王瑋婷，譚誼萌，朱俊宣，鄔國(guó)棟，楊 丹，薄彧坤，安 明

(內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古包頭 014060)

蒙藥制劑琪素-25丸，由梔子、苘麻子、苦參、驢血粉和草決明等二十五味藥組成，具有燥“協(xié)日烏素”、散瘀的功效，主要用于類風(fēng)濕、游痛癥以及關(guān)節(jié)炎等[1-2]。為更好地控制該蒙藥制劑的質(zhì)量，確保臨床用藥安全有效，本研究采用TLC法鑒別制劑中梔子、苘麻子的主要成分，并通過(guò)HPLC法測(cè)定琪素-25丸中梔子苷的含量，進(jìn)而達(dá)到對(duì)蒙藥制劑琪素-25丸內(nèi)在質(zhì)量的控制，為該制劑的生產(chǎn)和使用的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1儀器 島津LC-20AT型高效液相色譜儀[島津企業(yè)管理(中國(guó))有限公司]；GenPure UV-TOC/UF 超純水機(jī)(美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司)；AS10200系列超聲波清洗機(jī)(220V/50Hz)(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)；BSA224S-CW電子天平(萬(wàn)分之一天平)、SQP 型電子天平(十萬(wàn)分之一天平)，均購(gòu)于賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；TDZ5-WS 多管架自動(dòng)平衡離心機(jī)(長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司)。

1.2試藥 對(duì)照品梔子苷(AF21020852)、對(duì)照藥材梔子(AF20102601)、苘麻子(AF21020514)均購(gòu)于成都埃法生物科技有限公司；琪素-25丸(批號(hào)：2007071、2007072)由內(nèi)蒙古包頭市中蒙醫(yī)院制劑室提供；乙腈為色譜純，水為超純水，甲醇等其余試劑為分析純。

1.3薄層色譜(TLC)法定性鑒別

1.3.1梔子TLC鑒別 分別取琪素-25丸5.14 g、陰性樣品(缺梔子)4.94 g、梔子藥材1.0 g，梔子對(duì)照藥材1.0 g，各加50 %甲醇10 mL于錐形瓶中，超聲40 min，過(guò)濾，即得4種所需溶液。精密稱定梔子苷對(duì)照品適量，加乙醇搖勻即得梔子苷對(duì)照品溶液(濃度為4 mg/mL)。照薄層色譜法(通則0502)試驗(yàn)，分別吸取琪素-25丸供試品溶液、陰性對(duì)照溶液各10 μL，梔子藥材溶液、梔子對(duì)照藥材溶液和梔子苷對(duì)照品溶液各2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，展開(kāi)劑選用乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水(5∶5∶1∶1)，在層析缸中展開(kāi)，取出，晾干，之后噴顯色劑(10 %硫酸乙醇溶液)顯色，加熱(110 ℃)至斑點(diǎn)顯色清晰。

1.3.2苘麻子TLC鑒別 分別取琪素-25丸3.43 g、缺苘麻子的陰性樣品3.23 g、苘麻子藥材2.0 g，苘麻子對(duì)照藥材2.0 g，各加石油醚20 mL，使用索氏提取器加熱回流，回流至溶液無(wú)色，冷卻至室溫，棄石油醚，揮干殘留溶劑，加入乙醇3 mL，超聲30 min，冷卻至室溫，濾過(guò)，濾液濃縮到2 mL，即得4種所需溶液。照薄層色譜法(通則0502)試驗(yàn)，吸取4種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，展開(kāi)劑選用三氯甲烷-丙酮-甲醇-甲酸(3∶1∶0.5∶0.1)，在層析缸中展開(kāi)，取出，晾干，之后噴顯色劑(10 %硫酸乙醇溶液)顯色，加熱(110 ℃)至斑點(diǎn)顯色清晰。將薄層板置于紫外光燈(365 nm)下觀察結(jié)果。

