王 亮, 韋繼光, 葛春峰, 於 虹, 姜燕琴, 楊曙方, 曾其龍, 田亮亮,①
〔1. 江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所(南京中山植物園), 江蘇 南京 210014; 2. 浙江藍(lán)美技術(shù)股份有限公司, 浙江 紹興 312000〕
藍(lán)莓(Vacciniumspp.)為杜鵑花科(Ericaceae)越橘屬(VacciniumLinn.)落葉灌木,其果實(shí)中花青素含量較高,具有保護(hù)視力和增強(qiáng)人體免疫力等功效[1-3]。藍(lán)莓原產(chǎn)北美,雜交育種是其品種培育的主要手段。目前,科研工作者已經(jīng)選育出一批品質(zhì)優(yōu)良的品種[4-6],并從生理特性[7]和化學(xué)成分[8]等方面對(duì)藍(lán)莓進(jìn)行了研究,促進(jìn)了藍(lán)莓產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。但是,目前絕大多數(shù)藍(lán)莓品種對(duì)中國(guó)的黏重土壤和夏季高溫適應(yīng)性較差,不能達(dá)到高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn);且國(guó)內(nèi)現(xiàn)有引進(jìn)栽培品種的遺傳多樣性較低、遺傳基礎(chǔ)較狹窄[9-11],應(yīng)該加強(qiáng)野生資源在育種中的利用。中國(guó)越橘屬種質(zhì)資源豐富,特有種有51種[12],但缺少可以直接利用的品種,特別是現(xiàn)有栽培品種所屬的藍(lán)漿果組(Sect.Cyanococcus)在中國(guó)沒(méi)有分布。因此,除了引進(jìn)野生資源,在現(xiàn)有栽培品種中發(fā)掘遺傳背景相對(duì)復(fù)雜的品種為育種材料,開(kāi)展針對(duì)中國(guó)生態(tài)特點(diǎn)的育種工作對(duì)中國(guó)藍(lán)莓的產(chǎn)業(yè)化具有重要意義。
藍(lán)莓品種‘藍(lán)美1號(hào)’(Vacciniumcorymbosum‘Lanmei 1’)是目前國(guó)內(nèi)利用引進(jìn)育種材料選育出的惟一一個(gè)國(guó)家級(jí)林木良種(編號(hào):國(guó)R-ETS-VC-006-2018),該品種源自20世紀(jì)90年代引入的美國(guó)藍(lán)莓育種體系的育種資源,是復(fù)雜的種間雜交實(shí)生子代,除了藍(lán)莓品種常含有的遺傳基礎(chǔ)外,還含有常綠越橘(V.darrowiiCamp)和依利越橘(V.elliottiiChapm.)的遺傳基礎(chǔ)[13]。該品種既繼承了野生越橘抗旱、耐熱和耐瘠薄的優(yōu)點(diǎn),對(duì)中國(guó)長(zhǎng)江流域黏重土壤和夏季高溫有較好的適應(yīng)性,又有野生越橘的高級(jí)保健功能,果實(shí)花青素含量高[14],是良好的加工品種。因此,充分開(kāi)發(fā)利用‘藍(lán)美1號(hào)’的抗性基因資源,對(duì)中國(guó)藍(lán)莓種質(zhì)資源創(chuàng)新具有重要意義。
SSR(simple sequence repeats)標(biāo)記是一種以特異引物PCR為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù),具有良好的保守性、多態(tài)性高、共顯性等優(yōu)點(diǎn),且實(shí)驗(yàn)過(guò)程中所需樣本量少、分辨率高、可重復(fù)性強(qiáng)[15]。