何英姿 陳 琳 溫 晶 陳 巍

1.海南省海口市婦幼保健院(571100)；2.海南省婦女兒童醫(yī)學(xué)中心

卵巢功能異常包括卵巢功能減退(DOS)和卵巢早衰(POF)。卵泡的發(fā)育和成熟取決于激素與受體的相互作用，如卵泡刺激素(FSH)及其受體(FSHR)、促黃體生成素(LH)及其受體(LHR)、抗苗勒管激素(AMH)及其Ⅱ型受體(AMHRⅡ)的相互作用等[1-3]。受體的任何功能和結(jié)構(gòu)改變均可能影響受體與其配體間連接和下游信號傳遞，導(dǎo)致卵巢儲備減少[4-5]。目前不同卵巢儲備女性AMHRⅡ、FSHR、LHR表達(dá)情況尚不清楚，本研究對此進(jìn)行觀察，為卵巢功能異常的發(fā)病機(jī)制研究提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象

采用前瞻性研究方法選取2016年12月30日-2019年5月30日在海南省婦女兒童醫(yī)學(xué)中心行體外受精-胚胎移植的女性。納入標(biāo)準(zhǔn)：均行體外受精-胚胎移植；取卵過程中獲得單個優(yōu)勢卵泡液及剩余卵泡液；年齡≥20歲；本人及家屬同意并簽署知情同意書；依從性可。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并腫瘤、自身免疫性疾病、凝血功能異常、甲狀腺疾病、腎上腺功能異常、泌乳素水平異常及糖尿??；合并腎臟、肝臟及心功能不全；納入研究前服用激素類或避孕類藥物；卵巢手術(shù)史者；吸煙者。本研究經(jīng)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 分組標(biāo)準(zhǔn)

卵巢功能正常：月經(jīng)規(guī)律且性激素水平在正常范圍，僅因輸卵管因素行體外受精-胚胎移植，影像學(xué)檢查排除多囊聲像變化。DOS：月經(jīng)規(guī)律或稀發(fā)，F(xiàn)SH為12～40 IU/L，排除POF(POF為FSH>40 IU/L，雌二醇(E2)<73 pmol/L，閉經(jīng)時間>6個月，年齡<40歲)。

1.3 體外受精-胚胎移植

使用促排卵藥物后監(jiān)測卵泡發(fā)育情況，超過2個卵泡直徑>1.7cm時注射250μg重組人絨毛膜促性腺激素。36～38 h后在超聲引導(dǎo)下取卵，胚胎培養(yǎng)72 h后行1～2個胚胎移植。

1.4 檢測方法

1.4.1血清性激素均于重組人絨毛膜促性腺激素注射日取患者外周靜脈血，F(xiàn)SH、AMH、LH、E2、孕酮(P)均由天津市中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科檢測。

1.4.2RNA于取卵日獲取卵泡液及卵泡顆粒細(xì)胞，采用qRT-PCR法檢測AMHRⅡ、FSHR、LHR mRNA的相對表達(dá)量。使用Trizol法提取RNA，建立20 μl RNA多聚酶反應(yīng)體系。PCR擴(kuò)增及逆轉(zhuǎn)錄條件(取1μl 總RNA)：42℃反應(yīng)60 min，72℃反應(yīng)5 min；20 μl Real-time PCR反應(yīng)體系：2μl dNTP Mixture，1μl逆轉(zhuǎn)錄酶，0.5μl RNase inhibitor，反應(yīng)條件：95℃變性4 min，95℃變性45 sec，53℃復(fù)性45 sec，72℃延伸90 sec，72℃溫育10min，共30個循環(huán)。采用Thermo NANO 檢測RNA濃度，使用7500 Software v 2.06軟件分析數(shù)據(jù)，以β-actin為內(nèi)參計(jì)算相對表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 基礎(chǔ)資料及激素水平

共納入研究110例，根據(jù)卵巢功能分為卵巢功能正常組(40例)、DOS組(37例)、POF組(33例)。POF組年齡、體質(zhì)指數(shù)、FSH、LH高于卵巢功能正常組和DOS組，竇卵泡個數(shù)、獲卵個數(shù)、AMH、E2、P低于功能正常組和DOS組(P<0.05)。見表1。