1.4高效液相色譜(HPLC)法測(cè)定琪素-25丸中梔子苷的含量

1.4.1色譜條件 色譜柱為依利特 Supersil ODS2 (250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為乙腈-水(9∶1∶91)；流速為1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)238 nm；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量20 μL。

1.4.2溶液的制備 (1)梔子苷對(duì)照品溶液：精密稱定梔子苷對(duì)照品15.03 mg，加甲醇至50 mL量瓶中，稀釋至刻度，精密量取1 mL至10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。(2)琪素-25丸供試品溶液：取琪素-25丸粉末約2.57 g，精密稱定，加甲醇25 mL，稱重，超聲20 min，冷卻至室溫，補(bǔ)重，濾過(guò)，取續(xù)濾液10 mL，加甲醇，定容至25 mL棕色容量瓶中，搖勻，即得。(3)陰性對(duì)照溶液：取陰性樣品(除梔子)約4.94 g，精密稱定，研細(xì)混勻，加甲醇25 mL，稱重，超聲20 min，冷卻至室溫，補(bǔ)重，濾過(guò)，取續(xù)濾液10 mL，加甲醇，定容至25 mL棕色容量瓶中，搖勻，即得。

1.4.3提取效率考察 采用單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)取樣量和提取時(shí)間對(duì)提取效率的影響進(jìn)行考察。

1.4.4專屬性 按照“1.4.1”項(xiàng)下，分別精密吸取“1.4.2”項(xiàng)下配制的3種溶液各20 μL，進(jìn)樣分析。

1.4.5線性關(guān)系考察 精密量取“1.4.2(1)”項(xiàng)下對(duì)照品溶液0.58 mL、0.69 mL、0.81 mL、0.92 mL、1.04 mL、1.16 mL和1.27 mL，加甲醇，定容到5 mL容量瓶中，搖勻。按照“1.4.1”項(xiàng)下進(jìn)樣分析，記錄峰面積，進(jìn)行回歸分析。

1.4.6精密度試驗(yàn) 取“1.4.2(1)”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，按照“1.4.1”項(xiàng)下，連續(xù)進(jìn)樣6針進(jìn)行分析。

1.4.7穩(wěn)定性試驗(yàn) 取批號(hào)為2007071制備的同一份供試品溶液，分別在室溫下，放置一定時(shí)間(0 h、4 h、8 h、12 h、24 h)，按照“1.4.1”項(xiàng)下進(jìn)行分析。

1.4.8重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)(2007071 )樣品,每份約2.57 g(共6份)，按照“1.4.2(2)”項(xiàng)下制備，并按照“1.4.1”項(xiàng)下進(jìn)行分析。

1.4.9加樣回收率試驗(yàn) (1)梔子苷對(duì)照品溶液的制備：精密稱定梔子苷對(duì)照品21.36 mg，加甲醇至50 mL量瓶中，稀釋至刻度，即得。(2)供試品溶液的制備：取同一批號(hào)(2007071 )樣品9份，每份約1.29 g，分為3組，每組依次加入50 %、100 %、150%供試品含量的梔子苷對(duì)照品溶液(對(duì)應(yīng)體積為2 mL、4 mL和6 mL)，按照“1.4.2(2)”項(xiàng)下制備，并按照“1.4.1”項(xiàng)下進(jìn)行分析。

1.4.10耐用性試驗(yàn) 取批號(hào)為2007071的供試品約2.57 g，精密稱定，按照“1.4.2(2)”項(xiàng)下制備，并更換其他廠家色譜柱，按照“1.4.1”項(xiàng)下進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1TLC法定性鑒別結(jié)果

2.1.1梔子TLC鑒別 與對(duì)照品、對(duì)照藥材色譜相比，供試品溶液在對(duì)應(yīng)位置上顯示相同顏色的清晰斑點(diǎn)，陰性對(duì)照溶液無(wú)干擾。見(jiàn)圖1。