目前,SSR標(biāo)記在藍(lán)莓遺傳多樣性、親緣關(guān)系、指紋圖譜構(gòu)建以及群體遺傳結(jié)構(gòu)等方面得到廣泛應(yīng)用,如:崔建民等[9]利用22對(duì)SSR引物,明確了93份藍(lán)莓材料的親緣關(guān)系,發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有栽培品種遺傳多樣性較低,遺傳基礎(chǔ)狹窄;劉有春等[10]采用EST-SSR標(biāo)記對(duì)越橘屬84份材料的群體遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)大多數(shù)藍(lán)莓品種的遺傳背景較單一;徐國(guó)輝等[16]利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)鑒定了藍(lán)莓優(yōu)良品系的父本,并通過(guò)2對(duì)引物構(gòu)建了8個(gè)藍(lán)莓優(yōu)良品系的指紋圖譜;張春紅等[17]利用25對(duì)SSR引物對(duì)66個(gè)藍(lán)莓品種進(jìn)行了分析,揭示了不同栽培類(lèi)型藍(lán)莓種質(zhì)的差異。
本研究以‘藍(lán)美1號(hào)’217個(gè)自由授粉子代為研究材料,采用SSR分子標(biāo)記分析自由授粉子代的遺傳多樣性和群體遺傳結(jié)構(gòu),以期為‘藍(lán)美1號(hào)’自由授粉子代選育、評(píng)價(jià)及育種工作提供參考。
供試材料為‘藍(lán)美1號(hào)’217個(gè)自由授粉子代和26個(gè)現(xiàn)有藍(lán)莓栽培品種,共243份材料?!{(lán)美1號(hào)’217個(gè)自由授粉子代由浙江省諸暨市青山村青山基地苗圃(東經(jīng)120.07°、北緯29.65°,海拔103 m)中‘藍(lán)美1號(hào)’自由授粉獲得的種實(shí)經(jīng)播種育苗后得到,子代種植于青山基地苗圃,苗圃周?chē)鸁o(wú)其他藍(lán)莓品種存在。26個(gè)品種包括:‘粉藍(lán)’(‘Powderblue’)、‘巨豐’(‘Delite’)、‘園藍(lán)’(‘Gardenblue’)、‘精華’(‘Choice’)和‘奧斯汀’(‘Austin’)5個(gè)兔眼藍(lán)莓品種;‘綠寶石’(‘Emerald’)、‘春高’(‘Springhigh’)、‘奧尼爾’(‘O’Neal’)、‘陽(yáng)光藍(lán)’(‘Sunshine Blue’)、‘薄霧’(‘Misty’)、‘夏普藍(lán)’(‘Sharpblue’)、‘明星’(‘Star’)、‘珠寶’(‘Jewel’)和‘庫(kù)帕’(‘Cooper’)9個(gè)南高叢藍(lán)莓品種;‘日出’(‘Sunrise’)、‘藍(lán)金’(‘Bluegold’)、‘康維爾’(‘Coville’)、‘公爵’(‘Duke’)、‘伯克利’(‘Berkeley’)、‘齊佩瓦’(‘Chippewa’)、‘布里吉塔’(‘Brigitta’)、‘達(dá)柔’(‘Darrow’)、‘錢(qián)德勒’(‘Chandler’)、‘萊格西’(‘Legacy’)、‘晚藍(lán)’(‘Lateblue’)和‘藍(lán)豐’(‘Bluecrop’)12個(gè)北高叢藍(lán)莓品種。26個(gè)品種均種植于江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所苗圃(東經(jīng)118.84°、北緯32.06°,海拔30 m)。于2020年5月,采集217個(gè)自由授粉子代單株和26個(gè)品種新梢頂端剛長(zhǎng)出的嫩葉,每株采集3~5枚,置于-80 ℃冰箱保存、備用。
1.2.1 DNA提取 用AG501C新型植物基因組DNA提取試劑盒(上海浦迪生物科技有限公司)提取217個(gè)自由授粉子代和26個(gè)品種植株葉片的基因組DNA,用質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量,用Berthold Colibri超微量分光光度計(jì)(德國(guó)Berthold Technology公司)測(cè)定DNA的濃度和純度,置于-20 ℃冰箱中保存、備用。
