖2E)。

圖2 TFDM對中腦黑質(zhì)區(qū)神經(jīng)元的影響

2.3TFDM對中腦黑質(zhì)TH、VMAT2和DAT表達(dá)的影響 與對照組比較，模型組TH、VMAT2和DAT蛋白的表達(dá)均顯著降低(P<0.05)(圖3)；給予TFDM處理后，中、高劑量組小鼠TH和DAT蛋白表達(dá)較模型組均明顯升高(P<0.05)(圖3A和圖3B)；VMAT2蛋白表達(dá)僅在高劑量組表達(dá)具有顯著性差異(P<0.05)，而在低、中劑量組表達(dá)無顯著差異(P>0.05)(圖3C)。

圖3 TFDM對中腦黑質(zhì)TH、VMAT2和DAT表達(dá)的影響

2.4TFDM對中腦黑質(zhì)TH mRNA、VMAT2 mRNA和DAT mRNA表達(dá)的影響 與對照組相比，模型組TH mRNA表達(dá)明顯降低(P<0.05)；給予TFDM后，與模型組比較，TH mRNA表達(dá)呈劑量依賴性增高(P<0.05)(圖4A)。與對照組比較，模型組DAT mRNA和VMAT2 mRNA的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，TFDM處理中、高劑量組的DAT mRNA和VMAT2 mRNA表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)(圖4B、圖4C)。

圖4 TFDM對中腦黑質(zhì)TH mRNA、VMAT2 mRNA和DAT mRNA表達(dá)的影響

3 討論

隨著人口老齡化社會的到來，帕金森病呈現(xiàn)逐年增長趨勢。大量研究表明，帕金森病的發(fā)病機(jī)制可能與氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙、蛋白質(zhì)異常聚集、免疫炎癥、細(xì)胞凋亡有關(guān)。香青蘭是一種傳統(tǒng)的中草藥，屬唇形科青蘭屬植物，廣泛分布于中國內(nèi)蒙古和新疆，具有祛痰、鎮(zhèn)靜和平喘作用。TFDM是香青蘭的主要成分，具有較強(qiáng)的抗炎和抗氧化作用[8]。有研究報道，TFDM還具有抗心肌缺血再灌注損傷和抑制動脈粥樣硬化的作用[9]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)TFDM通過降低氧化應(yīng)激損傷對MPTP致PD模型小鼠發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[10]。

多巴胺是一種兒茶酚胺神經(jīng)遞質(zhì)，在單胺氧化酶和兒茶酚氧位甲基轉(zhuǎn)移酶作用下，生成終產(chǎn)物高香草酸。多巴胺能神經(jīng)元可以通過酪氨酸泵(或轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)將酪氨酸攝入神經(jīng)元，并在限速酶TH的催化下合成左旋多巴。然后在芳香族氨基酸脫羧酶的作用下，左旋多巴形成多巴胺[11]。細(xì)胞質(zhì)中的多巴胺可以通過位于突觸前神經(jīng)元突觸囊泡膜上的VMAT2攝取到突觸囊泡中，進(jìn)入突觸囊泡的多巴胺被釋放到突觸間隙發(fā)揮作用。之后，突觸間隙中的多巴胺被DAT重新攝回到突觸前神經(jīng)元，并重新形成多巴胺循環(huán)。這種循環(huán)過程維持突觸間隙和突觸前神經(jīng)元中的多巴胺穩(wěn)態(tài)。

帕金森病小鼠運(yùn)動功能異常，中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元數(shù)量減少[12]。本研究結(jié)果表明，MPTP制備的PD模型小鼠的多巴胺能神經(jīng)元減少，運(yùn)動能力下降。TFDM處理后黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元增多，小鼠運(yùn)動能力提高。中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元尼氏染色發(fā)現(xiàn)，TFDM處理后，神經(jīng)元結(jié)構(gòu)逐漸清晰，核仁明顯，尼氏體顯著增多。結(jié)果表明TFDM可以減緩多巴胺能神經(jīng)元的進(jìn)行性丟失，對帕金森病具有神經(jīng)保護(hù)作用。

TH作為多巴胺合成的限速酶，其活性可以直接反映組織中多巴胺水平的變化，是帕金森病模型制備成功與否的關(guān)鍵指標(biāo)。VMAT2是神經(jīng)末梢調(diào)節(jié)多巴胺的重要因素。它可以通過內(nèi)吞作用將細(xì)胞質(zhì)中的多巴胺吞入囊泡中，維持細(xì)胞質(zhì)中的多巴胺穩(wěn)態(tài)。DAT的恢復(fù)功能是維持突觸空間多巴胺水平的重要途徑，因此DAT的含量可以間接反映多巴胺能神經(jīng)元數(shù)量的變化，是觀察多巴胺能神經(jīng)元數(shù)量變化的重要指標(biāo)。過表達(dá)的VMAT2和DAT可以抵抗MPTP神經(jīng)毒性損傷，而低表達(dá)的VMAT2和DAT對MPTP更敏感[13-14]。研究發(fā)現(xiàn)，帕金森病患者多巴胺能神經(jīng)元受損，其突觸前末梢和包涵體中的DAT均顯著減少[15-16]。在神經(jīng)元中，通過抑制VMAT2蛋白表達(dá)，增加細(xì)胞質(zhì)中的多巴胺水平會加劇左旋多巴誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡[17]。本研究結(jié)果表明，模型組小鼠TH、VMAT2和DAT蛋白表達(dá)水平降低，導(dǎo)致多巴胺合成、釋放和再攝取抑制，破壞多巴胺在神經(jīng)末梢和突觸間隙的重新分布和穩(wěn)態(tài)，最終導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元丟失。給予TFDM處理后，小鼠中腦黑質(zhì)中TH、VMAT2和DAT蛋白的表達(dá)上調(diào)，而且各蛋白相應(yīng)的基因水平也出現(xiàn)同樣變化。提示TFDM可能從基因水平提高TH mRNA、VMAT2 mRNA和DAT mRNA轉(zhuǎn)錄水平，相應(yīng)提高其對應(yīng)蛋白的表達(dá)，從而改善多巴胺合成、釋放和再循環(huán)穩(wěn)態(tài)，起到神經(jīng)保護(hù)作用。

總之，本研究結(jié)果揭示TFDM可能通過上調(diào)VMAT2和DAT蛋白的表達(dá)，減少DA能神經(jīng)元丟失，進(jìn)而改善PD模型小鼠運(yùn)動功能障礙，這將為TFDM進(jìn)一步應(yīng)用于帕金森病的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。