圖1 琪素-25丸中梔子的TLC圖譜

2.1.2苘麻子TLC鑒別 與苘麻子對(duì)照藥材色譜相比，供試品溶液在對(duì)應(yīng)位置上顯示相同顏色的清晰熒光斑點(diǎn)，陰性對(duì)照溶液無(wú)干擾。見(jiàn)圖2。

圖2 琪素-25丸中苘麻子的TLC圖譜

2.2琪素-25丸中梔子苷含量測(cè)定結(jié)果

2.2.1提取效率考察 (1)取樣量的考察：取樣量為2.57 g時(shí)，梔子苷含量最高，故取樣量定為2.57 g。(2)提取時(shí)間的考察：提取時(shí)間為20 min時(shí)，梔子苷含量最高，故提取時(shí)間定為20 min。見(jiàn)表1和表2。

表1 取樣量考察測(cè)定結(jié)果

表2 提取時(shí)間考察測(cè)定結(jié)果

2.2.2專屬性 在供試品色譜中，梔子苷分離度大于1.5；在陰性對(duì)照溶液色譜圖中，梔子苷處未有吸收，說(shuō)明其它組分對(duì)琪素-25丸中梔子苷的測(cè)定沒(méi)有干擾，專屬性好。見(jiàn)圖3～圖5。

圖3 梔子苷對(duì)照品溶液色譜圖

圖4 供試品溶液色譜圖

圖5 陰性對(duì)照溶液色譜圖

2.2.3線性關(guān)系考察 梔子苷峰面積在34.73～76.40 μg/mL范圍內(nèi)呈線性，回歸方程為y=30762x-92915(R2=0.9991)。見(jiàn)表3。

表3 梔子苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)值表

2.2.4精密度試驗(yàn) 經(jīng)6次測(cè)定，梔子苷對(duì)照品峰面積RSD為1.2 %(n=6)，表明該儀器精密度良好。見(jiàn)表4。

表4 精密度峰面積

2.2.5穩(wěn)定性試驗(yàn) 不同放置時(shí)間測(cè)定樣品中梔子苷的平均峰面積RSD為2.0 %，表明琪素-25丸中梔子苷放置24 h后穩(wěn)定性良好。見(jiàn)表5。

表5 不同時(shí)間測(cè)定樣品中梔子苷的峰面積

2.2.6重復(fù)性試驗(yàn) 梔子苷平均含量為0.134 %，RSD為1.7 %，表明樣品重現(xiàn)性良好。見(jiàn)表6。

表6 梔子苷重現(xiàn)性試驗(yàn)結(jié)果

2.2.7加樣回收率試驗(yàn) 樣品中梔子苷的平均回收率為104.7 %，RSD為1.7 %。見(jiàn)表7。

表7 加樣回收率測(cè)定結(jié)果

2.2.8耐用性試驗(yàn) 使用三根不同廠家、不同型號(hào)的柱子進(jìn)行分析，樣品中梔子苷的平均含量為0.129 %，RSD為1.2 %。見(jiàn)表8。

表8 不同色譜柱的耐用試驗(yàn)

2.2.9樣品及藥材含量測(cè)定 取兩批(批號(hào)：2007071、2007072)琪素-25樣品、模擬樣各2份，每份約2.57 g，精密稱定；取兩批梔子藥材(批號(hào)：1909002、1909003)，各2份，每份約0.1 g，精密稱定，按照“1.4.2(2)”項(xiàng)下制備，并按照“1.4.1”項(xiàng)下進(jìn)行分析。經(jīng)測(cè)定，兩批樣品及模擬樣中梔子苷平均含量分別為0.135 %、0.136 %、0.146 %和0.146 %；藥材中梔子苷平均含量分別為4.50 %和4.60 %。見(jiàn)表9和表10。