1.2.2 SSR引物的擴(kuò)增篩選 用TC1000-G PCR儀(美國(guó)Scilogex公司)進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。PCR擴(kuò)增體系總體積10.0 μL,包括50 ng·μL-1DNA 1.0 μL、2×3GTaqMaster Mix for PAGE (Red Dye)混合液5.0 μL、100 μmol·L-1上游和下游引物各0.1 μL以及ddH2O 3.8 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s、56 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s,共35個(gè)循環(huán);最后72 ℃延伸10 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后,在質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳分離,用質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)0.2%AgNO3染色后置于燈箱上拍照。從200對(duì)SSR引物中,篩選出23對(duì)多態(tài)性好的引物用于供試材料基因組DNA的PCR擴(kuò)增,根據(jù)條帶擴(kuò)增情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
1.3.1 遺傳多樣性分析 記錄引物的多態(tài)性位點(diǎn),某一位點(diǎn)上有條帶記為“1”,無(wú)條帶記為“0”,使用EXCEL 2013軟件構(gòu)建“1”“0”矩陣?;诙鄳B(tài)性條帶,使用POPGENE軟件計(jì)算Nei’s遺傳多樣性指數(shù)和Shannon’s多態(tài)性信息指數(shù);使用PIC-CALC軟件計(jì)算各引物的多態(tài)性信息含量指數(shù)(PIC),PIC值越高,表明SSR分子標(biāo)記的多態(tài)性越豐富,PIC>0.50表示引物有高度多態(tài)性[18,19];使用NTSYS-pc Ver.2.10e軟件進(jìn)行UPGMA聚類(lèi)分析。
1.3.2 群體遺傳結(jié)構(gòu)分析 參照黃宇寧[20]的方法,使用STRUCTURE 2.3.4軟件對(duì)217個(gè)自由授粉子代進(jìn)行群體遺傳結(jié)構(gòu)分析,分組數(shù)(K)設(shè)置為2~10,每個(gè)K值重復(fù)運(yùn)算10次,100 000次馬爾科夫鏈蒙特卡羅(MC)重復(fù)之后進(jìn)行100 000次burn-in,使用STRUCTURE Harvester在線工具[21]對(duì)獲得的結(jié)果進(jìn)行分析。參照Evanno等[22]的方法,用ΔK確定合適的K值。ΔK為|L″(K)|的平均數(shù)除以L′(K)的標(biāo)準(zhǔn)差,其中L′(K)=L(K)-L(K-1),|L″(K)|=|L′(K+1)-L′(K)|,L(K)是STRUCTURE 2.3.4運(yùn)行結(jié)果中的最大似然值對(duì)數(shù)lnP(K)。使用CLUMPP 2.0軟件[23]將運(yùn)算結(jié)果合并,繪制群體遺傳結(jié)構(gòu)分析圖。計(jì)算各子代相應(yīng)的Qi值(各子代歸入某一亞群的概率,i為子代所屬亞群),對(duì)子代的遺傳背景進(jìn)行分析,其中,Qi≥0.6表示遺傳來(lái)源單一,Qi<0.6表示具有混合遺傳來(lái)源[24,25]。
基于SSR引物擴(kuò)增結(jié)果,‘藍(lán)美1號(hào)’217個(gè)自由授粉子代和26個(gè)藍(lán)莓品種的遺傳多樣性分析結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果顯示:23對(duì)引物在243個(gè)供試材料中共檢測(cè)出113個(gè)等位基因,等位基因數(shù)均值為4.9,其中,引物FLS-3和GVC-C179_213擴(kuò)增出的等位基因數(shù)最多(8),引物CHI-2、KAN-1007、KAN-2133、KAN-453和KAN-628擴(kuò)增出的等位基因數(shù)最少(3);有效等位基因數(shù)(Ne)為2.6~6.7,均值為4.4;多態(tài)性信息含量指數(shù)(PIC)為0.507 5~0.833 0,均值為0.686 6。23對(duì)引物的PIC值均在0.5以上,表明篩選出的SSR引物的多態(tài)性高,其中引物FLS-3、GVC-C179_213、GVC-C66a_306、KAN-2584和PrO32475744b的PIC值均高于0.8。