表1 各組基礎(chǔ)資料及性激素水平比較

2.2 AMHRⅡ、FSHR、LHR表達(dá)情況

AMHRⅡ、FSHR、LHR相對表達(dá)量POF組最低、DOS組次之、卵巢功能正常組最高(均P<0.05)。見表2。

表2 各組AMHRⅡ、FSHR、LHR表達(dá)情況

2.3 不同卵巢儲備者AMHRⅡ、FSHR、LHR表達(dá)相關(guān)性分析

在功能正常組，F(xiàn)SHR與LHR、AMHRⅡ表達(dá)量均呈正相關(guān)(r=0.35、0.31，P<0.05)，LHR與AMHRⅡ表達(dá)量呈正相關(guān)(r=0.45，P<0.05)。在DOS組，F(xiàn)SHR與LHR、AMHRⅡ表達(dá)量呈正相關(guān)(r=0.35、0.31，P<0.05)，LHR與AMHRⅡ表達(dá)量無相關(guān)性(r=0.10，P>0.05)。在POF組，F(xiàn)SHR與AMHRⅡ表達(dá)量呈正相關(guān)(r=0.40，P<0.05)，與LHR表達(dá)量無相關(guān)性(r=0.08，P>0.05)，LHR與AMHRⅡ表達(dá)量無相關(guān)性(r=0.12，P>0.05)。

3 討論

POF是一種卵巢功能障礙疾病[6]。發(fā)病機(jī)制尚未完全了解。評估卵巢儲備能力對早期發(fā)現(xiàn)POF、預(yù)測生育能力和絕經(jīng)年齡有重要臨床意義。卵巢儲備減少通常被稱為卵泡和卵母細(xì)胞的數(shù)量或質(zhì)量下降，卵泡發(fā)生與顆粒細(xì)胞中表達(dá)的AMH、LH、FSH密切相關(guān)[7]。

FSHR改變可能降低FSHR與配體連接和信號傳遞，導(dǎo)致卵巢儲備減少。既往研究證實(shí)，F(xiàn)SHR基因多態(tài)性與卵巢儲備功能異常相關(guān)[8]。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)SH水平POF組最高，DOS組次之，功能正常組最低，提示卵巢儲備功能下降患者FSH水平升高[9]。而FSHR水平POF組最低、DOS組次之、功能正常組最高，提示卵巢儲備功能下降患者FSHR表達(dá)下調(diào)。既往研究[10]觀察POF患者FSHR功能缺陷。有研究在原發(fā)性和繼發(fā)性閉經(jīng)女性中鑒定出多種FSHR失活突變和多態(tài)性，提示卵巢儲備功能下降者FSHR存在失活和突變[11]。Cordts等[11]也觀察到POF組和DOS組FSHR表達(dá)下調(diào)，但差異不大，認(rèn)為可能與該研究病例數(shù)較少有關(guān)。

本研究中，POF組LH高于功能正常組和DOS組，AMH低于功能正常組和DOS組，且POF組AMHRⅡ、LHR相對表達(dá)量均低于DOS組和功能正常組，提示POF和DOS患者LH、AMH及相應(yīng)受體水平異常，隨著卵巢儲備能力降低，LH、AMH表達(dá)水平降低。有研究證實(shí)，LHR的表達(dá)與卵泡大小呈正相關(guān)[12]；還有研究證實(shí)，LHR受體降低可導(dǎo)致妊娠率降低，而增加可提高臨床妊娠率[13]。血清AMH水平可反應(yīng)卵巢功能[9]。AMH與AMHRⅡ結(jié)合后抑制核內(nèi)CYP19 mRNA表達(dá)，并降低細(xì)胞色素酶P450活性，導(dǎo)致雌激素分泌下調(diào)，抑制始基卵泡的募集[14]。

本研究相關(guān)性分析顯示，卵巢功能正常組FSHR與LHR、AMHRⅡ呈正相關(guān)，LHR與AMHRⅡ呈正相關(guān)，與既往研究相符[15]。在DOS組，F(xiàn)SHR與LHR、AMHRⅡ呈正相關(guān)；在POF組，F(xiàn)SHR與AMHRⅡ呈正相關(guān)，提示AMHRⅡ、LHR、FSHR改變可能參與了卵巢儲備下降的發(fā)生機(jī)制。既往研究也認(rèn)為，不同卵巢儲備女性顆粒細(xì)胞AMHRⅡ、LHR、FSHR表達(dá)差異較大，隨著卵泡數(shù)目及藥物反應(yīng)差異，細(xì)胞表面受體量存在顯著差異[15]。

綜上所述，不同卵巢儲備女性AMHRⅡ、FSHR、LHR表達(dá)量存在差異，可能與卵巢儲備異常的發(fā)生機(jī)制有關(guān)。