表9 樣品含量測(cè)定結(jié)果

表10 梔子藥材中梔子苷含量測(cè)定結(jié)果

結(jié)合表9和表10計(jì)算本品含量限值。按理論值折算，模擬樣品應(yīng)含梔子苷0.177 %，轉(zhuǎn)移率=[(0.146+0.146)/2]/0.177×100 %=82.49 %。《中國(guó)藥典》2020年版[3]一部“梔子”項(xiàng)下規(guī)定：含梔子苷不得少于1.8 %。含量低限=20/514×1.8 %×82.49×0.01=0.0578 %。考慮到藥材之間質(zhì)量差異的影響，下浮10 %，暫定本品含梔子苷(C17H24O10)不得少于0.0520 %。

3 討論

3.1鑒別及定量分析中目標(biāo)成分的選擇 琪素-25丸制劑中驢血粉為君藥，苘麻子為臣藥，梔子為佐藥。驢血粉屬于動(dòng)物藥，其質(zhì)量難以控制，故選取臣藥和佐藥進(jìn)行研究。苘麻子具有清熱解毒、利濕和退翳的功效。梔子具有清熱、瀉火和涼血的功效，其中梔子苷具有較強(qiáng)的抗炎鎮(zhèn)痛作用[4]。因《中國(guó)藥典》2020年版[3]一部中無(wú)苘麻子含量測(cè)定參照方法，所以，選擇對(duì)苘麻子和梔子進(jìn)行薄層鑒別，對(duì)梔子中梔子苷進(jìn)行含量測(cè)定。

3.2檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 采用二極管陣列檢測(cè)器對(duì)琪素-25丸中梔子苷在200～400 nm范圍內(nèi)掃描，梔子苷在240 nm處有最大吸收。參照《中國(guó)藥典》2020年版[3]及文獻(xiàn)[5]，故選擇238 nm作為實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.3提取方法及取樣量的選擇 參照《中國(guó)藥典》2020年版[3]一部“梔子”項(xiàng)下，選擇甲醇作為提取溶劑，提取方式采用超聲提取技術(shù)。從節(jié)約能源、提高提取效率方面考慮[6]，本實(shí)驗(yàn)考察了取樣量(2.37 g、2.57 g和2.77 g)和提取時(shí)間(10 min、20 min和30 min)對(duì)梔子苷提取效率的影響。結(jié)果表明，取樣量為2.57 g，最佳提取時(shí)間為20 min。

3.4流動(dòng)相的選擇 《中國(guó)藥典》2020年版[3]一部中采用乙腈-水(15∶85)為流動(dòng)相對(duì)梔子苷進(jìn)行含量測(cè)定，在此條件下，琪素-25丸中梔子苷峰與其他雜峰分離效果不好。查閱文獻(xiàn)[7-10]，調(diào)整流動(dòng)相，嘗試乙腈-水(13∶87)和乙腈-水(10∶90)等發(fā)現(xiàn)分離度效果不理想，在乙腈-水(9∶91)時(shí)，梔子苷分離效果理想，保持良好峰形，因此，最終選擇乙腈-水(9∶91)作為本研究的流動(dòng)相。

綜上所述，本研究建立了蒙藥制劑琪素-25丸中梔子和苘麻子TLC定性鑒別方法，與對(duì)照品或?qū)φ账幉纳V相比，樣品溶液在對(duì)應(yīng)位置上顯示相同顏色的、獨(dú)特的清晰斑點(diǎn)或熒光斑點(diǎn)，且陰性溶液對(duì)樣品無(wú)影響，專屬性強(qiáng)。同時(shí)，使用HPLC法建立了琪素-25丸中梔子苷的含量測(cè)定方法，該方法簡(jiǎn)單，穩(wěn)定，梔子苷峰面積在34.73～76.40 μg/mL范圍內(nèi)呈線性，且重現(xiàn)性好。本研究建立的蒙藥制劑琪素-25丸TLC定性鑒別和HPLC含量測(cè)定的方法可用于建立蒙藥制劑琪素-25丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，并為蒙藥制劑琪素-25丸質(zhì)量控制提供依據(jù)。