217個(gè)自由授粉子代的Nei’s遺傳多樣性指數(shù)(H)為0.591 1~0.850 9,均值為0.733 4;Shannon’s 多態(tài)性信息指數(shù)(I)為0.968 5~1.978 9,均值為1.439 4。26個(gè)品種的H值為0.195 8~0.813 0,均值為0.479 1;I值為0.346 5~1.728 0,均值為0.851 8。217個(gè)自由授粉子代的H和I值均大于26個(gè)品種,表明自由授粉子代群體存在豐富的遺傳多樣性,且遺傳多樣性?xún)?yōu)于現(xiàn)有栽培品種。
表1 供試SSR引物的擴(kuò)增結(jié)果及‘藍(lán)美1號(hào)’217個(gè)自由授粉子代和26個(gè)藍(lán)莓品種的遺傳多樣性分析1)
根據(jù)各材料間的遺傳相似系數(shù),對(duì)‘藍(lán)美1號(hào)’217個(gè)自由授粉子代和26個(gè)藍(lán)莓品種進(jìn)行聚類(lèi)分析,使用1~217對(duì)217個(gè)自由授粉子代進(jìn)行編號(hào),結(jié)果見(jiàn)圖1。結(jié)果顯示:243個(gè)供試材料的遺傳相似系數(shù)為0.58~0.99,在遺傳相似系數(shù)0.58處,217個(gè)自由授粉子代與26個(gè)品種被明顯分為2大類(lèi),表明‘藍(lán)美1號(hào)’自由授粉子代同現(xiàn)有藍(lán)莓栽培品種親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。217個(gè)自由授粉子代的遺傳相似系數(shù)為0.70~0.99,相似程度較高。217個(gè)自由授粉子代可聚為5個(gè)類(lèi)群,其中,除編號(hào)1、15、49、50、56、59、65、113、124和168外,其余207個(gè)子代分為3類(lèi):編號(hào)2、3、9、10、16、26、27、29、34、37、38、41、61、62、64、67、69、71、73、75、77、83、89、93、94、97、99、105、107、109、112、114、115、119、128、133、143、155、160、162、170、172、181、186、193、194、196、207、208、209、210、213和214共53個(gè)子代聚為類(lèi)群Ⅱ,編號(hào)11、13、21、40、118、122、123、129、130、135、139、140、141、142、145、146、148、149、150、151、152、154、159、165、166、175、177、178、179、182、183和211共32個(gè)子代聚為類(lèi)群Ⅳ,其余122個(gè)子代聚為類(lèi)群Ⅰ。
用STRUCTURE 2.3.4軟件分析‘藍(lán)美1號(hào)’217個(gè)自由授粉子代的群體遺傳結(jié)構(gòu),結(jié)果(圖2-A)顯示:當(dāng)K=4時(shí),ΔK出現(xiàn)峰值,此時(shí)各亞群內(nèi)相似性最大;且K=4時(shí),217個(gè)自由授粉子代的群體遺傳結(jié)構(gòu)聚類(lèi)清晰(圖2-B),表明最適亞群數(shù)為4,217個(gè)自由授粉子代可劃分為4個(gè)亞群。
Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ: 217個(gè)子代217 progenies; Ⅵ: 26個(gè)品種26 cultivars.
圖2 ‘藍(lán)美1號(hào)’217個(gè)自由授粉子代的分組分析(A)和K=4時(shí)的群體遺傳結(jié)構(gòu)(B)
基于上述結(jié)果,繪制各子代歸入4個(gè)亞群的概率(Qi)圖,結(jié)果(圖3)顯示:每個(gè)子代有4個(gè)Qi值,以最大值為分類(lèi)依據(jù),可得出各亞群中包含子代的編號(hào)及數(shù)量。亞群Ⅰ包括編號(hào)21、113、122、130、135、139、140、141、142、145、146、148、149、150、151、152、154、159、160、165、166、175、177、182、183和211共26個(gè)子代。亞群Ⅱ包括編號(hào)1、7、8、11、12、13、14、17、18、25、30、31、32、35、39、48、49、51、52、56、59、65、72、80、81、82、85、86、89、91、100、103、106、110、111、120、124、125、127、129、132、134、137、143、153、156、164、171、173、174、176、178、180、188、189、190、199、200、201、202、204、205和216共63個(gè)子代。亞群Ⅲ包括編號(hào)2、3、9、10、15、16、26、27、29、34、37、41、50、53、60、61、62、64、67、69、71、73、75、83、92、93、94、97、99、105、107、109、114、115、116、118、119、128、133、155、162、170、172、186、193、194、196、207、208、209、210、212、213、214和217共55個(gè)子代。亞群Ⅳ包括編號(hào)4、5、6、19、20、22、23、24、28、33、36、38、40、42、43、44、45、46、47、54、55、57、58、63、66、68、70、74、76、77、78、79、84、87、88、90、95、96、98、101、102、104、108、112、117、121、123、126、131、136、138、144、147、157、158、161、163、167、168、169、179、181、184、185、187、191、192、195、197、198、203、206和215共73個(gè)子代。
比較各子代歸入所屬亞群的概率(表2)發(fā)現(xiàn),‘藍(lán)美1號(hào)’217個(gè)自由授粉子代中,192個(gè)自由授粉子代的Qi值大于0.6,占總數(shù)的88.5%。亞群Ⅰ中26個(gè)自由授粉子代Qi值均在0.6以上;亞群Ⅱ中有11個(gè)自由授粉子代(編號(hào)1、32、39、49、51、129、143、164、176、188和200)Qi值在0.6以下,占亞群Ⅱ子代數(shù)的17.5%;亞群Ⅲ中有3個(gè)自由授粉子代(編號(hào)15、50和212)Qi值在0.6以下,占亞群Ⅲ子代數(shù)的5.4%;亞群Ⅳ中有11個(gè)自由授粉子代(編號(hào)4、23、40、77、87、90、98、123、138、168和169)Qi值在0.6以下,占亞群Ⅳ子代數(shù)的15.1%。表明亞群Ⅰ子代遺傳來(lái)源單一,遺傳背景不復(fù)雜,而亞群Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ中雖具有混合遺傳來(lái)源的子代,但具有混合遺傳來(lái)源的子代占比不高,亞群內(nèi)子代相似程度高。
: 亞群Ⅰ Subgroup Ⅰ; : 亞群Ⅱ Subgroup Ⅱ; : 亞群Ⅲ Subgroup Ⅲ; : 亞群Ⅳ Subgroup Ⅳ.
表2 ‘藍(lán)美1號(hào)’217個(gè)自由授粉子代歸入所屬亞群的概率(Qi)
比較UPGMA聚類(lèi)分析和STRUCTURE分析的劃分結(jié)果發(fā)現(xiàn),2種劃分結(jié)果有相似之處,如編號(hào)21、122、130、135、139、140、141、142、145、146、148、149、150、151、152、154、159、165、166、175、177、182、183和211在STRUCTURE分析中劃分到亞群Ⅰ,在UPGMA聚類(lèi)分析中聚為類(lèi)群Ⅳ;STRUCTURE分析中劃分到亞群Ⅲ中的子代在UPGMA聚類(lèi)分析中大部分被聚為類(lèi)群Ⅱ。
用POPGENE軟件比較2種方法劃分的亞群內(nèi)子代遺傳多樣性參數(shù),結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果顯示:STRUCTURE分析中得到的亞群內(nèi)子代Nei’s遺傳多樣性指數(shù)和Shannon’s多態(tài)性信息指數(shù)的均值和標(biāo)準(zhǔn)差均低于UPGMA聚類(lèi)分析,表明STRUCTURE分析劃分亞群內(nèi)子代遺傳多樣性水平低、相似程度高,STRUCTURE分析的分群效果優(yōu)于UPGMA聚類(lèi)分析。
表 3 2種分類(lèi)方法中各群體內(nèi)子代遺傳多樣性分析
遺傳標(biāo)記在自然群體中的等位基因數(shù)越多,該基因座的多態(tài)性越高,而當(dāng)多態(tài)性位點(diǎn)大于等于70個(gè)時(shí),得到的遺傳信息較為可靠[26]。此外,多態(tài)性信息含量指數(shù)(PIC)越高,SSR分子標(biāo)記的多態(tài)性越豐富,更利于區(qū)分供試材料。本研究中共檢測(cè)出113個(gè)多態(tài)性位點(diǎn),引物的PIC均值達(dá)0.686 6,可見(jiàn)試驗(yàn)選用的SSR引物能為本研究提供可靠的遺傳信息?!{(lán)美1號(hào)’217個(gè)自由授粉子代與26個(gè)藍(lán)莓品種在遺傳相似系數(shù)0.58處分為2大類(lèi),表明‘藍(lán)美1號(hào)’自由授粉子代和現(xiàn)有藍(lán)莓栽培品種的親緣關(guān)系較遠(yuǎn),與現(xiàn)有結(jié)論相符,即‘藍(lán)美1號(hào)’除通常藍(lán)莓品種含有的遺傳基礎(chǔ)外,還含有來(lái)自野生種的遺傳基礎(chǔ)。
遺傳多樣性是物種遺傳潛力和適應(yīng)環(huán)境變化能力的重要指標(biāo),可從基因水平上反映出群體的變異性,對(duì)親本選配及優(yōu)良子代初步篩選具有重要的指導(dǎo)意義[27]。本研究中,‘藍(lán)美1號(hào)’217個(gè)自由授粉子代具有較高水平的遺傳多樣性,Nei’s遺傳多樣性指數(shù)均值為0.733 4,Shannon’s多態(tài)性信息指數(shù)均值為1.439 4,而26個(gè)藍(lán)莓品種的遺傳多樣性較低,與崔建民等[9]的研究結(jié)果相一致?,F(xiàn)有栽培品種遺傳多樣性較低,遺傳基礎(chǔ)狹窄,而‘藍(lán)美1號(hào)’自由授粉子代具有較高水平的遺傳多樣性,還含有野生種的遺傳基礎(chǔ),是非常好的育種材料,通過(guò)后期選育,篩選出優(yōu)良單株,可以作為國(guó)內(nèi)藍(lán)莓品種改良的優(yōu)質(zhì)基因庫(kù)。
在品種遺傳多樣性、品種進(jìn)化和品種標(biāo)記性狀關(guān)聯(lián)分析等研究中,品種資源的群體遺傳結(jié)構(gòu)研究是一項(xiàng)最基礎(chǔ)的工作[28]。已有研究中劃分群體遺傳結(jié)構(gòu)的方法主要為STRUCTURE分析和UPGMA聚類(lèi)分析[29,30]。本研究發(fā)現(xiàn),相較于UPGMA聚類(lèi)分析,STRUCTURE分析中亞群內(nèi)子代間遺傳相似性更高,分類(lèi)效果更好,利于解決群體分類(lèi)對(duì)后期關(guān)聯(lián)分析的影響,降低偽關(guān)聯(lián)出現(xiàn)的概率。‘藍(lán)美1號(hào)’192個(gè)自由授粉子代的Qi值大于0.6,可見(jiàn)供試的絕大多數(shù)子代遺傳來(lái)源單一,且亞群內(nèi)子代相似程度高,有利于后期優(yōu)良單株篩選。
綜上所述,現(xiàn)有藍(lán)莓栽培品種遺傳多樣性較低,遺傳基礎(chǔ)狹窄,供試‘藍(lán)美1號(hào)’自由授粉子代與現(xiàn)有藍(lán)莓栽培品種親緣關(guān)系較遠(yuǎn),含有野生種的遺傳基礎(chǔ),遺傳多樣性?xún)?yōu)于現(xiàn)有栽培品種,有利于優(yōu)良單株的篩選。進(jìn)一步研究‘藍(lán)美1號(hào)’自由授粉子代,從中篩選優(yōu)良單株,挖掘‘藍(lán)美1號(hào)’的抗性基因資源,對(duì)實(shí)現(xiàn)藍(lán)莓種質(zhì)創(chuàng)新和遺傳基礎(chǔ)拓寬具有重要意義。